Biotecnologia Vegetal

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1 Biotecnologia Vegetal

2 Objetivos dos agricultores são: Aumentar a produtividade de determinadas culturas pela seleção de variedades que apresentem resistência a doenças e pragas; resistência a umidade e à seca; maior resposta ou independência a fertilizantes; tolerância a condições ambientais hostis, como solos ácidos e/ou salgados etc. Aumentar o valor de culturas de interesse sócio-econômico, selecionando características como maior conteúdo de óleo; maior valor nutritivo; maior facilidade de colheita e armazenagem; independência da proteção por produtos químicos.

3 Melhoramento convencional Até poucos anos atrás, a única maneira de alcançar estes objetivos era através dos métodos clássicos de cruzamentos, ou seja, da genética mendeliana. No entanto, estas estratégias levaram os rendimentos das culturas a uma situação estacionária, que não foi solucionada pelos métodos convencionais. Além disso, estes métodos não permitem ultrapassar as barreiras naturais de cruzamentos, e até que uma variedade com características novas possam ser lançadas no mercado, 5 a 15 anos se passam. Outra desvantagem do cruzamento clássico é o fato de que, além das qualidades desejáveis, qualidades indesejáveis são transferidas porque, invariavelmente, o melhorista é forçado a trabalhar com a informação genética inteira dos pais.

4 O desenvolvimento da biotecnologia pode ser dividido em 3 fases: 1. Introdução de características agronômicas: soja Roundup Ready, tolerante a glifosato, um ingrediente ativo do herbicida Roundup. Milho YieldGard, possui um gene que codifica para um proteína inseticida que ocorre naturalmente na bactéria B. thuringiensis e confere resistência a broca do milho, inseto que reduz sua produção de 6 a 20%. Batata Achat com resistência a vírus PVY(mosaico da batata) onde se conseguiu introduzir o gene da capa protéica do próprio vírus, onde a batata com esse gene mostra resistência ao vírus PVY. 2. Produção de culturas de melhor qualidade: melhoria de atributos do feijão como flatulência e flavor; propriedade de textura e emulsificação da soja, milho com alto teor de óleo e/ou proteína; introduzindo genes que alteram vias metabólicas como por exemplo a produção de gordura sólida ou semisólida sem ácidos graxos trans nas sementes oleaginosas.

5 O desenvolvimento da biotecnologia pode ser dividido em 3 fases: 3. Plantas como biofábricas: alimentos nutricionalmente fortificados e substituindo a adição de constituintes sintéticos aos alimentos. Óleo de canola rico em caroteno. Fornecer novos nutrientes nos grãos, como os fitoesteróis. Modulação de doenças.

6 Outros exemplos Arroz dourado: geneticamente modificado para expressar alto conteúdo de carotenoides. Três genes tirados do narcisosilvestre e da bactéria Erwinia sp foram introduzidos no arroz para produzir um grão amarelo, com altos níveis de β-caroteno, que é convertido em vitamina A no organismo.

7 Outros exemplos Colza (Arabidopsis thaliana) com folhas naturalmente artificiais onde se colocou um gene novo neste arbusto, que lhe deu a capacidade de produzir plástico conhecido pela sigla PHBV. Ele é feito dentro das células das folhas do vegetal. Elas depois são moídas e filtradas para se extrair o produto, que poderá substituir os atuais derivados de petróleo - com grande vantagem. Sua degradação é mais rápida, demora só alguns meses, enquanto os similares sintéticos permanecem até 100 anos poluindo a natureza. Genes que fabricam plásticos existem em várias bactérias. Foi delas que se tirou o DNA para colocar na colza.

8 Outros exemplos Argentina - batata, girassol e trigo; Brasil - alface, amendoim, batata, cana-de-açúcar, eucalipto e fumo; Chile - batata e pimentão; Colômbia - arroz e mandioca; Cuba - arroz, banana, batata, batata-doce, cana-deaçúcar e mandioca; México - milho; Peru - batata; Trindade - cacau; Venezuela - batata; Uruguai batata.

9 Fator estimulante de colônias de macrófagos granulócitos humanos (GM-CSF) Aplicações clínicas Acúmulo limitado a 0,02% do total de proteínas solúveis em plantas sob condições de campo Ainda inviável economicamente.

10 Ácido p-hidróxi-benzóico (phba) -Bioplástico Biopolímero (bioplástico); Até 7,3% do peso seco das folhas; Sem anormalidades no crescimento e desenvolvimento.

11 Poli-3-hidroxibutirato (PHB) Produto biodegradável; 1,88% do peso seco das folhas; Sem prejuízos ao crescimento e desenvolvimento.

