ENTOMOLOGIA FORENSE Carlos Augusto Chamoun do Carmo 2 de setembro de 2014
ENTOMOLOGIA FORENSE CONCEITO BÁSICO É o estudo que relaciona o conhecimento sobre insetos a locais de crimes ou qualquer litígio judicial, ajudando a transformar vestígios brutos em evidências, materializando provas.
POR QUE USAR OS INSETOS???
The insects will tell you everything, people lie, but insects don't lie. Murray Marks ---forensic anthropologist, University of Tennessee
Número total de espécies animais Insects other arthropods Other animals
HISTÓRICO ENTOMOLOGIA FORENSE Sung Tz.u (1235, China)
HISTÓRICO ENTOMOLOGIA FORENSE - Jean Bergeret (1855): primeiro IPM - La Faune des Cadavres (1894) Jean Pierre Mégnin (1828-1905) Dividiu os insetos em oito legiões distintas
HISTÓRICO ENTOMOLOGIA FORENSE NO BRASIL - Roquete-Pinto (1908) - Oscar Freire (1914 1923) - A Entomologia Forense caiu no esquecimento - Monteiro-Filho & Penereiro 1987: ressurgimento Estudo da decomposição e sucessão sobre uma carcaça animal numa área do estado de São Paulo, Brasil
HISTÓRICO ENTOMOLOGIA FORENSE... NO BRASIL A PARTIR DE 1987 - Consolidação de pesquisa em algumas instituições acadêmicas - Unicamp e Unesp - SP - ICCE e Fiocruz - RJ - UFPR; UNB; Polícia Técnica da BA; UFPE e INPA
ENTOMOLOGIA FORENSE HISTÓRICO... NO BRASIL A PARTIR DE 1987 - Grupos mais recentes: MG, AP e GO - Em breve no ES OBS: Ainda existe grande distância entre a Perícia Oficial e a área acadêmica no Brasil.
ENTOMOLOGIA FORENSE - Diversos centros renomados de investigação, como o FBI (Federal Bureau Investigation) dos EUA. Prédio do FBI.
ENTOMOLOGIA FORENSE - CSI: Início no ano 2000, nos EUA, e em 2001 no BR. SUCESSO DE AUDIÊNCIA LÁ E AQUI VANTAGEM OU DESVANTAGEM???? BOM OU RUIM PARA A PERÍCIA???
ENTOMOLOGIA FORENSE - Podemos dividir em: Entomologia Urbana Produtos Estocados Médico-Legal / Criminal
- URBANA Cupim de madeira ENTOMOLOGIA FORENSE
- URBANA Cupim de parede ENTOMOLOGIA FORENSE
- PRODUTOS ESTOCADOS ENTOMOLOGIA FORENSE Sitophilus zeamais (Besouro do caruncho)
- PRODUTOS ESTOCADOS ENTOMOLOGIA FORENSE
- PRODUTOS ESTOCADOS ENTOMOLOGIA FORENSE
ENTOMOLOGIA FORENSE - MÉDICO-LEGAL / CRIMINAL GRANDE INTERESSE GERAL GRANDE REPERCUSSÃO PÚBLICA GRANDE APELO SOCIAL A MORTE CHAMA A ATENÇÃO DE TODOS
ESTUPRO MAUS TRATOS SEQUESTRO HOMICÍDIO QUEM É A VÍTIMA? QUEM É O AUTOR? QUANDO FOI A MORTE?
ENTOMOLOGIA FORENSE - MÉDICO-LEGAL / CRIMINAL O Brasil tem um dos maiores índices de homicídio do planeta
Taxa de homicídios no Brasil entre1998 e 2012 Permanecemos em 2 o lugar FONTE: Mapa da Violência 2014
MAUS TRATOS Miíase em idosa - Escabiose; - Pediculose; - Miíase - Larvas e pupas nas fezes
Crianças negligenciadas
Idosos negligenciados
Como se deu a morte
Onde a morte ocorreu Cidade Campo Mesembrinella bellardiana
- Quando a morte ocorreu (IPM) Há quanto tempo o indivíduo é um cadáver???
