CENTRO ESTADUAL DE EDUCAÇÃO TECNOLÓGICA PAULA SOUZA FACULDADE DE TECNOLOGIA DE PIRACICABA - FATEC GRADUAÇÃO EM TECNOLOGIA EM BIOCOMBUSTÍVEIS

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1 CENTRO ESTADUAL DE EDUCAÇÃO TECNOLÓGICA PAULA SOUZA FACULDADE DE TECNOLOGIA DE PIRACICABA - FATEC GRADUAÇÃO EM TECNOLOGIA EM BIOCOMBUSTÍVEIS MICROPROPAGAÇÃO DE CANA-DE-AÇÚCAR VIA ORGANOGÊNESE DIRETA DANIELA FERRAZ DE CAMPOS SILVA PIRACICABA - SP JUNHO/2011

2 DANIELA FERRAZ DE CAMPOS SILVA MICROPROPAGAÇÃO DE CANA-DE-AÇÚCAR VIA ORGANOGÊNESE DIRETA Trabalho de Graduação apresentado ao Curso de Tecnologia em Biocombustíveis da Faculdade de Tecnologia de São Paulo como requisito parcial à obtenção do título de Tecnólogo em Biocombustíveis. Orientadora: Profª. Drª. Daniela Defávari do Nascimento. Co-orientador: Dr. Enio Tiago de Oliveira. PIRACICABA - SP JUNHO/2011

3 FICHA CATALOGRÁFICA Silva, Daniela Ferraz de Campos. Micropropagação de cana-de-açúcar via organogênese direta/ Daniela Ferraz de Campos Silva. Piracicaba, p. 42. Orientadora: Daniela Defávari do Nascimento Co-orientador: Enio Tiago de Oliveira Trabalho de Conclusão de Curso Faculdade de Tecnologia de São Paulo. Faculdade de Tecnologia em Biocombustíveis.

4 FOLHA DE APROVAÇÃO Profa. Dra. Daniela Defávari do Nascimento Orientadora Dr. Enio Tiago de Oliveira Co-orientador - ESALQ /USP Piracicaba Prof. Paulo Cesar Doimo Mendes FATEC Piracicaba

5 Ao meu grande companheiro Rogério, que está comigo em todas as horas, me apoiando e me incentivando. Aos meus queridos filhos, Gabriel e Laura que são a razão da minha vida. Dedico

6 AGRADECIMENTOS A Deus que deu forças e iluminou o meu caminho durante esta etapa da minha vida. Agradeço à minha orientadora professora Daniela Defávari do Nascimento pela orientação, confiança e amizade. Ao meu co-orientador Dr. Enio Tiago de Oliveira, pelo auxílio impagável na produção do trabalho. A ESALQ por ter disponibilizado a utilização do laboratório do Setor de Biotecnologia. A Tatiana Bistaco, do laboratório de Biotecnologia da ESALQ, pela sua paciência e disposição em ensinar, supervisionar e revisar o trabalho. A todos os professores que colaboraram ao longo destes anos, para o enriquecimento de meu intelecto. Em especial a professora Luciana Fisher por auxílios importantes, que possibilitaram a conclusão do trabalho. Aos colegas de classe pela espontaneidade e alegria na troca de informações e materiais numa rara demonstração de amizade e solidariedade. Especialmente as minhas amigas Carina e Suellen, pelo incentivo nas horas difíceis, pela amizade e pela nossa cumplicidade no transcorrer do curso. A meus pais, irmãs, sobrinhos e toda família pela paciência em tolerar a minha ausência e apreensão. E, finalmente aos meus grandes companheiros, meu marido Rogerio, pelo seu incentivo incontestável, e pelos meus amados filhos Gabriel e Laura, que suportaram toda minha angústia e falta.

7 I...se vi mais longe, foi por estar sobre ombros de gigantes Sir Isaac Newton ( )

8 II RESUMO A cana-de-açúcar é uma cultura que assume lugar de destaque na economia mundial e no país. Isso se dá principalmente ao fato da cultura proporcionar um aproveitamento total da matéria prima, quer seja in natura, ou quando processada. Assim, cada vez mais a cultura é inserida em programas que visam obter plantas com características desejáveis, resultando em uma melhor qualidade e produtividade. As técnicas de micropropagação in vitro utilizadas para a regeneração de plantas ocorrem através das rotas de embriogênese e de organogênese, ambas podendo ser direta ou indireta. A rota organogênese direta (utilizada no trabalho) é quando o desenvolvimento de órgãos acontece diretamente a partir do tecido do explante, sem passar pela fase de calo. Para alcançar um bom resultado final na micropropagação in vitro, aspectos como a assepsia, qualidade do explante, meio nutritivo e fatores ambientais, são de suma importância. Reguladores de crescimento são substâncias importantes para o cultivo in vitro, pois modificam a morfologia das plantas, interferindo no desenvolvimento do meristema apical e no florescimento normal. No presente trabalho foram utilizados diversos meios de cultivo MS (pré-indução) e MRP (regeneração), com diferentes quantidades de reguladores e dias em contato com os meios e a exposição à luz. Os resultados obtidos mostram que as melhores respostas regenerativas de plantas de discos de ponteiros de cana-de-açúcar, foram observadas no tratamento com pré-indução com 2,4-D em MS3K, incubados em 3 dias no escuro, cultivados por 30 dias em MRP na luz e cultivados por mais 40 dias na luz em MB. PALAVRAS-CHAVE: cana-de-açúcar, micropropagação in vitro, organogênese direta.