12 Transformação de células A transformação de células vegetais pode ultrapassar as barreiras sexuais, de tal modo que qualquer gene, de qualquer organismo pode ser introduzido numa planta; Para ser útil, tem que ser expresso no órgão, tecido, célula desejada e a proteína por ele codificada tem de ter uma função de interesse.

13 Transformação de células Os experimentos pioneiros na transferência de genes foram conduzidos com tabaco e outras espécies cultivadas, como milho, trigo, arroz, algodão, girassol e beterraba, dentre outras; No entanto, apesar da existência de uma grande variedades de técnicas de transformação genética, até o presente momento ainda não foi encontrado um sistema ideal de transferência de genes que possa ser aplicado a todas as espécies vegetais.

14 Totipotencialidade: capacidade de qualquer célula vegetal gerar um indivíduo completo; Definições Técnica também chamada de micropropagação ou propagação in vitro.

15 Transformação de células Inicialmente, os métodos de introdução de DNA em células vegetais baseavam-se na transformação mediada por Agrobacterium; Objetivos: além de caracteres de interesse agronômico, também biorremediação, produção de fármacos, proteínas animais e biopolímeros de alto valor comercial.

16 Transformação de células- técnicas A utilização de Agrobacterium tumefaciens; Aceleração de partículas (biobalística); Polietilenoglicol (PEG); Eletroporação; Sonicação; Micropartículas de carboneto de sílica; Microlaser; Micro e macroinjeção.

17 Transformação de células Algumas limitações desses métodos é a falta de controle da integração do DNA no genoma da planta, que ocorre ao acaso; o silenciamento de genes e a interação entre os diferentes transgenes, resultando em padrões não esperados de expressão dos genes introduzidos.

18 Métodos de transformação de plantas

19 Métodos de transformação de plantas Direto (processos físico-químicos): Biobalística; Eletroporação de protoplastos; Polietilenoglicol (PEG); Indireto (DNA exógeno é inserido no genoma pela ação de um vetor biológico): Via Agrobacterium tumefaciens; Imersão de explantes em soluções de DNA; Macroinjeções.

20 Biobalística Objetivo inicial: introduzir material genético no genoma nuclear de plantas superiores. Outras aplicações têm sido avaliadas, demonstrando ser um processo também efetivo e simples para a introdução e expressão de genes em bactérias, protozoários, fungos, algas, insetos e tecidos animais. Recentemente, foi demonstrada sua aplicação na introdução e expressão de genes em animais in vivo e na indução de resposta imune utilizando DNA, processo denominado imunização genética

21 Biobalística

22 Biobalística Neste processo emprega-se microprojéteis (que podem ser de ouro ou tungstênio) que são acelerados a velocidades superiores a 1500 Km/h por sistemas de aceleração; Geração de uma onda de choque com energia suficiente para deslocar uma membrana carreadora contendo as micropartículas cobertas com DNA ou por meio de uma descarga de hélio a baixa pressão acelerando o microprojétil.

23 A onda de choque pode ser gerada por: Micrografia eletrônica de varredura das micropartículas cobertas com DNA: (A) tungstênio; (B) ouro. - uma explosão química (pólvora seca); - por uma descarga de hélio a alta pressão; - pela vaporização de uma gota de água decorrente de descarga elétrica; - por uma descarga de ar comprimido.

24 Biobalística

25 Biobalística As micropartículas aceleradas penetram na parede e membrana celular de maneira não-letal, localizando-se aleatoriamente nas organelas celulares. Em seguida, o DNA é dissociado das micropartículas pela ação do líquido celular, ocorrendo o processo de integração do gene exógeno no genoma do organismo a ser modificado. Uma das vantagens do sistema é que este permite a introdução e expressão gênica em qualquer tipo celular.

26 µ Biobalística

28 Eletroporação de protoplastos Protoplastos: células desprovidas de parede celular; Eletroporação: pulsos de eletricidade tornam a membrana plasmática reversivelmente permeável, permitindo que macromoléculas como o DNA sejam transportadas para dentro da célula vegetal; Utiliza-se uma descarga de capacitores para produzir pulsos de alta voltagem que induz a abertura de poros na membrana celular, o que permite a penetração e a eventual integração dos genes no genoma. É o método preferencial escolha quando se trata de plantas monocotiledôneas como milho, trigo, etc.

29 Esquema representativo do isolamento e purificação de protoplastos de Nicotina tabacum

30 Eletroporação de protoplastos O sucesso da metodologia depende: - Da otimização das condições de cultivo e regeneração de plantas a partir de protoplastos; - - Da sensibilidade dos protoplastos às condições de eletroporação (tampão, voltagem, concentração do DNA e do protoplasma).