... NA MEDICINA LEGAL, TEMOS: Tanatologia Forense Conceito - A Tanatologia médico-legal ou forense é o ramo da medicina legal que estuda o morto e a morte, assim como os fenômenos dela decorrentes.
Rigidez cadavérica -Músculos mandibulares Instalação -Músculos do pescoço - Músculos do tórax - Membros superiores - Músculos do abdome - Membros inferiores
Livores cadavéricos e hipóstases
Putrefação - Fase da coloração
Putrefação - Fase gasosa (Enfizematosa)
Putrefação - Fase gasosa (Enfizematosa) Circulação pós-morte
Putrefação - Fase gasosa (Enfizematosa) Circulação pós-morte
Putrefação Fase coliquativa
Putrefação Fase de esqueletização
... GRANDE PROBLEMA na Medicina Legal VARIAÇÃO ENORME DO INTERVALO DE CADA ESTÁGIO Diversos fatores influenciam: - Local, clima, vegetação e umidade; - Idade e tamanho da vítima; - Proporção corporal; - Hábitos da vítima; Quanto maior o tempo de morte, menor a fidelidade do resultado.
Vantagens do IPM com a Entomologia Forense VARIAÇÃO MUITO MENOR Quanto maior o tempo de morte, maior a fidelidade do resultado.
Classificação da fauna associada a Cadáveres Necrófagos: Dípteros Muscóides (Moscas) e Coleópteros (Besouros); Onívoros: Himenópteros (Formigas e Vespas) e alguns Coleópteros ; Parasitas e Predadores: Himenópteros, Coleópteros, Dípteros Muscóides e Dermápteros (Tesourinha); Acidentais: Aracnídeos, Quilópodes, entre outros.
Holometabolia: metamorfose completa (mais de 80% das espécies) Ovo Larva Pupa - Adulto Ex: Lepidoptera (mariposas); Coleoptera (besouros) Diptera (moscas); Hymenoptera (vespas)
Principal entomofauna cadavérica - Principais ordens de interesse forense 2 ORDENS Diptera (moscas) Coleoptera (besouros)
Famílias principais de Diptera Caliphoridae Sarcophagidae Muscidae
Ordem Diptera Família Caliphoridae (a mais importante) Chrysomya putoria Chrysomya megacephala Chrysomya albiceps Sarconesia chlorogaster Mesembrinella bellardiana Hemilucilia segmentaria
Ordem Diptera Família Sarcophagidae
Ordem Diptera Família Sarcophagidae - Segunda família de maior importância forense. Sarcophaga sp. Ravinia sp. Oxysarcodexia sp. Peckia sp.
Família Muscidae Musca domestica Ordem Diptera Graphomya sp Atherigona orientalis Ophyra aenensces Morellia sp. Synthesiomya nudiseta
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO Pesquisa de doutorado (2010-2014) MUSEU NACIONAL Recuperação e Identificação de DNA humano Y-STR, in vitro e in situ, a partir de imaturos das principais espécies de moscas encontradas em cadáveres no Brasil e no sul dos EUA Carlos Augusto Chamoun do Carmo Márcia Souto Couri Janyra Oliveira Costa
INTRODUÇÃO Entomologia Forense Aplicação de conhecimentos sobre insetos em casos judiciais Genética Forense Estudo do DNA e técnicas moleculares aplicados a análises de vestígios biológicos relacionados à área judicial Entomogenética Forense