9 III ABSTRACT Sugar cane production increasingly plays an important role in the global and specially in the Brazilian economy. This happens mainly because the culture provides a total utilization of raw material, either fresh, or when processed. So, increasingly the culture is embedded in programs aimed to obtain plants with desirable characteristics, resulting in better quality and productivity. Micropropagation techniques used for plant regeneration in vitro occurs through the routes of embryogenesis and organogenesis, both can be directly or indirectly. The organogenesis direct route (studied in this work) is when the organ development takes place directly from the explant tissue, without passing the callus phase. To achieve a good result on in vitro propagation, aspects such as assepsy, quality of the explant, nutrient media and environmental factors are of main importance. Growth regulators are substances also important for the in vitro regeneration because it modifies the morphology of plants, interfering in the apical meristem development and normal flowering. In this work we used different culture medias MS (preinduction) and MRP (regeneration) with different amounts of regulators and days in contact with the media and exposure to light. The results show that the best regenerative responses of leaf discs of sugar cane were observed with pre-induction treatment in MS3K with 2,4-D incubated for 3 days in the dark, then grown for 30 days in MRP in the light and after, more 40 days in light in MB. KEYWORDS: sugar-cane, in vitro micropropagation, direct organogenesis.

10 IV LISTA DE TABELAS Tabela 1 Composição dos meios de cultivo de pré-indução MS Tabela 2 Composição dos meios de cultivo de regeneração MRP Tabela 3 - Plantas regeneradas obtidas a partir de discos pré-induzidos com 2,4-D em MS3K, MS3C e MS8 por 3; 6; 9 e 12 dias no escuro, 30 dias em MRP na luz, repicados e cultivados por mais 40 dias em meios finais de regeneração (MS, MRP, MRP1 e MRP2) na luz Tabela 4 - Plantas regeneradas obtidas a partir de discos sem pré-indução em 2,4-D, em MRP direto na luz e por 3 dias no escuro, 30 dias em MRP na luz, repicados e cultivados por mais 40 dias em meios finais de regeneração (MS, MRP, MRP1 e MRP2) na luz Tabela 5 Características regenerativas de 20 explantes finais obtidas a partir de discos pré-induzidos com 2,4-D em MS3K, MS3C e MS8 por 3; 6; 9 e 12 dias no escuro, 30 dias em MRP na luz, repicados e cultivados por mais 40 dias em meios finais de regeneração (MB, MRP, MRP1 e MRP2) na luz... 18

11 V LISTA DE FIGURAS Figura 1 - Visão geral das estruturas avaliadas nos experimentos de regeneração. A: Padrão geral das estruturas. B: Plantas grandes. C: Plantas médias. D: Plantas pequenas. E: Brotos necrosados e F: Calos Figura 2 - Número total de plantas regeneradas obtidas a partir de discos sem pré-indução [0 dias de escuro (diretamente na luz em MRP)] e préinduzidos com 2,4-D em MS3K, MS3C e MS8 por 0; 3; 6; 9 e 12 dias no escuro, 30 dias em MRP na luz, transferidos e cultivados por mais 40 dias em meios finais de regeneração (MB, MRP, MRP1 e MRP2) na luz Figura 3 - Número total de plantas regeneradas obtidas a partir de discos sem pré-indução [0 dias de escuro (diretamente na luz em MRP)] e préinduzidos com 2,4-D em MS3K por 0; 3; 6; 9 e 12 dias no escuro, 30 dias em MRP na luz, transferidos e cultivados por mais 40 dias em meios finais de regeneração (MB, MRP, MRP1 e MRP2) na luz Figura 4 - Número total de plantas regeneradas obtidas a partir de discos sem pré-indução [0 dias de escuro (diretamente na luz em MRP)] e préinduzidos com 2,4-D em MS3C por 0; 3; 6; 9 e 12 dias no escuro, 30 dias em MRP na luz, transferidos e cultivados por mais 40 dias em meios finais de regeneração (MB, MRP, MRP1 e MRP2) na luz Figura 5 - Número total de plantas regeneradas obtidas a partir de discos sem pré-indução [0 dias de escuro (diretamente na luz em MRP)] e préinduzidos com 2,4-D em MS8 por 0; 3; 6; 9 e 12 dias no escuro, 30 dias em MRP na luz, transferidos e cultivados por mais 40 dias em meios finais de regeneração (MB, MRP, MRP1 e MRP2) na luz Figura 6 Características de responsividade na regeneração de plantas obtidas a partir de explantes iniciais (discos) pré-induzidos por 3; 6; 9 e 12 dias, no escuro, em MS3K, MS3C e MS8, transferidos para MRP e cultivados por 30 dias na luz... 23

12 VI SUMÁRIO RESUMO... II ABSTRACT... III LISTA DE TABELAS... IV LISTA DE FIGURAS... V 1. INTRODUÇÃO OBJETIVOS Objetivo geral Objetivos específicos REVISÃO BIBLIOGRÁFICA Cana de açúcar Cultura de tecidos Micropropagação de cana-de-açúcar Aspectos importantes para sucesso na micropropagação Reguladores de crescimento Transformação genética MATERIAIS E MÉTODOS Materiais Métodos Coleta e desinfestação do material Pré-indução Subcultivos e regeneração de plantas RESULTADOS E DISCUSSÃO Períodos de incubação no escuro Meios de pré-indução com 2,4-D Regeneração final de plantas CONCLUSÕES REFERÊNCIAS ANEXOS... 30

13 1 1. INTRODUÇÃO A cana-de-açúcar ocupa posição de destaque na economia mundial, podendo ser utilizada in natura, sob forma de forragem, para alimentação animal, ou como matéria-prima para a produção de açúcar, álcool, bioetanol, biodiesel, produtos farmacêuticos, aguardente e em ascensão a sua utilização como fonte renovável de energia. Segundo Análise Energia (2011), na safra de 2008/2009 foram moídas 569 milhões de toneladas de cana-de-açúcar, 15 a mais que a safra anterior. O Brasil é o maior e mais eficiente produtor de açúcar, álcool e subprodutos da cana-de-açúcar do mundo, onde a área plantada na safra 2008/2009, foi de 8,5 milhões de hectares, correspondendo a 1 do território nacional (ANÁLISE ENERGIA, 2011). Contudo, São Paulo detém 60% de área plantada do país, seguido de Alagoas, Paraná, Minas Gerais, Pernambuco, Mato Grosso, Goiás e Mato Grosso do Sul (ÚNICA, 2011). A cana-de-açúcar é uma das principais culturas plantadas no Brasil, e proporciona expressiva importância sócio-econômica e agroindustrial ao país, assim, cada vez mais a cultura é engajada em programas que visam o melhoramento de espécies cultivadas. Deste modo, a cultura é inserida em programas de micropropagação in vitro, regeneração e melhoramento genético, tendo em vista, a introdução de características de interesse agronômico, como resistência a pragas e patógenos, tolerância a herbicidas, aumento no teor de sacarose, entre outros. A cultura de tecidos vegetais in vitro, é uma técnica baseada no fato de que qualquer célula vegetal contém toda informação necessária para gerar uma planta completa através de processo de diferenciação (COCKING apud EMBRAPA, 2011a). Assim, a micropropagação in vitro de cana-de-açúcar é uma alternativa vantajosa em relação às técnicas convencionais, devido à economia de tempo e a excelente qualidade fitossanitária e a uniformidade genética das mudas obtidas. A micropropagação in vitro é constituída de duas rotas morfogenéticas, a organogênese (direta ou indireta) ou a embriogenêse somática (direta ou indireta). A organogênese direta refere-se à regeneração direta de plantas, sem a passagem pela fase de calos, já na indireta a regeneração de gemas é precedida pela formação de calos (GRATTAPAGLIA; MACHADO, 1998). Todavia, como a resposta morfogênica é fortemente influenciada pelo genótipo, é fundamental que seja

14 2 realizada adaptação dos protocolos em cada cultivar a ser utilizada (CIDADE et al., 2006). Para se obter sucesso na micropropagação in vitro, vários fatores são importantes para a realização da técnica, como a origem do explante, a assepsia do local e do explante a ser manuseado, o meio nutritivo (sais, vitaminas, reguladores de crescimento, etc.) e os fatores ambientais.

15 3 2. OBJETIVOS 2.1. Objetivo geral Acompanhar o processo morfogenético da regeneração direta de discos de ponteiros (palmitos) de plantas de cana-de-açúcar, cultivar SP Objetivos específicos Otimizar o processo de desinfestação de discos de ponteiros de cana-deaçúcar (explantes) de plantas cultivadas e coletadas a campo. Estudar o efeito pré-indutivo de composições de meios de cultura, pré-cultivo dos discos no escuro e o comportamento dos explantes em tratamentos finais de regeneração de plantas. Avaliar o efeito de tratamentos sobre número e características de estruturas, principalmente, número e tipo de plantas regeneradas. Evidenciar o melhor tratamento de regeneração de plantas aplicáveis a sistemas de transformação genética.

16 4 3. REVISÃO BILIOGRÁFICA 3.1. Cana de açúcar A cana de açúcar é uma planta semiperene (após seu plantio, é cortada várias vezes antes de ser replantada), pertencente ao gênero Saccharum, da família Poaceae, originária de regiões tropicais da Ásia, especialmente da Índia (BNDES; CGEE, 2008). É muito cultivada em países tropicais e subtropicais, onde se alternam as estações secas e úmidas, para a obtenção da sacarose contida em seu caule, formado por numerosos nós (SCHUCH, 2011). A parte aérea da planta é composta pelos colmos, onde se concentra a sacarose e pelas pontas e folhas que constituem a palha da cana (BNDES; CGEE, 2008). O colmo é cilíndrico, composto por nós, entrenós ou internódios, que provê sustentação às folhas e à inflorescência. As folhas são divididas em lâmina e bainha, as quais são alternadas, opostas e presas aos nós e colmos (NETAFIM, 2011). O Brasil é o maior produtor mundial de cana de açúcar e o segundo maior de etanol. Entre 1977 e 2006, a produtividade nacional passou de 52,0 t/ha colhido para 74,4 t/ha (CGEE, 2009). Isso devido, principalmente ao fato da cultura proporcionar um aproveitamento total dentro dos seus processamentos industriais. A cana-de-açúcar apresenta vários produtos e subprodutos derivados da moagem da planta, como o melado, usado como componente de rações para ruminantes e como substituto do açúcar na alimentação humana, o bagaço como fonte de fibras, pode ser utilizado para alimentação animal mas é principalmente empregado para a geração de energia em usinas por meio de sua queima. Outro importante derivado da cana é a cachaça, obtida da fermentação e da destilação do caldo (garapa) (CIB, 2011a). A exploração do potencial energético da cana-de-açúcar iniciou no Brasil em 1975, com a criação do Programa Nacional do Álcool (Proálcool), qual sua finalidade era incentivar a substituição do petróleo do país por álcool combustível. Com isso, a aplicabilidade da cana-de-açúcar foi se estendendo, passando a ser adicionada à gasolina, incorporada ao diesel (biodiesel), utilizada em veículos flex e demais formas de utilização (SECCO, 2011). A cultura da cana-de-açúcar assume lugar de destaque na economia mundial, e para uma melhor produtividade, técnicas com base nos princípios

17 5 de melhoramento genético vegetal são aplicadas na obtenção de novas plantas e formas mais eficientes de seleção. Visando à introdução de novas características como aumento de produtividade, resistência a doenças e pragas e a condições ambientais adversas, resulta numa melhor qualidade tecnológica e nutricional do produto final (SCAGLIUSI, 2011) Cultura de tecidos Segundo Torres et al. (2000), a cultura de tecidos vegetais é uma técnica onde o cultivo da planta é realizado in vitro, deste modo, pequenos fragmentos de tecido vivo, chamados explantes, são isolados de um organismo vegetal, desinfestados e cultivados assepticamente, por períodos indefinidos em um meio de cultura apropriado. A finalidade é obter uma planta com características idênticas à original, ou seja, realizar uma clonagem vegetal, de modo a obter um novo indivíduo, mantendo-se o genótipo idêntico ao original. A micropropagação de vegetais in vitro, pode ser obtida por fragmentos da folha, de raiz, de caule ou de qualquer tecido que responda ás condições de indução do meio de cultura. (TORRES et al., 2000). A cultura se baseia na teoria da totipotência onde os seres vivos têm a capacidade de regenerar organismos inteiros, idênticos à matriz doadora, a partir de células únicas (ALVES et al., 2011). Os meios de cultura para a regeneração de plantas incidem da associação qualitativa e quantitativa das substâncias essenciais para o desenvolvimento da planta fora de seu meio natural. O meio nutritivo MS (MURASHIGE; SKOOG, 1962) é um meio universalmente usado, especialmente para morfogênese, cultura de meristemas e regeneração de plantas (UEVORA, 2011). Segundo Teixeira et al. (2007), os meios nutritivos são compostos por elementos essenciais e opcionais, sendo bastante variáveis em função da espécie vegetal e da origem do explante. Dentre os essenciais estão a água, os sais inorgânicos (macro e micronutrientes), os carboidratos, as vitaminas e os reguladores de crescimento. Os reguladores de crescimento são fundamentais para a multiplicação vegetal, entre os mais utilizados estão as citocininas e as auxinas. Logo os elementos opcionais incluem os compostos orgânicos nitrogenados, ácidos orgânicos e mio-inositol. De acordo com o protocolo do sistema de cultivo, os meios de cultura podem apresentar forma líquida, sólida ou semi-sólida. A

18 6 geleificação do meio de cultura incide mediante a adição de Ágar, que é um polissacarídeo extraído de algas marinhas. No entanto, a concentração de sais, a presença de substancias e o ph do meio de cultura, são fatores que interferem na geleificação do meio de cultivo. Além da composição dos meios de cultura, as condições físicas de incubação, como a temperatura, umidade, intensidade, qualidade e duração do período de luz, e o próprio genótipo do material vegetal cultivado, influem sobre a morfogênese dos tecidos vegetais (GEORGE; SHERRINGTON, 1984) Micropropagação de cana-de-açúcar Para Scagliusi (2011), a regeneração de plantas via cultura de tecidos, pode ocorrer através de duas rotas morfogênicas distintas: embriogênese somática e organogênese. A embriogênese somática é o processo pelo qual células somáticas do explante diferenciam-se em embriões somáticos (não resultantes da fecundação), ocorrendo a formação de estruturas bipolares. Os embriões somáticos também podem incidir diretamente do explante, através da embriogênese direta, ou mais freqüentemente, resultante da cultura de calos, por meio da embriogênese indireta. A Organogênese é o processo de formação de partes aéreas ou raízes, originadas de diferentes explantes, os quais são induzidos a sofrer mudanças que levam à produção de uma estrutura unipolar. A organogênese pode ser direta ou indireta. No primeiro caso, a regeneração acontece a partir de um explante primário onde há a formação de um eixo caulinar a partir de gemas apicais, laterais ou axilares (THORPE, 1980), ou seja, é o desenvolvimento de órgãos diretamente a partir do tecido do explante, sem passar por fase de calo (CIB, 2011b). Já na organogênese indireta, ocorre a desdiferenciação do explante, resultando na formação de calos, que podem ser definidos como a proliferação de células não diferenciadas (THORPE, 1980), assim, pode-se dizer que é o desenvolvimento de órgãos a partir de uma massa não diferenciada de células, ou calo, derivado do explante (CIB, 2011b). Os discos foliares (segmentos de folhas sobrepostas) de cana-de-açúcar são capazes de formar plantas inteiras pelas vias organogênica e embriogênica, e tem sido o tecido alvo alternativo ao processo de transformação genética de cana-deaçúcar (DESAI, 2004; LAKSHMANAN et al., 2005).

19 Aspectos importantes para sucesso na micropropagação A cultura de tecidos atua em diversas áreas da biologia vegetal, proporcionando suporte técnico na sua aplicação básica e ao apoio às diversas áreas como a de bioquímica, fisiologia vegetal, fitopatologia e citogenética. Mesmo considerando todas as possíveis aplicações, a cultura de tecido é uma só, e o denominador de todas elas é: a assepsia, o explante, o meio nutritivo e os fatores ambientais: luz e temperatura. Assim,a assepsia é um conjunto de procedimentos para tornar o explante livre de microrganismos (bactérias, fungos, leveduras entre outros). Tais procedimentos incluem o uso de antissépticos (bacteriostáticos ou germicidas), que podem ser antibióticos, alcoóis, halogênios, sais de metais pesados, fungicidas orgânicos, etc. As vidrarias e os meios de cultura, devem ser esterilizados por calor seco (forno, ar quente) ou úmido (autoclave). As pinças, bisturis e demais utensílios metálicos devem ser flambados em ambiente axênico (livre de germes), utilizando-se de bico de Bunsen em câmara de fluxo laminar (CID, 2011). Para a obtenção de explantes, devem-se utilizar plantas de boa qualidade, com perfeitas condições fisiológicas e nutricionais, e que estejam em ativo crescimento (TORRES et al., 1998). Quanto mais limpa a origem dos explantes, menos contaminação haverá e mais fácil será desinfestá-los. Assim sendo, segundo Cruz et al. (2009), os explantes receberão menos choque e conseguintemente as chances de sobrevivência serão maiores. Os meios nutritivos utilizados para a cultura de células, tecidos e órgãos de plantas fornecem as substâncias essenciais para o crescimento dos tecidos e controlam, em grande parte, o padrão de desenvolvimento in vitro. Os componentes necessários para um meio essencial são: água, macronutrientes, micronutrientes, sacarose, carboidratos, vitaminas, mio-inositol, reguladores de crescimento ou hormônios, Ágar e ph adequado (entre 5 e 6) (PEREIRA; MELO, 2011). A luz e a temperatura são dois fatores ambientais importantes nas salas de cultura, onde devem ser controlados para que as plantas se desenvolvam adequadamente. A luz é importante para a planta sob três aspectos: fotossíntese, fotomorfogênese e o fototropismo. A temperatura em salas de cultura, em geral, varia entre 24 e 27 C, para um bom crescimento vegetativo (CID, 2011).

20 Reguladores de crescimento Em plantas, assim como nos animais, muitos processos bioquímicos e fisiológicos são controlados por hormônios. O hormônio natural e outros materiais são essencialmente "mensageiros químicos", influenciando no desenvolvimento da planta (HARTMANN et al., 1988). O hormônio vegetal é uma substância natural produzida pela própria planta, que pode ser dividido em cinco grupos (Anexo A): auxinas, giberelinas, citocininas, etileno e ácido abscísico. Logo, os hormônios sintetizados quimicamente provocam reações similares àquelas causadas pelos naturais (KRUKEMBERGHE, 2011). Segundo George (1996), o crescimento da planta in vitro é altamente dependente da interação entre as substâncias de crescimento que ocorrem naturalmente na planta (hormônios) e os análogos sintéticos (reguladores de crescimento), os quais são adicionados ao meio de cultura. As auxinas são substâncias que controlam o crescimento e o alongamento celular e as citocininas estimulam a divisão celular e reduzem a dominância apical. (PASQUAL, 2001). Das citocininas comercialmente disponíveis, a 6- benzilaminopurina (BAP), é a que, em geral, apresenta melhores resultados in vitro para promover a multiplicação de diversas espécies (GRATTAPAGLIA; MACHADO, 1988). Segundo Assis e Teixeira (1998) quanto ao enraizamento, às auxinas mais utilizadas são o ácido indolbutírico (AIB) e o ácido naftalenoacético (ANA). Os reguladores de crescimento podem ser encontrados na forma natural ou sintética, e quando aplicados em plantas influenciam no seu crescimento e no seu desenvolvimento (UESB, 2011). Atuam dentro da planta modificando sua morfologia, interferindo no desenvolvimento do meristema apical e no florescimento normal. Contudo, todos reguladores de crescimento tem uma ação similar dentro da planta, com poucas diferenças em resposta na produção. As reações para essas diferenças não são claramente compreendidas (BARRET, 1992) Transformação genética A modificação genética de plantas vem sendo manipulada pelo homem há séculos, mesmo de forma empírica, quando eram empregados métodos de seleção

21 9 e melhoramento para a obtenção de novas plantas. Com o decorrer dos tempos, foram-se introduzindo a engenharia genética e a biotecnologia, assim, novas tecnologias mais eficientes de seleção foram sendo aplicadas, resultando numa melhor qualidade tecnológica e nutricional do produto final. (SCAGLIUSI, 2011). Segundo Romano (2011), pesquisas em melhoramento genético, fundamentado em técnicas tradicionais têm encontrado dificuldades em obter soluções para vários problemas que afetam a cana-de-açúcar. Entre eles destacamse, tolerância a déficits hídricos e resistência à broca gigante (Castnia licus). Com a inclusão destas características no gene, haverá aumento na produtividade da cultura, além de, permitir que esta seja cultivada em áreas que hoje são restritivas. Para o desenvolvimento de eventos de cana de açúcar GM (geneticamente modificados) tolerantes à seca e resistentes à broca gigante, genes podem ser isolados a partir de técnicas modernas de biologia molecular, utilizando estudos de transcriptoma, proteômica e de evolução in vitro de moléculas. Após a identificação dos genes, estes devem ser validados em plantas modelo e incorporados em variedades elite de cana-de-açúcar. As plantas obtidas poderão expressar as características de tolerância a estresses e resistência à patógenos e insetos, assim como as demais características agronômicas avaliadas em campo por melhoristas.

22 10 4. MATERIAS E MÉTODOS 4.1. Materiais Este trabalho de pesquisa foi baseado nos resultados de Lakshmanan et al. (2006) e conduzido com suporte financeiro, supervisão e orientação de pesquisadores envolvidos no Projeto Temático FAPESP 2008/ , coordenado pela Profª Drª Helaine Carrer, desenvolvido no Laboratório de Biotecnologia Agrícola (CEBTEC) do Departamento de Ciências Biológicas (LCB) da Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz (ESALQ/USP), possuindo exclusividade de publicação. Mudas de cana-de-açúcar, cultivar SP803280, gentilmente cedidas pela Universidade Federal de São Carlos - UFSCAR - Campus Araras SP, com aproximadamente 1 mês de idade, foram obtidas a partir de toletes tratados por termoterapia a 51,5 C por 30 minutos e imersos em solução de fungicida metiltiofan (benzimidazol) por 3 minutos e plantadas em bandejas com substrato comercial a base de casca de pinus compostada, vermiculita, areia e fertilizantes. Depois de estabelecidas, as mudas foram transplantadas para canteiros experimentais do CEBTEC Métodos Coleta e desinfestação do material Plantas com aproximadamente 8 meses de idade foram coletadas, e delas, foram isolados os ponteiros a partir dos quatro últimos nós. No laboratório, foram retiradas folhas e bainhas até os dois últimos nós. Esses ponteiros constituídos de um cartucho de bainhas, aqui denominados de palmitos, foram imersos 4 vezes em solução alcoólica 70 v/v e, em câmara de fluxo laminar de ar estéril, foi retirada mais uma bainha deixando o palmito acompanhado apenas do último nó (região tissular a partir do meristema apical). Dos primeiros 5 cm a partir do último nó, imersos em solução de ácido cítrico 150 mg.l -1, foram cortados em torno de 15 discos de 1,5 a 2,0 mm de espessura e inoculados em placas de petri com 30 ml de meio de cultura e submetidos a 3 subcultivos.

23 Pré-indução Na composição basal dos meios de cultura MB (Anexo B), utilizou-se sais e vitaminas de MS (Anexo C) acrescido de ácido cítrico. No primeiro subcultivo, os discos foram pré-induzidos em meio MS3C, em MS3K ou em MS8, descritos na tabela 1, e mantidos por 0; 3; 6; 9 e 12 dias no escuro a 25ºC ± 1. Tabela 1 Composição dos meios de cultivo de pré-indução MS3C MS3K MS8 Meio basal MB MB MB 2,4-D (ácido 2,4-dicloro fenoxiacético) 3 mg.l -1 3 mg.l -1 8 mg.l -1 Cinetina - 0,1 mg.l -1 - Água de coco 50 ml.l Subcultivos e regeneração de plantas No segundo subcultivo, os discos foram transferidos para MRP (tabela 2) e cultivados na luz com 40 µm.cm -2.s -1 e temperatura de 25 C ±3, por 30 dias. No terceiro subcultivo, cada disco (5 repetições) de cada tratamento foi dividido em 4 explantes e transferidos para 4 meios de cultura: MB, MRP,MRP1 e MRP2 (tabela 2), e cultivados por mais 40 dias nas mesmas condições de luz. Cada tratamento do primeiro subcultivo, pré-indução, foi constituído de 4 repetições de 5 discos cada um. No segundo subcultivo, todos os discos foram transferidos para MRP e subcultivados por 30 dias. No terceiro subcultivo, 5 discos de cada tratamento foram divididos em 4, totalizando 5 repetições de 4 explantes. Tabela 2 Composição dos meios de cultivo de regeneração MRP MRP1 MRP2 Meio basal MB MB MB 6-BAP (6-benzil aminopurina) 0,45 mg.l -1 0,45 mg.l -1 0,45 mg.l -1 ANA (ácido naftalenoacético) 3,72mg.L -1 1,86 mg.l -1 - No final do segundo subcultivo foram avaliados o número de brotos produzidos, grau de formação paralela de calos e raízes, e o número de discos responsivos. No final do terceiro subcultivo foram avaliados o número total de

24 12 plantas regeneradas (classificadas em pequenas (P) com 0,5 a 1,0 cm, médias (M) com 1,0 a 3,0 cm, e grandes (G) com 3,0 a 6,0 cm), número de brotos vivos, porcentagem de explantes necrosados e grau de formação de raízes (Figura 1)..

25 Figura 1 - Visão geral das estruturas obtidas nos experimentos de regeneração de cana-de-açúcar. A: Padrão geral das estruturas. B: Plantas grandes. C: Plantas médias. D: Plantas pequenas. E: Brotos necrosados e F: Calos. (CEBTEC, 2011) 13

26 14 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO A figura 2 mostra os resultados das interações de períodos de incubação (0; 3; 6; 9 e 12 dias no escuro), pré-indução com 2,4-D em MS3K, MS3C e MS8 e regeneração final de plantas em MB, MRP, MRP1 E MRP Períodos de incubação no escuro A visão geral da figura 2 e os dados numéricos das tabelas 3, 4 e 5, demonstram que os melhores resultados em termos de regeneração final de plantas foram observados no período de incubação de 3 dias no escuro, independente do meio de cultura de pré-indução (MS3K, MS3C ou MS8). O que pode ser confirmado por Rugini e seus colaboradores (1988), que demonstraram que três dias de escuro apresenta efeito positivo no enraizamento e desenvolvimento das plântulas e que a ausência de luz nos primeiros dias favorece o enraizamento por diminuição da ação da AIA-oxidase. Observa-se que a regeneração final das plantas apresentou uma tendência linear decrescente ao longo de 3; 6; 9 e 12 dias no escuro. Por outro lado, observouse a necessidade de incubação no escuro, pois o período zero dias no escuro, apresentou baixíssima responsividade quando comparada aos períodos 3 e 6 dias. Além de maior número de plantas na regeneração final, o período de 3 dias de escuro se mostra interessante pelo fato de 3 dias ser um intervalo de tempo que pode evidenciar a eficiência do tratamento de desinfestação e consequente ocorrência de placas contaminadas, evitando assim, maiores prejuízos de tempo e mão de obra em processos posteriores de transformação genética. Porém, segundo Murashige (1974), a fotossíntese não é considerada atividade essencial para o desenvolvimento das plantas in vitro, porém, a luz é fundamental para a regulação dos processos morfogenéticos.

27 MB MRP MRP1 MRP Dias Escuro (MRP) 3 Dias Escuro (MS3K) 3 Dias Escuro (MS3C) 3 Dias Escuro (MS8) 6 Dias Escuro (MS3K) 6 Dias Escuro (MS3C) 6 Dias Escuro (MS8) 9 Dias Escuro (MS3K) 9 Dias Escuro (MS3C) 9 Dias Escuro (MS8) 12 Dias Escuro (MS3K) 12 Dias Escuro (MS3C) 12 Dias Escuro (MS8) Figura 2 - Número total de plantas regeneradas de 20 explantes finais de cana-de-açúcar (5 discos divididos em 4 explantes cada um) obtidos a partir de discos sem pré-indução [0 dias de escuro (diretamente na luz em MRP)] e pré-induzidos com 2,4-D em MS3K, MS3C e MS8 por 0; 3; 6; 9 e 12 dias no escuro, 30 dias em MRP na luz, transferidos e cultivados por mais 40 dias em meios finais de regeneração (MB, MRP, MRP1 e MRP2) na luz. (CEBTEC, 2011)

28 16 16 Tabela 3 - Número total de plantas regeneradas de 20 explantes finais de cana-de-açúcar (5 discos divididos em 4 explantes cada um) obtidos a partir de discos pré-induzidos com 2,4-D em MS3K, MS3C e MS8 por 3; 6; 9 e 12 dias no escuro, 30 dias em MRP na luz, repicados e cultivados por mais 40 dias em meios finais de regeneração (MS, MRP, MRP1 e MRP2) na luz. P: número de plantas pequenas (plantas de 0,5 a 1 cm). M: número de plantas de tamanho médio (1 a 3 cm). G: número de plantas de tamanho grande (3 a 6 cm). N.: número de plantas necrosadas (mortas). T: totais de plantas. Pré-indução 3 Dias escuro Pré-indução 6 Dias escuro Pré-indução 9 Dias escuro Pré-indução 12 Dias escuro Número de Brotos Número de Brotos Número de Brotos Número de Brotos Meios P M G N. T(P,M,G) P M G N. T(P,M,G) P M G N. T(P,M,G) P M G N. T(P,M,G) MB MRP MS3K MRP MRP T MB MRP MS3C MRP MRP T MB MRP MS8 MRP MRP T

29 17 17 Tabela 4 - Número total de plantas regeneradas de 20 explantes finais de cana-de-açúcar (5 discos divididos em 4 explantes cada um) obtidos a partir de discos sem pré-indução em 2,4-D, em MRP direto na luz e por 3 dias no escuro, 30 dias em MRP na luz, repicados e cultivados por mais 40 dias em meios finais de regeneração (MS, MRP, MRP1 e MRP2) na luz. P: número de plantas pequenas (plantas de 0,5 a 1 cm). M: número de plantas de tamanho médio (1 a 3 cm). G: número de plantas de tamanho grande (3 a 6 cm). N.: número de plantas necrosadas (mortas). T: totais de plantas Zero Dias 3 Dias Zero Dias 3 Dias Número de Brotos Número de Brotos Características Características Meios P M G N. T(P,M,G) P M G N. T(P,M,G) % E. N. Nº R. G. C. % E. N. Nº R. G. C. MB MRP MRP MRP MRP T

30 Tabela 5 Características regenerativas de 20 explantes finais de cana-de-açúcar (5 discos divididos em 4 explantes cada um) obtidos a partir de discos pré-induzidos com 2,4-D em MS3K, MS3C e MS8 por 3; 6; 9 e 12 dias no escuro, 30 dias em MRP na luz, repicados e cultivados por mais 40 dias em meios finais de regeneração (MB, MRP, MRP1 e MRP2) na luz. % E.N.: porcentagem de explantes necrosados. Nº R.: número total de raízes. G.C.: grau de formação de calos. Meios MS3K MS3KC MS8 % E.N. 3 Dias 6 Dias 9 Dias 12 Dias Características Características Características Características % % % Nº R. G. C. Nº R. G. C. Nº R. G. C. Nº R. G. C. E.N. E.N. E.N. MB MRP MRP MRP MB MRP MRP MRP MB MRP MRP MRP

31 Total P M G MB MRP MRP1 MRP2 MB MRP MRP1 MRP2 MB MRP MRP1 MRP2 MB MRP MRP1 MRP2 MB MRP MRP1 MRP2 Direto MRP zero Dias Escuro MS3K 3 Dias Escuro / MRP 30 Dias Luz MS3K 6 Dias Escuro / MRP 30 Dias Luz MS3K 9 Dias Escuro /MRP 30 Dias Luz MS3K 12 Dias Escuro / MRP 30 Dias Luz Figura 3 - Número total de plantas regeneradas de 20 explantes finais de cana-de-açúcar (5 discos divididos em 4 explantes cada um) obtidos a partir de discos sem pré-indução [0 dias de escuro (diretamente na luz em MRP)] e pré-induzidos com 2,4-D em MS3K por 0; 3; 6; 9 e 12 dias no escuro, 30 dias em MRP na luz, transferidos e cultivados por mais 40 dias em meios finais de regeneração (MB, MRP, MRP1 e MRP2) na luz. Total: número total de plantas por tratamento (20 explantes 5 discos divididos em 4 explantes). P: número de plantas pequenas (plantas de 0,5 a 1 cm). M: número de plantas de tamanho médio (1 a 3 cm). G: número de plantas de tamanho grande (3 a 6 cm). (CEBTEC, 2011)

32 Total P M G 50 0 MB MRP MRP1 MRP2 MB MRP MRP1 MRP2 MB MRP MRP1 MRP2 MB MRP MRP1 MRP2 MB MRP MRP1 MRP2 Direto MRP zero Dias Escuro MS3C 3 Dias Escuro / MRP 30 Dias Luz MS3C 6 Dias Escuro / MRP 30 Dias Luz MS3C 9 Dias Escuro / MRP 30 Dias Luz MS3C 12 Dias Escuro / MRP 30 Dias Luz Figura 4 - Número total de plantas regeneradas de 20 explantes finais de cana-de-açúcar (5 discos divididos em 4 explantes cada um) obtidos a partir de discos sem pré-indução [0 dias de escuro (diretamente na luz em MRP)] e pré-induzidos com 2,4-D em MS3C por 0; 3; 6; 9 e 12 dias no escuro, 30 dias em MRP na luz, transferidos e cultivados por mais 40 dias em meios finais de regeneração (MB, MRP, MRP1 e MRP2) na luz. Total: número total de plantas por tratamento (20 explantes 5 discos divididos em 4 explantes). P: número de plantas pequenas (plantas de 0,5 a 1 cm). M: número de plantas de tamanho médio (1 a 3 cm). G: número de plantas de tamanho grande (3 a 6 cm). (CEBTEC, 2011)

33 Total P M G MB MRP MRP1 MRP2 MB MRP MRP1 MRP2 MB MRP MRP1 MRP2 MB MRP MRP1 MRP2 MB MRP MRP1 MRP2 Direto MRP zero Dias Escuro MS8 3 Dias Escuro / MRP 30 Dias Luz MS8 6 Dias Escuro / MRP 30 Dias Luz MS8 9 Dias Escuro / MRP 30 Dias Luz MS8 12 Dias Escuro / MRP 30 Dias Luz Figura 5 - Número total de plantas regeneradas de 20 explantes finais de cana-de-açúcar (5 discos divididos em 4 explantes cada um) obtidos a partir de discos sem pré-indução [0 dias de escuro (diretamente na luz em MRP)] e pré-induzidos com 2,4-D em MS8 por 0; 3; 6; 9 e 12 dias no escuro, 30 dias em MRP na luz, transferidos e cultivados por mais 40 dias em meios finais de regeneração (MB, MRP, MRP1 e MRP2) na luz. Total: número total de plantas por tratamento (20 explantes 5 discos divididos em 4 explantes). P: número de plantas pequenas (plantas de 0,5 a 1 cm). M: número de plantas de tamanho médio (1 a 3 cm). G: número de plantas de tamanho grande (3 a 6 cm). (CEBTEC, 2011)

34 Meios de pré-indução com 2,4-D Os meios de cultura pré-indutivos MS3K e MS8 apresentaram resultados semelhantes e marcadamente melhores que MS3C em relação ao número total de plantas regeneradas no final do ciclo de regeneração (figura 2). Contudo, conforme resultados mostrados nas figuras 3, 4 e 5, os discos pré-induzidos em MS3K apresentaram maior predominância de plantas tipo médias e grandes. Assim sendo, é mais interessante a utilização do meio MS3K na pré-indução dos discos devido a baixa dosagem de 2,4-D, 3 mg.l -1 nessa formulação, contra 8 mg.l -1 em MS8. Além do maior risco de causar variação somaclonal e gerar maiores volumes de resíduos tóxicos. Doses elevadas de 2,4-D favorecem rápida proliferação de calos e formação de pró-embriões, estruturas multicelulares que, quando submetidas à transformação genética, podem gerar quimeras nas plantas regeneradas (GRATTAPAGLIA; MACHADO, 1990) Regeneração final de plantas Os primeiros brotos regenerados puderam ser visualizados depois de 20 dias de cultivo dos discos em MRP, na luz, como mostrado na figura 6. Observa-se que, simultaneamente ao surgimento dos brotos, ocorreu formação de calos. Os brotos foram visualizados principalmente nas pré-induções em MS3C e MS3K incubados por 3 e 6 dias no escuro. Na pré-indução em MS8 predominou a formação de calos. Esses resultados sugerem que procedimentos de transformações genéticas sejam realizados imediatamente depois de um período de 3 dias de incubação no escuro com pré-indução em 2,4-D, antes do início da formação de calos. O número total e classificação das plantas e as características das estruturas regenerativas, nos discos pré-induzidos com 2,4-D por 3; 6; 9 e 12 dias no escuro são mostrados na tabela 3. O mesmo é mostrado na mesma tabela para discos sem pré-indução com 2,4-D, ou seja, inoculados diretamente em MRP incubados por 0 e 3 dias na luz. Ambos cultivados por 30 dias em MRP na luz, divididos em 4 explantes e cultivados por mais 40 dias em MB, MRP, MRP1 e MRP2 na luz. Nas características regenerativas observou-se expressiva formação de calos e raízes. Essas características obtidas, podem ter sido consequencia dos altos níveis

35 23 de ANA (3,72 mg.l -1 ) no meio MRP, sugerindo sua diminuição para 1,86 mg. L -1, ou seja, mesma formulação do MRP1, cuja regeneração final das plantas, como mostrada na figura 1, apresentou número semelhante de plantas em relação aos melhores tratamentos. Para Fachinello et al. (1994), o aumento da concentração de auxinas aplicadas nos brotos provoca efeito estimulador de raízes até um certo valor, a partir do qual acréscimos maiores têm efeito inibitório. A concentração adequada depende da espécie e do teor da auxina existente nela. Figura 6 Características de responsividade na regeneração de plantas a partir de explantes iniciais (discos) pré-induzidos por 3; 6; 9 e 12 dias, no escuro, em MS3K, MS3C e MS8, transferidos para MRP e cultivados por 30 dias na luz. (CEBTEC, 2011)

36 24 6. CONCLUSÕES As melhores respostas regenerativas de plantas de discos de ponteiros de cana-de-açúcar, cultivar SP803280, foram observadas no tratamento com préindução com 2,4-D em MS3K, incubados em 3 dias no escuro, cultivados por 30 dias em MRP na luz, divisão dos discos em 4 explantes e cultivados por mais 40 dias na luz em MB.

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42 30 ANEXOS ANEXO A Hormônios vegetais e suas propriedades Hormônio Local de síntese Transporte Efeitos Auxinas (AIA, ANA, AIB, 2,4-D) Citocininas (cinetina, BAP, TDZ) Ácido Abscício (ABA) Etileno (C2H4) Meristema apical (caule), folhas jovens e sementes. Ápice das raízes, principalmente. Folhas maduras e em sementes. Muitos tecidos, especialmente tecidos submetidos à senescência e abscisão. Polarizado (do caule para as raízes), através do parênquima, de célula a célula. Via xilema, das raízes para o sistema. ABA é exportado a partir das folhas pelo floema. Sendo um gás, o etileno move-se por difusão do seu local de síntese. Estimula a elongação do caule e da raiz, atua no fototropismo e no geotropismo, causa a dominância apical sobre as gemas laterais do caule, atua no desenvolvimento dos frutos, induz a formação de raízes adventícias em estacas, inibe a abscisão de folhas e frutos, estimula a síntese de etileno. Afeta o crescimento e a diferenciação das raízes, quebra a dominância apical em gemas laterais (efeito oposto ao da auxina), estimula a divisão e o crescimento celulares, estimula a germinação e a floração, retarda o envelhecimento (cinetina é um tipo de citocinina). Inibe o crescimento; fecha os estômatos quando falta água; atua na quebra e dormência das sementes. Amadurecimento de frutos, senescência das folhas e flores; abscisão de folhas e frutos. Giberelinas Folhas jovens, em sementes imaturas e em raízes São livremente transportadas através do cilema e do floema Crescimento vegetativo das plantas com a quebra da dormência de gemas caulinares e de sementes de plantas de clima temperado; induzem a quebra da dormência; o florescimento de espécies que são induzidas a florescer por dias longos. Fonte: COLBAND Colégio Bandeirantes, 2011, modificado pela autora