31 Eletroporação de protoplastos Vantagens Rápido e eficiente; Grande controle das condições experimentais; Desvantagens: Necessidade de protoplastos; Custo do equipamento.

33 Via protoplastos Pode ser mediado por PEG ou por eletroporação. PEG ou polietilenoglicol faz com que a molécula de DNA se aproxime da membrana por causa de sua viscosidade.

34 PEG Policátions, como o polietilenoglicol (PEG), polivinil álcool (PVA ) ou DEAEdextran podem ser usados com agentes químicos que permitem a passagem passiva do DNA para dentro da célula vegetal. No contato do protoplastos com os policátions, a permeabilidade da membrana é aumentada pela interação das cargas positivas dos policátions com as cargas negativas do DNA e da membrana, facilitando a penetração daquele. Os policátions também protegem o DNA exógeno contra a ação das nucleases da célula vegetal.

35 PEG Plantas transgênicas de fumo foram obtidas por meio da incubação de protoplastos em presença de PEG, em uma concentração final entre 13 e 20%. Diversas espécies vegetais de interesse agronômico (canola, couve-flor, limão e, mais recentemente, arroz e milho) já foram transformadas por essa técnica. Entretanto, a freqüência de transformação é relativamente baixa (entre 1/1000 e 1/10000), podendo ser calculada pelo número de explantes que resultaram em pelo menos uma planta transgênica, em relação ao número inicial de explantes tratados. A maior limitação do uso desta técnica consiste na obrigatoriedade do uso de protoplastos.

37 Transformação indireta via Agrobacterium tumefaciens. Agrobacterium tumefaciens é uma bactéria do solo que causa uma doença denominada galha-de-coroa formando tumores na planta hospedeira; Agrobacterium rhizogenes causa doença neoplásica chamada de raiz em cabeleira; Possui plasmídeo denominado Ti (indutor de tumor) e Ri ( no caso do A. rhizogenes).

38 4. As proteínas produzidas a partir desse gene são precursores de hormônios do crescimento e opinas (aa conjugados com açúcares), que favorecem o Agrobacterium. Sistema planta-agrobacterium: colonização genética 1. A planta sofre um ferimento. Isto atrai o Agrobacterium porque a planta secreta compostos fenólicos nas regiões de ferimento para ser proteger do MO e para cicatrizá-la. Portanto ocorre sinalização química; 2. o MO se instala e a bactéria irá se desenvolver; 3. Processo de tumor. O MO transfere a região T do plasmídeo para a célula vegetal. Este DNA é integrado ao DNA da planta.

39 Agrobacterium tumefaciens

40 Dinâmica da transformação da planta pelo patógeno

41 Agrobacterium: colonização genética

42 Agrobacterium: colonização genética

43 PLASMÍDEO DE A. tumefaciens

44 Regiões do PLASMÍDEO DE A. tumefaciens a) Região T-DNA (ou DNA de transferência) contém a porção de DNA que será transferida, na forma de um fio único. Qualquer sequência de bases que for inserida entre essas duas extremidades, será integralmente transferida para a planta, independente de seu tamanho, e inserida, ao acaso, ao seu genoma. b) Região Vir (Vir = virulência) Genes desse agrupamento codificam para: expressão de produtos responsáveis pelo processo de exportação do T-DNA da bactéria para a planta. Na Região Vir estão os agrupamentos A, B, C, D, E, F e G, que contêm os genes VirA, VirB, VirC, VirD, VirE, VirF e VirG, todos participantes ativos do processo geral de transformação da planta pelo patógeno.

45 Regiões do PLASMÍDEO DE A. tumefaciens REGIÃO VIR A B G C D E F Região A: produz proteína que age como sensor de fenóis; Região B: produz proteína responsável pelo canal que liga o Agrobacterium à celula; Região C: regenerar o DNA que foi clivado; Região D: cortam a fita do TDNA e a transfere para o núcleo; Região E: codifica peptídeos que vão enrolar o TDNA; Região F: envolvida com o espectro de hospedeiro; Região G: codifica para uma proteína reguladora G que vai ativar as regiões B, C, D e E a serem transcritas.

46 Regiões do PLASMÍDEO DE A. tumefaciens c) Região Occ Nesse grupamento estão os genes que codificam para síntese e catabolismo de opinas. d) Região Rep Aqui estão os genes responsáveis pela autoreplicação do plasmídeo. e) Região Tra A expressão de genes situados nessas duas regiões origina produtos que governam a transferência do plasmídeo Ti para outras espécies compatíveis de Agrobacterium.