RELEVÂNCIA DO ESTUDO - 1 em 14 mulheres é estuprada no mundo (Abrahams et al. 2014). - Anuário de Segurança Pública: em 2011 foram 43.869 mulheres estupradas e em 2012 51.121 estupros. - RJ, 2012: 6.029 notificações, ou seja, 36,9 por 100 mil habitantes - SSP de SP: 1 estupro a cada 40 minutos. - IPEA: entre 2009 e 2011 quase 17 mil feminicídios no Brasil, ou seja, 5.664 por ano (um em cada 90 minutos). - Muitas vítimas de estupro são assassinadas e encontradas dias depois, já em decomposição - Vítimas em decomposição: quase não se encontram provas - Muitos suspeitos inocentes (grande exposição social)
OBJETIVOS - Contribuir com a Perícia Oficial do Brasil para a materialização de provas contra autores de crimes sexuais - Contribuir para a formação de um Procedimento Operacional Padrão (POP) nas polícias científicas do Brasil e de outros países. - Aproximar cada vez mais as áreas pericial e acadêmica
MATERIAL E MÉTODOS 2011 - EXPERIMENTO IN VITRO NO BRASIL ETAPA ENTOMOLÓGICA ETAPA MOLECULAR 2012 - EXPERIMENTO IN SITU NO BRASIL ETAPA ENTOMOLÓGICA ETAPA MOLECULAR 2013/14 - EXPERIMENTO IN VITRO NOS EUA ETAPA ENTOMOLÓGICA ETAPA MOLECULAR
MATERIAL E MÉTODOS EXPERIMENTO IN VITRO NO BRASIL ETAPA ENTOMOLÓGICA - Laboratório de Diptera Museu Nacional/UFRJ (Dra. Márcia Couri) - Laboratório de Entomologia Forense do ICCE PC/RJ (Dra. Janyra) ETAPA MOLECULAR - Laboratório de DNA do IPPGF PC/RJ (Dr. Rodrigo Grazinoli)
MATERIAL E MÉTODOS EXPERIMENTO IN SITU NO BRASIL ETAPA ENTOMOLÓGICA - Laboratório de Diptera Museu Nacional/UFRJ (Dra. Márcia Couri) -Laboratório de Entomologia Forense do ICCE PC/RJ (Dra. Janyra) - Área de mata do Batalhão CFA PM/ES ETAPA MOLECULAR - Laboratório de DNA do IPPGF PC/RJ (Dr. Rodrigo Grazinoli)
MATERIAL E MÉTODOS EXPERIMENTO IN VITRO NOS EUA ETAPA ENTOMOLÓGICA - Laboratory of Forensic Entomology, Department of Biological Science, Florida International University - FIU (Dr. Jeffrey Wells) ETAPA MOLECULAR - Crime Laboratory / CSI of Miami Dade Police (Dr. Jeffrey Johnson)
MATERIAL E MÉTODOS DIPTERA UTILIZADO NAS ETAPAS ENTOMOLÓGICAS NO BRASIL - Adultos e imaturos de Chrysomya albiceps a b Larva (a) e adulto (b) de Chrysomya albiceps.
MATERIAL E MÉTODOS DIPTERA UTILIZADO NAS ETAPAS ENTOMOLÓGICAS NO BRASIL - Adultos e imaturos de Chrysomya albiceps Predominância Voracidade Fácil diferenciação
MATERIAL E MÉTODOS EXPERIMENTO IN VITRO NO BRASIL
MATERIAL E MÉTODOS ETAPA ENTOMOLÓGICA IN VITRO NO BRASIL Laboratório de Entomologia Forense do ICCE, da Polícia Civil - RJ - 600 g de carne moída + 3,0 ml de sêmen - Estímulo à oviposição em carne moída: potes protegidos da luz - Coletas de imaturos a cada 24h de decomposição Potes de plástico, com carne (e sêmen) para oviposição das moscas Potes de plástico no interior da gaiola
MATERIAL E MÉTODOS ETAPA ENTOMOLÓGICA IN VITRO NO BRASIL Laboratório de Entomologia Forense do ICCE, da Polícia Civil - RJ - Criação de adultos com água ad libitum e mel (50%). Gaiola para criação de moscas.
MATERIAL E MÉTODOS ETAPA ENTOMOLÓGICA IN VITRO NO BRASIL Laboratório de Entomologia Forense do ICCE, da Polícia Civil - RJ - Pote após 192h (8 dias) de decomposição Potes de plástico com larvas e pupas
MATERIAL E MÉTODOS ETAPA ENTOMOLÓGICA IN VITRO NO BRASIL Laboratório de Entomologia Forense do ICCE, da Polícia Civil - RJ - Coleta das larvas e pupas a cada 24 horas (a partir do 2º dia) Frascos com álcool 70%, para armazenamento das larvas e pupas coletadas.
Laboratório de Entomologia Forense do ICCE, da Polícia Civil - RJ - Dissecação dos imaturos MATERIAL E MÉTODOS ETAPA ENTOMOLÓGICA IN VITRO NO BRASIL
MATERIAL E MÉTODOS ETAPA ENTOMOLÓGICA IN VITRO NO BRASIL Laboratório de Entomologia Forense do ICCE, da Polícia Civil - RJ - Material do trato digestório dos imaturos Frascos de Eppendorf com o trato gastrintestinal das larvas, em álcool 70%
MATERIAL E MÉTODOS ETAPA MOLECULAR IN VITRO NO BRASIL Laboratório de Genética Forense (IPPGF), da Polícia Civil- RJ TRÊS SEQUÊNCIAS FUNDAMENTAIS 1 Extração do DNA 2 Amplificação do DNA 3 Eletroforese capilar
Extração de DNA pela técnica de fenol-clorofórmio MATERIAL E MÉTODOS ETAPA MOLECULAR IN VITRO NO BRASIL Laboratório de Genética Forense (IPPGF), da Polícia Civil- RJ 1 Extração do DNA
MATERIAL E MÉTODOS ETAPA MOLECULAR IN VITRO NO BRASIL Laboratório de Genética Forense (IPPGF), da Polícia Civil- RJ 1 Extração do DNA - Técnica de fenol-clorofórmio DNA Eppendorf com partição do DNA na fase aquosa (superior)
MATERIAL E MÉTODOS ETAPA MOLECULAR IN VITRO NO BRASIL Laboratório de Genética Forense (IPPGF), da Polícia Civil- RJ APÓS A EXTRAÇÃO, FOI FEITA A QUANTIFICAÇÃO DE DNA TOTAL Diluições para valores próximos de 1,0 ng/µl
MATERIAL E MÉTODOS ETAPA MOLECULAR IN VITRO NO BRASIL Laboratório de Genética Forense (IPPGF), da Polícia Civil- RJ 2 - Amplificação do DNA por PCR 1) DNA alvo (molde) 2) Primers (oligonucleotídeos) 3) dntps 4) DNA Polymerase termoestável 5) Mg ++ ions 6) Solução tampão
MATERIAL E MÉTODOS ETAPA MOLECULAR IN VITRO NO BRASIL Laboratório de Genética Forense (IPPGF), da Polícia Civil- RJ 2 - Amplificação do DNA por PCR 1. Adição de reagentes Taq polimerase Primers Tampão Água DNA datp dctp dgtp dttp (nucleotideos)
MATERIAL E MÉTODOS ETAPA MOLECULAR IN VITRO NO BRASIL Laboratório de Genética Forense (IPPGF), da Polícia Civil- RJ 2 - Amplificação do DNA por PCR 1. Adição de reagentes Taq polimerase Primers Tampão Água DNA datp dctp dgtp dttp (nucleotideos) 94ºC DENATURAÇÃO 2. Alternância de temperaturas (Termociclador)
2 - Amplificação do DNA por PCR Taq polimerase Primers Tampão Água MATERIAL E MÉTODOS ETAPA MOLECULAR IN VITRO NO BRASIL Laboratório de Genética Forense (IPPGF), da Polícia Civil- RJ 1. Adição de reagentes DNA datp dctp dgtp dttp (nucleotideos) 94ºC DENATURAÇÃO 57ºC ANELAMENTO 2. Alternância de temperaturas (Termociclador)
MATERIAL E MÉTODOS ETAPA MOLECULAR IN VITRO NO BRASIL Laboratório de Genética Forense (IPPGF), da Polícia Civil- RJ 2 - Amplificação do DNA por PCR 1. Adição de reagentes Taq polimerase Primers Tampão Água DNA datp dctp dgtp dttp (nucleotideos) 94ºC 57ºC 72ºC DESNATURAÇÃO ANELAMENTO EXTENSÃO 2. Alternância de temperaturas (Termociclador) 25-40 (35) CICLOS http://www.roche.pt/portugal/index.cfm/produtos/equipamentos-de-diagnostico/products/molecular-diag/intro-pcr/
MATERIAL E MÉTODOS ETAPA MOLECULAR IN VITRO NO BRASIL Laboratório de Genética Forense (IPPGF), da Polícia Civil- RJ 2 - Amplificação do DNA por PCR Termociclador Programa específico Yfiler
2 - Amplificação do DNA por PCR
MATERIAL E MÉTODOS ETAPA MOLECULAR IN VITRO NO BRASIL Laboratório de Genética Forense (IPPGF), da Polícia Civil- RJ 2 - Amplificação do DNA por PCR Esquema mostrando amplificação do DNA
MATERIAL E MÉTODOS ETAPA MOLECULAR IN VITRO NO BRASIL Laboratório de Genética Forense (IPPGF), da Polícia Civil- RJ 3 - Eletroforese capilar para análise Y-STR Analisador genético ABI 3100 Avant
MATERIAL E MÉTODOS ETAPA MOLECULAR IN VITRO NO BRASIL Laboratório de Genética Forense (IPPGF), da Polícia Civil- RJ 3 - Eletroforese capilar para análise Y-STR
MATERIAL E MÉTODOS ETAPA MOLECULAR IN VITRO NO BRASIL 3 - Eletroforese capilar para análise Y-STR
RESULTADOS E DISCUSSÃO EXPERIMENTO IN VITRO NO BRASIL Número de imaturos dissecados Tempo de Decomposição Número de imaturos 48 horas (2º dia) 15 larvas e 00 pupas 72 horas (3º dia) 14 larvas e 00 pupas 96 horas (4º dia) 14 larvas e 00 pupas 120 horas (5º dia) 15 larvas e 00 pupas 144 horas (6º dia) 13 larvas e 00 pupas 168 horas (7º dia) 08 larvas e 12 pupas 192 horas (8º dia) 02 larvas e 13 pupas TOTAL 8 dias 81 larvas e 15 pupas = 96
RESULTADOS E DISCUSSÃO EXPERIMENTO IN VITRO NO BRASIL Eletroferograma Y-STR/48h (2º DIA)
RESULTADOS E DISCUSSÃO EXPERIMENTO IN VITRO NO BRASIL Eletroferograma Y-STR/72h (3º DIA)
RESULTADOS E DISCUSSÃO EXPERIMENTO IN VITRO NO BRASIL Eletroferograma Y-STR/120h (5º DIA)
RESULTADOS E DISCUSSÃO EXPERIMENTO IN VITRO NO BRASIL Eletroferograma Y-STR/144h (6º DIA)
RESULTADOS E DISCUSSÃO EXPERIMENTO IN VITRO NO BRASIL Eletroferograma Y-STR/192h (8º DIA)
DYS448 20 20 20 20 20 RESULTADOS E DISCUSSÃO EXPERIMENTO IN VITRO NO BRASIL # 15 regiões amplificadas em 16. # Melhores resultados: amostras de maior decomposição. # Locais amplificados com total compatibilidade alélica com a amostra de referência # Não houve perfil de mistura # Técnica tem grande potencial para aplicabilidade pericial Locais Genéticos Alelos das Amostras Haplótipo Haplótipo de 48h 72h 120h 144h 192h Questionado Referência DYS456 16 16 16 16 16 16 DYS389 I 14 14 14 14 14 14 DYS390 23 23 23 23 DYS389 II 30 30 30 DYS458 15 15 15 15 15 15 DYS19 16 DYS385 15 15 15 15 DYS393 14 14 14 14 14 14 14 DYS391 10 10 10 10 10 10 DYS439 12 12 12 DYS635 22 22 22 22 DYS392 12 12 12 12 GATA H4 11 11 11 11 11 DYS437 15 15 15 15 15 15 15 DYS438 8 8 8 8 8
MATERIAL E MÉTODOS EXPERIMENTO IN SITU NO BRASIL
MATERIAL E MÉTODOS ETAPA ENTOMOLÓGICA IN SITU NO BRASIL Batalhão CFA da PM-ES Modelo animal: porca da espécie Sus scrofa 3 ou 4 disparos de arma de fogo no animal, a curta distância
MATERIAL E MÉTODOS ETAPA ENTOMOLÓGICA IN SITU NO BRASIL Batalhão CFA da PM-ES Seringa com sêmen Dípteros pousando na carcaça segundos após a morte Inoculação de 3,0 ml de sêmen na região anal e vaginal da porca (com 15kg)
MATERIAL E MÉTODOS ETAPA ENTOMOLÓGICA IN SITU NO BRASIL Batalhão CFA da PM-ES
MATERIAL E MÉTODOS ETAPA ENTOMOLÓGICA IN SITU NO BRASIL Batalhão CFA da PM-ES Jaula de metal, forrada com tela de pinteiro
Amostra 48h (2º dia de decomposição) MATERIAL E MÉTODOS ETAPA ENTOMOLÓGICA IN SITU NO BRASIL Batalhão CFA da PM-ES - Coleta de imaturos a cada 24h, até 14 dias de decomposição
MATERIAL E MÉTODOS ETAPA ENTOMOLÓGICA IN SITU NO BRASIL Batalhão CFA da PM-ES Amostra 288h (12º dia de decomposição)
MATERIAL E MÉTODOS ETAPA ENTOMOLÓGICA IN SITU NO BRASIL Batalhão CFA da PM-ES Frascos com álcool 70%, para armazenamento das larvas e pupas coletadas.
MATERIAL E MÉTODOS ETAPA ENTOMOLÓGICA IN SITU NO BRASIL Batalhão CFA da PM-ES
MATERIAL E MÉTODOS ETAPA ENTOMOLÓGICA IN SITU NO BRASIL Laboratório de Entomologia Forense do ICCE - RJ Dissecação do imaturo
MATERIAL E MÉTODOS ETAPA ENTOMOLÓGICA IN SITU NO BRASIL Laboratório de Entomologia Forense do ICCE - RJ - Material do trato digestório dos imaturos TAMPÃO DE EXTRAÇÃO Frascos de Eppendorf com o trato gastrintestinal das larvas
MATERIAL E MÉTODOS ETAPA MOLECULAR IN SITU NO BRASIL Laboratório de Genética Forense (IPPGF) - RJ TRÊS SEQUÊNCIAS FUNDAMENTAIS 1 Extração do DNA 2 Amplificação do DNA 3 Eletroforese capilar
MATERIAL E MÉTODOS ETAPA MOLECULAR IN SITU NO BRASIL Laboratório de Genética Forense (IPPGF) - RJ - Além da extração por fenol-clorofórmio, também foi utilizada... DNA Eppendorf com partição do DNA na fase aquosa (superior)
MATERIAL E MÉTODOS ETAPA MOLECULAR IN SITU NO BRASIL Laboratório de Genética Forense (IPPGF) - RJ Resina magnética (Kit IQ) Ultrafiltração em Microcon
MATERIAL E MÉTODOS ETAPA MOLECULAR IN SITU NO BRASIL Laboratório de Genética Forense (IPPGF) - RJ APÓS A EXTRAÇÃO, FOI FEITA A QUANTIFICAÇÃO DO DNA Diluições para valores próximos de 1,0 ng/µl
RESULTADOS E DISCUSSÃO EXPERIMENTO IN SITU NO BRASIL
RESULTADOS E DISCUSSÃO EXPERIMENTO IN SITU NO BRASIL Tempo de Decomposição Número de imaturos 96 horas (4º dia) 51 larvas e 00 pupas 120 horas (5º dia) 53 larvas e 00 pupas 144 horas (6º dia) 76 larvas e 00 pupas 168 horas (7º dia) 28 larvas e 00 pupas 192 horas (8º dia) 32 larvas e 00 pupas 216 horas (9º dia) 48 larvas e 01 pupa 240 horas (10º dia) 11 larvas e 28 pupas 264 horas (11º dia) 00 larvas e 18 pupas 288 horas (12º dia) 00 lavras e 23 pupas 312 horas (13º dia) 00 larvas e 57 pupas 336 horas (14º dia) 00 larvas e 20 pupas TOTAL 14 dias 289 larvas e 157 pupas = 446
RESULTADOS E DISCUSSÃO EXPERIMENTO IN SITU NO BRASIL Eletroferograma Y-STR / 144h (6º dia)
RESULTADOS E DISCUSSÃO EXPERIMENTO IN SITU NO BRASIL Eletroferograma Y-STR / 288h (12º dia)
RESULTADOS E DISCUSSÃO EXPERIMENTO IN SITU NO BRASIL Eletroferograma Y-STR / 336h (14º dia)
Locais Genéticos Horários e Alelos das Amostras 144h 168h 192h 216h 240h 288h 312h 336h Haplótipo Questionado Haplótipo de Referência DYS456 16 16 16 16 16 16 DYS389 I 14 14 14 DYS390 23 DYS389 II 30 30 30 DYS458 15 15 15 15 15 DYS19 16 DYS385 15 15 15 DYS393 14 DYS391 10 DYS439 12 12 12 12 DYS635 22 22 22 DYS392 12 12 12 GATA H4 11 DYS437 15 DYS438 8 DYS448 20
RESULTADOS E DISCUSSÃO EXPERIMENTO IN SITU NO BRASIL - Amplificação de 8 regiões de interesse, na união dos horários - Locais alélicos amplificados compatíveis com a amostra referência - Não houve perfil de mistura - CODIS tem exigência mínima de 7 locais amplificados para Y-STR - Dificuldades analíticas bem maiores do que nos testes in vitro - Necessidade de mais ajustes dos protocolos para uso in situ - Técnica tem grande potencial para aplicabilidade pericial
MATERIAL E MÉTODOS EXPERIMENTO IN VITRO NOS EUA
UNITED STATE OF AMERICA (USA) 2013 / 2014 - Florida International University (FIU) Dr. Jeffrey Wels
UNITED STATE OF AMERICA (USA) 2013 / 2014 - Miami Dade Police: Crime Lab / CSI MIAMI Dr. Jeffrey Johnson 113
MATERIAL E MÉTODOS EXPERIMENTO IN VITRO NOS EUA - Espécie predominante em cadáveres na região: Chrysomya megacephala a b Larva (a) e adulto (b) de C. megacephala
MATERIAL E MÉTODOS ETAPA ENTOMOLÓGICA IN VITRO NOS EUA Laboratory of Forensic Entomology, Florida International University - FIU - Estímulo à oviposição em frascos específicos - 600 g de carne moída + 3,0 ml de sêmen - Coletas de imaturos a cada 24h de decomposição, por 14 dias. Potes específicos para oviposição Potes de plástico, com carne (e sêmen) para onde os ovos foram transferidos
MATERIAL E MÉTODOS ETAPA ENTOMOLÓGICA IN VITRO NOS EUA Laboratory of Forensic Entomology, Florida International University - FIU - Uso de gaiolas entomológicas Gaiola entomológica metálica, usada no laboratório americano
MATERIAL E MÉTODOS ETAPA ENTOMOLÓGICA IN VITRO NOS EUA Laboratory of Forensic Entomology, Florida International University - FIU - Armazenamento dos imaturos de C. megacephala. Tubos Falcon com álcool 70% Larvas no tubos Falcon com álcool 70%
MATERIAL E MÉTODOS ETAPA ENTOMOLÓGICA IN VITRO NOS EUA Laboratory of Forensic Entomology, Florida International University - FIU - Retirada visceral dos imaturos de C. megacephala. Dissecação ventral postero-anterior de C. megacephala Transferência das vísceras para frascos Eppendorf com tampão de extração
MATERIAL E MÉTODOS ETAPA MOLECULAR IN VITRO NOS EUA Crime Laboratory / CSI of Miami Dade Police 1 Extração do DNA 2 Amplificação do DNA 3 Eletroforese capilar
1 Extração do DNA MATERIAL E MÉTODOS ETAPA MOLECULAR IN VITRO NOS EUA Crime Laboratory / CSI of Miami Dade Police - Extração baseada em partículas magnéticas Large Volum Protocol Tubo específico 20 µl de proteinase K, mantida em temperatura ambiente Equipamento EZ1 Advanced XL, da Qiagen
MATERIAL E MÉTODOS ETAPA MOLECULAR IN VITRO NOS EUA Crime Laboratory / CSI of Miami Dade Police Quantificação específica DNA Y humano Equipamento 7500 Real Time PCR System (Life Technologies)
MATERIAL E MÉTODOS ETAPA MOLECULAR IN VITRO NOS EUA Crime Laboratory / CSI of Miami Dade Police Concentração de DNA Concentração de DNA membrana ultrafiltrante Microcon
MATERIAL E MÉTODOS ETAPA MOLECULAR IN VITRO NOS EUA Crime Laboratory / CSI of Miami Dade Police 2 Amplificação do DNA por PCR Termociclador GeneAmp PCR System 9700
MATERIAL E MÉTODOS ETAPA MOLECULAR IN VITRO NOS EUA Crime Laboratory / CSI of Miami Dade Police 3- Eletroforese capilar Aparelho ABI 3130, para eletroforese capilar no Crime Lab
RESULTADOS E DISCUSSÃO EXPERIMENTO IN VITRO NOS EUA Tempo de Decomposição Número de imaturos 72 horas (3º dia) 15 larvas e 00 pupas 96 horas (4º dia) 16 larvas e 00 pupas 120 horas (5º dia) 16 larvas e 00 pupas 144 horas (6º dia) 18 larvas e 00 pupas 168 horas (7º dia) 17 larvas e 03 pupas 192 horas (8º dia) 15 larvas e 04 pupas 216 horas (9º dia) 16 larvas e 04 pupa 240 horas (10º dia) 15 larvas e 05 pupas 264 horas (11º dia) 08 larvas e 07 pupas 288 horas (12º dia) 11 larvas e 06 pupas 312 horas (13º dia) 06 larvas e 09 pupas 336 horas (14º dia) 00 larvas e 15 pupas TOTAL 14 dias 155 larvas e 53 pupas = 208
RESULTADOS E DISCUSSÃO EXPERIMENTO IN VITRO NOS EUA Eletroferograma Y-STR/72h (3º DIA)
RESULTADOS E DISCUSSÃO EXPERIMENTO IN VITRO NOS EUA Eletroferograma Y-STR/120h (5º DIA)
RESULTADOS E DISCUSSÃO EXPERIMENTO IN VITRO NOS EUA Eletroferograma Y-STR/168h (7º DIA)
RESULTADOS E DISCUSSÃO EXPERIMENTO IN VITRO NOS EUA Eletroferograma Y-STR/216h (9º DIA)
RESULTADOS E DISCUSSÃO EXPERIMENTO IN VITRO NOS EUA LOCAIS GENÉTICOS 72h (3º dia) 120h (5º dia) HORÁRIOS E ALELOS DAS AMOSTRAS 168h (7º dia) 216h (9º dia) Haplótipo Querstionado Haplótipo de Referência # 16 regiões amplificadas em 16 # Extração eficiente # Compatibilidade alélica com a amostra de referência # Sem perfil de mistura # Locais com menor e maior amplificação # Técnica pode ser usada em países diferentes DYS456 16 16 16 16 16 DYS389 I 14 14 14 14 14 DYS390 23 23 23 23 23 DYS389 II 30 30 30 30 DYS458 15 15 15 15 15 15 DYS19 16 16 16 16 16 DYS385 15 15 15 15 15 DYS393 14 14 14 14 14 14 DYS391 10 10 10 10 10 10 DYS439 12 12 12 12 DYS635 22 22 22 22 22 DYS392 12 12 12 12 12 GATA H4 11 11 11 11 11 DYS437 15 15 15 15 15 15 DYS438 8 8 8 8 8 DYS448 20 20 20 20 20
CONCLUSÕES DA PESQUISA DO DOUTORADO A recuperação e identificação de DNA Y-STR humano, a partir de imaturos de Diptera é plenamente possível. Houve sucesso nas amplificações nos três experimentos realizados nesse estudo: in vitro e in situ no Brasil e in vitro nos EUA. Os resultados dos testes no Brasil e nos EUA, reforçam a grande potencialidade dessa técnica na aplicação criminal. É necessária a continuidade dos estudos para o aprimoramento da técnica. A quantidade mínima e máxima de imaturos coletados deve ser alvo de mais pesquisas, adequando-se à prática pericial.
PERICIA CRIMINAL = PROVAS MATERIAIS Sem provas não há inocentes nem culpados OBRIGADO A TODOS biochamoun@gmail.com