47 PLASMÍDEO DE A. tumefaciens A expressão dos genes do plasmídeo resulta na síntese de auxinas e citocininas, que levam à formação de tumores em plantas, e aminoácidos modificados (opinas), substâncias necessárias para a sobrevivência da bactéria. Desta forma, o Agrobacterium transfere alguns de seus genes para a planta, com os seus plasmídeos Ti, que representam vetores naturais de transferência de material genético para plantas.

48 Fase 1 A bactéria penetra e necessita ligar-se a sítios receptores na parede da célula vegetal.

49 Fase 2 Após a ligação da célula bacteriana a sítios receptores na parede da célula da planta, inicia-se a expressão dos genes Vir, localizados na região Vir do Plasmídeo Ti, devido à presença de moléculas liberadas pela planta no local do ferimento (fenóis, açúcares e também de prótons),

50 O processo infectivo eventos e requerimentos O ponto crítico para a bactéria conseguir infectar a planta é estarem as células dessa última "competentes" ou em "estado de competência" para receber o fragmento de genoma a ser inserido. Os ferimentos são essenciais para que a infecção aconteça, não só por serem portas de entrada como também por alterarem a fisiologia do tecido no local e facilitar o contato entre as células do patógeno e do hospedeiro, por exporem sítios receptores nas últimas.

51 O processo infectivo eventos e requerimentos Outro evento importante é a tentativa de reparo realizada pela planta. Assim que o ferimento ocorre, células da planta sofrem alguns ciclos de divisão com este fim, como se fosse uma tentativa imediata e biológica de cicatrização. Embora ainda não esteja muito claro de que forma, parece que essa divisão celular, de algum modo, aumenta a eficiência com que o T-DNA é transferido.

52 O processo infectivo eventos e requerimentos Quando o ferimento ocorre, células do hospedeiro circunvizinhas do local iniciam uma resposta inespecífica de defesa que inclui a síntese de compostos fenólicos, de açúcares envolvidos na síntese da parede celular e há liberação de íons H + nos espaços intercelulares, o que culmina com o abaixamento do ph no local do ferimento. Fenóis, juntamente com os açúcares e os íons H + são reconhecidos bioquimicamente pela bactéria infectante e servem para desencadear os fenômenos seguintes.

53 Transformação genética de plantas Para aproveitar-se destas propriedades naturais para a transferência de genes de interesse em plantas, é necessário eliminar as características indesejáveis do T-DNA, mantendo a sua capacidade de integrar-se ao genoma da planta hospedeira e, no lugar deles, devem ser inseridos os genes de interesse. Com as enzimas de restrição, é possível executar a substituição destes genes sem interferir nas propriedades que permitem a integração do T-DNA ao DNA da célula hospedeira. Assim, qualquer gene pode ser introduzido em uma célula vegetal utilizando-se esta ferramenta oferecida pela própria natureza.

54 Linhagem desarmada É a linhagem de Agrobacterium que teve seus oncogenes deletados

55 Desarmamento de cepa

56 Agrobacterium tumefaciens

57 Transformação genética de plantas

58 Inserção de TDNA

59 Avaliação da eficiência da transformação - uso de marcadores visuais Contagem do número de células ou tecidos que expressem um gene reporter: GUS (β-glucuronidase- cor azul), GFP (proteína verde fluorescente). Assim que eles chegam na planta são facilmente identificados pela coloração ou outro método.

60 Resumo da transformação genética de célula vegetal 1. Preparo do plasmídeo- deleção dos oncogenes (cerca de 7) e substituição por genes de interesse e gene de resistência a uma antibiótico e/ou marcador visual; 2. Inserção do plasmídeo modificado na bactéria A. tumefaciens = linhagem desarmada; 3. Cultivo da bactéria com os explantes (fragmentos dos tecidos da planta) para que ocorra a infecção; 4. Eliminação das células não transformadas por ação de um antibiótico; 4. Regeneração da planta a partir de células transformadas, que vai produzir a nova característica adicionada à planta por meio da transformação genética.

61 Referências Biotecnologia aplicada ao valor nutricional dos alimentos. Disponível em: SERAFINI, L. A.; BARROS, N. M; AZEVEDO, J. L. Biotecnologia na agricultura e na agroindústria. Cap 8. Plantas transgênicas. Guaíba: livraria e editora agropecuária, VIDAL, M. S. Regeneração e Transformação Genética de Plantas. Circular técnica Disponível em: BRASILEIRO, A. C. M. Agrobacterium: um sistema natural de transferência de genes para plantas. Biotecnologia - Ciência e desenvolvimento. Disponível em: ANDRADE, S. R. M. Transformação de plantas. EMBRAPA, Disponível em: