E SE UM BLOOM DE CIANOBACTÉRIAS TE BATESSE À PORTA? Trabalhos experimentais desenvolvidos com Microcystis aeruginosa

E SE UM BLOOM DE CIANOBACTÉRIAS TE BATESSE À PORTA? Trabalhos experimentais desenvolvidos com Microcystis aeruginosa Bruno Miguel Pratas dos Santos Poeira Fernando Miguel Caetano Biscaia Fraga 2010

E SE UM BLOOM DE CIANOBACTÉRIAS TE BATESSE À PORTA? Trabalhos experimentais desenvolvidos com Microcystis aeruginosa Bruno Miguel Pratas dos Santos Poeira Fernando Miguel Caetano Biscaia Fraga Revisão científica: Ana Maniés de Oliveira Escola Secundária de Pedro Alexandrino Póvoa de Santo Adrião Odivelas 2010

A todos aqueles que tentaram sem sucesso, que lutaram e fracassaram, mas que nos deram ferramentas para hoje podermos continuar a lutar e a evoluir.

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Agradecimentos Um trabalho deste género é sempre fruto do esforço individual e colectivo de um grande número de pessoas, muito para além dos autores. Devemos pois agradecer publicamente a todos os que nos ajudaram e incentivaram ao longo desta jornada, zelando para que nunca nos afastássemos do caminho traçado, e para que nunca desistíssemos ou abandonássemos o nosso projecto. Seria impossível referir todos os que nos apoiaram, no entanto, sentimos necessidade de salientar algumas pessoas e instituições pela forma especial como nos acolheram e pelo tempo que investiram neste trabalho, que, no fundo, também é delas. Devemos pois, um agradecimento especial...... À Professora Ana Maniés Oliveira, por todos os serões passados em laboratório, por todos os fins-de-semana e férias interrompidos com um sem-número de dúvidas, pelo apoio na redacção deste livro, pelo apoio científico e por toda a dedicação à nossa utopia. Mais do qualquer outro, este é um projecto seu.... Ao Professor Luís Ferreira, pela infinita disponibilidade e paciência que demonstrou ao ensinar-nos repetidamente a utilizar todo o software e hardware necessários à contagem das cianobactérias, através do microscópio óptico digital, necessários à redacção e ao dactilografar profissional de texto, além de todo o apoio e força nos acabamentos e arranjos finais deste livro.... À Professora Doutora Conceição Raimundo, da Faculdade de Ciências da Universidade Nova de Lisboa, por nos ter recebido, e por todos os materiais fornecidos e informações disponibilizadas que tanto ajudaram na criação deste livro e montagem do site que o complementa.... À Professora Doutora Vanda Brotas, da Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, por nos ter recebido e permitido gravar uma entrevista sobre o tema, pelas informações complementares fornecidas e por todos os materiais facultados. v

... Ao Professor Doutor Ricardo de Melo, da Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, pelas informações prestadas e por ter salientado a importância das condições do meio no crescimento e estabilização da cultura de Microcystis aeruginosa.... À Direcção Executiva e Assistentes Operacionais da Escola Secundária de Pedro Alexandrino, nas pessoas da Professora Rosário Ferreira e toda a sua equipa, bem como das Senhoras Dona Glória Barros e Dona Adelaide Broco, por todo o apoio logístico, pelos materiais laboratoriais disponibilizados e pela mente aberta, que nos permitiu manter o laboratório durante um mês, ininterruptamente, com condições ideais de luz, calor e oxigenação, tão necessárias para o sucesso da actividade experimental. Também por nunca se cansarem de nós, e por, fim de-semana após fim-de-semana, se deslocarem à escola, permitindo-nos a realização da recolha de amostras e a resolução de todos os assuntos de que seria impossível tratar durante a semana.... À Direcção da revista SuperInteressante, na pessoa do Dr. Carlos Madeira, por, apesar de não terem artigos publicados sobre o tema, nos ter indicado diversos locais onde procurar, e efectivamente obter, informação sobre o mesmo.... Ao Washington State Department of Health (Departamento de Saúde do Estado de Washington) na pessoa do Dr. Robert Bob Clark, por todo o apoio e materiais fornecidos ao nosso projecto.... Às nossas famílias, que suportaram estoicamente a nossa ausência em fins-de-semana e jantares de família, durante noites inteiras e serões infindáveis, durante os quais nos ocupámos da realização das actividades experimentais aqui descritas, e da redacção deste livro. Um grande obrigado a todos vós... Sem o vosso apoio nada disto seria possível... vi

Prefácio Considero que o trabalho que este prefácio pretende apresentar reflecte, clara e inequivocamente, que é possível desenvolver nas escolas, com os nossos alunos, actividades educativas interessantes, exigentes, que constituam variações às práticas comuns, com uma efectiva vertente experimental e de descoberta, se forem reunidas determinadas condições, que para além de uma verdadeira mobilização de toda a comunidade escolar, facilitadora da concretização dos trabalhos e potenciadora da obtenção de bons resultados, incluem obrigatoriamente alunos motivados, eficazes, empenhadíssimos, dispostos a investir todo o esforço, trabalho, tempo e persistência, que são imprescindíveis à prossecução de todo e qualquer objectivo a que se proponham. Neste caso particular, as condições mencionadas estiveram sempre reunidas, e a par da adesão e envolvimento da comunidade escolar, a motivação dos alunos não diminuiu nem mesmo com o cansaço inerente ao desenvolvimento de um trabalho exigente, simultâneo à frequência do 12.º ano de escolaridade. Considero que os objectivos, em termos educativos, foram plenamente alcançados, orgulhando-me portanto pelo facto de me ter sido solicitado o acompanhamento deste projecto e a redacção deste prefácio, e orgulhando-se obviamente a Escola Secundária Pedro Alexandrino por contar com alunos com as características do Bruno Poeira e do Fernando Fraga, cuja determinação, persistência e gosto pela Ciência, conduziram finalmente à concretização da participação num projecto proposto e apoiado pela Ciência Viva. Esta participação era de há muito bastante desejada por alguns alunos, particularmente pelo Fernando Fraga, dada a qualidade, justamente reconhecida, de todo o trabalho desenvolvido por aquela entidade no âmbito da cultura científica e tecnológica no nosso país. As actividades concebidas, propostas e executadas, tendo como protagonista uma estirpe de cianobactérias da espécie Microcystis aeruginosa, encontram enquadramento, e portanto total pertinência, em diversos assuntos pontuais contemplados nos conteúdos programáticos das disciplinas de Biologia e Geologia (10.º e 11.º anos) e de Biologia (12.º ano) do Ensino Secundário. vii

Concluo, afirmando que entendi, no actual contexto ecológico global e numa década especialmente norteada pela Educação para o Desenvolvimento Sustentável, como um privilégio a possibilidade de participar, e como uma responsabilidade, a que não deveria renunciar, a possibilidade de promover e apoiar a participação de alunos, num projecto de carácter científico relacionado com a proclamação, pela Assembleia Geral das Nações Unidas, do ano de 2010 como Ano Internacional da Biodiversidade, sob o lema, que deve ser o de todos, da celebração da diversidade da vida no planeta e do combate à extinção, cada vez mais veloz, de muitas espécies vivas. Póvoa de Santo Adrião, Março de 2010. Ana Maniés Oliveira viii

Resumo As cianobactérias, também designadas por algas verdes-azuis, são organismos unicelulares procariontes (observáveis portanto exclusivamente com recurso a microscopia), fotossintéticos (daí a designação de microalgas), pertencentes ao Domínio Bacteria, que normalmente fazem parte integrante do fitoplâncton, e que aquando da sua morte libertam diversos tipos de toxinas com efeitos nocivos para muitos seres vivos, entre os quais mamíferos superiores, incluindo o Homem. Microcystis aeruginosa é uma espécie de cianobactéria que se organiza em colónias de centenas, ou mesmo milhares de indivíduos. Quando as condições são propícias à sua proliferação, é frequente o aparecimento de florescências, comummente designadas por blooms, que podem afectar de diversas formas o equilíbrio biótico e abiótico envolvente. O estudo em laboratório deste crescimento exponencial das populações é bastante importante para a comunidade científica, razão pela qual o trabalho desenvolvido foi inicialmente proposto e promovido. Nesta medida, foi proporcionado um ambiente favorável ao desenvolvimento destas microalgas, através da sua introdução num meio de cultura adequado e do fornecimento de luz, calor e oxigenação, indispensáveis à sua proliferação. Foram realizadas análises diárias do meio e recolhas de amostras, com vista à obtenção de dados que permitissem traçar uma curva de crescimento, para além de que foram executados testes de toxicidade com Chlorella vulgaris e Artemia salina, de modo a poderem ser avaliados e comprovados eventuais efeitos das toxinas daqueles procariontes nestes organismos. São inúmeras as variedades de toxinas libertadas por cianobactérias, destacando-se as neurotoxinas, dermotoxinas e hepatotoxinas, e sendo estas últimas as mais frequentes na natureza. Dentro das hepatotoxinas, existe um grupo de maior impacto denominado microcistinas, cujo órgão alvo em mamíferos é o fígado, sendo que também podem encontrar-se casos de intoxicações por microcistinas em peixes, aves e outros vertebrados. As microcistinas receberam esta designação por terem sido encontradas inicialmente em cianobactérias do género Microcystis, que é precisamente o género a que pertence a espécie utilizada nos ensaios realizados ao longo desta actividade. ix

Microcystis aeruginosa é produtora de microcistinas, nomeadamente da variante mais comum, microcistina-lr (MC-LR). Apesar da toxicidade apresentada por estas toxinas é de salientar que a quantidade teórica de cianobactérias ingeridas, necessária para afectar negativamente e de forma grave um organismo com o peso e metabolismo de um ser humano, é bastante elevada, pelo que é mais provável que ocorram pequenas intoxicações e irritações dérmicas, fruto da exposição alimentar e tópica às toxinas produzidas por estas algas, do que lesões permanentes ou morte dos indivíduos que estiverem em contacto com as mesmas. Ainda assim, por razões óbvias, o contacto com estes microrganismos deve ser evitado, sendo que a forma mais eficaz de o impedir é a análise toxicológica frequente de zonas possivelmente afectadas, bem como a limitação dos nutrientes disponíveis nos meios mais propícios ao crescimento destas microalgas. Palavras-chave: Cianobactérias, florescências, blooms, Microcystis aeruginosa, Chlorella vulgaris, Artemia salina, toxinas, microcistinas. x

Abstract Cyanobacteria, also known as blue-green algae, are microscopic organisms, prokaryotic and photosynthetic cells (that is why they are known as microalgae), belonging to the Domain Bacteria, found in phytoplankton, and when they die they release several types of toxins that can be harmful to other living organisms, including higher mammals as humans. Microcystis aeruginosa is a species of cyanobacteria that usually appears organized in colonies of hundreds or even thousands of individuals. Under the right environmental conditions, blue-green algae can increase so much in number that they form floating rafts on the surface of the water, usually known as blooms, which can have numerous effects on the environmental balance. The experimental study of the exponential growth of these populations is very important in science, which is the main reason why this work was originally planned and promoted. Regarding this purpose, it was prepared the right environment for the development of these algae, through providing an appropriate growth medium, light, heat and oxygen. Daily analysis of the medium were performed and daily samples were collected, in order to obtain data for the growth curve, beyond which were carried out toxicity tests with Chlorella vulgaris and Artemia salina, in order to evaluate and test any effects of cyanobacteria toxins upon these organisms. Cyanobacteria release different types of toxins, namely neurotoxins, dermotoxins and hepatotoxins (the most frequent in nature). The microcystins, within the hepatotoxins group, affect mammals liver, and can also cause intoxication in fish, birds and other vertebrates. Microcystins were originally found in some cyanobacteria like Microcystis, which is exactly the kind of cyanobacteria that was used in the tests performed during this activity. Microcystis aeruginosa produces microcystins, including the most common microcystin-lr (MC-LR). Despite the toxicity of those organisms, to seriously affect a human being should be needed a quite high amount of cyanobacteria. The human exposure to toxins produced by these algae more likely produces small dermal irritation, rather than permanent damage or individual death. Anyway, contact with these organisms should be avoided, and xi

the most effective way to prevent it is to carry out regular toxicological analysis, in probably affected areas, as well as to reduce the available nutrients provided in the environment for the development of these microalgae. Keywords: Cyanobacteria, blooms, Microcystis aeruginosa, Chlorella vulgaris, Artemia salina, toxins, microcystins. xii

Conteúdo Agradecimentos v Prefácio vii Resumo ix Abstract xi Índice de Figuras xv Índice de Tabelas xvi 1 Introdução 1 2 Enquadramento Teórico 3 2.1 Cianobactérias: Abordagem Inicial...................... 3 2.2 Toxinas produzidas por cianobactérias.................... 4 2.3 Blooms de cianobactérias........................... 5 2.4 Chlorella vulgaris e Artemia salina...................... 6 2.5 Meio de Cultura................................ 8 3 Métodos Informáticos Utilizados 13 3.1 Método de Observação Microscópica..................... 13 3.2 Métodos de Contagens............................ 14 xiii

xiv CONTEÚDO 4 Curva de Crescimento de Microcystis aeruginosa 17 4.1 Metodologia de Trabalho........................... 17 4.2 Análise de Resultados............................. 19 5 Ensaio de Toxicidade com Chlorella vulgaris 25 5.1 Metodologia de Trabalho........................... 25 5.2 Análise de Resultados............................. 27 6 Ensaio de Toxicidade com Artemia salina 31 6.1 Metodologia de trabalho........................... 31 6.2 Análise de Resultados............................. 34 7 Conlusão 37 Referências Bibliográficas 39 Apêndices 41 A Script de conversão de imagens 41 A.1 O script.................................... 41 B Scripts de tratamento de resultados 43 B.1 O script aplicado à Microcystis aeruginosa................. 43 B.2 O script aplicado à Chlorella vulgaris.................... 47

Lista de Figuras 2.1 Bloom de Microcystis aeruginosa na Lagoa Verde da Lagoa das Sete-Cidades, Açores (Foto cedida pela Professora Maria da Conceição Raimundo Santos - Faculdade de Ciências e Tecnologias - Universidade Nova de Lisboa). 6 2.2 Bloom de Cianobactérias na Lagoa das Sete-Cidades, Açores (Foto cedida pela Professora Maria da Conceição Raimundo Santos - Faculdade de Ciências e Tecnologias - Universidade Nova de Lisboa)............. 7 2.3 Chlorella vulgaris................................ 8 2.4 Quistos de Artemia salina e dois naúplios recém-eclodidos.......... 9 3.1 Pormenor de uma câmara de Neubauer. A zona colorida corresponde à área seccionada pelo script, Apendice A, correspondente ao corte, figura 3.3, realizado na imagem capturada inicialmente, figura 3.2........... 14 3.2 Fotografia feita à câmara de Neubaer, sem qualquer tratamento de imagem. 15 3.3 Quatro quadrículas extraídas da fotografia da figura 3.2............ 16 4.1 Representação da curva de crescimento de uma estirpe de cianobactéria da espécie Microcystis aeruginosa........................ 23 5.1 Placa de poços (6 4).............................. 27 6.1 Placa de poços (6 4), com as soluções utilizadas no ensaio de toxicidade com Artemia salina............................... 33 6.2 Percentagem da mortalidade dos naúplios em função da concentração.... 36 xv

xvi LISTA DE FIGURAS

Lista de Tabelas 2.1 Soluções que compõem o meio de cultura................... 9 2.2 Preparação da solução A............................ 10 2.3 Preparação da solução B............................ 10 2.4 Preparação da solução Fe-EDTA. As soluções de FeCl 3 e de EDTA Na foram feitas como é descrito nas tabelas 2.5 e 2.6, respectivamente...... 10 2.5 Preparação de FeCl 3.............................. 10 2.6 Preparação de EDTA Na.......................... 10 2.7 Soluções de micronutrientes. Da solução 1 a 12, 10 ml/l, da solução 13 a 14, 100 ml/l.................................. 11 4.1 Dados das recolhas das amostras da cultura de Microcystis aeruginosa.... 19 4.2 Valores de contagem de cianobactérias por aplicação do método descrito.. 21 4.3 Valores de densidade celular (células/ml) em função do tempo (dias).... 22 5.1 Número de Chlorella referentes à linha 1 da placa de poços.......... 28 5.2 Número de Chlorella referentes à linha 2 da placa de poços.......... 28 5.3 Número de Chlorella referentes à linha 3 da placa de poços.......... 28 5.4 Concentração celular de Chlorella vulgaris nos meios tóxicos........ 29 6.1 Naúplios inseridos na placa de poços com solução tóxica originalmente... 33 6.2 Naúplios vivos após 24 h na solução tóxica.................. 34 6.3 Naúplios vivos após 48 h na solução tóxica.................. 34 6.4 Percentagem da mortalidade dos naúplios após 24 horas na solução..... 35 xvii

xviii LISTA DE TABELAS

Capítulo 1 Introdução Onosso trabalho insere-se na rede de projectos Ciência Viva, nomeadamente no âmbito do projecto Oceanos, Biodiversidade e Saúde Humana. Este projecto, integrado no Ano Internacional da Biodiversidade, pretende levar alunos e professores a descobrir, experimentar e relatar as ligações entre a saúde humana e a biodiversidade marinha (Ciência Viva, 2010). Investigadores de todo o mundo estudam as formas através das quais os oceanos afectam o Homem, e como as suas acções podem ter efeitos positivos ou negativos ao nível dos micro-ambientes. A relação entre Oceanos e Saúde Humana deve ser amplamente debatida na comunidade, uma vez que se descobrem cada vez mais evidências que confirmam a sua importância. Existem, no entanto, muito poucas iniciativas educativas que ajudem a entender esta ligação especial. Uma das tentativas existentes consiste no desafio proposto ao Ensino Secundário, pelo projecto referido, subordinado à questão E se um bloom de cianobactérias te batesse à porta?, que de resto constitui o título desta obra. O trabalho realizado visa responder ao desafio, dividindo-se desta forma em três partes, com objectivos e procedimentos distintos. A primeira parte remete para uma cultura laboratorial de uma estirpe de cianobactérias da espécie Microcystis aeruginosa, com o objectivo de determinação da sua curva de crescimento. A segunda parte constitui um teste de toxicidade aguda com uma microalga verde da espécie Chlorella vulgaris, através da inibição do seu crescimento. Por fim, a terceira parte, consiste também na avaliação da toxicidade de cianobactérias, mas através de um ensaio com a espécie Artemia salina, com base no estudo da indução de mortalidade em náuplios deste crustáceo zooplanctónico. Apesar de terem objectivos independentes, todos os trabalhos confluem numa meta comum: conhecer melhor a espécie de cianobactérias em estudo e analisar os possíveis malefícios da sua toxicidade sobre outras espécies que possam partilhar o mesmo meio. Ao longo das actividades experimentais desenvolvidas, procedeu-se ao estudo de diversas características das espécies mencionadas, sendo que foram os resultados destas actividades e estudos que originaram este livro. 1

2 CAPÍTULO 1. INTRODUÇÃO Para a redacção do mesmo utilizámos o software de tipografia e escrita científica LaTeX, o que aumentou a eficácia do trabalho realizado, além de melhorar bastante o aspecto final da obra. Para a criação dos gráficos, desvios-padrão, e tabelas existentes, utilizámos o software de estatística R, o que aumentou a precisão e exactidão desses mesmos gráficos, melhorando simultaneamente o aspecto dos mesmos. Através destes recursos, tentámos dar uma resposta clara e concisa à principal questão do desafio (como referido: E se um bloom de cianobactérias te batesse à porta? ). Deste modo, pretendemos esclarecer acerca dos perigos que estes tipos de blooms constituem ao nível dos oceanos, da biodiversidade e da saúde humana...

Capítulo 2 Enquadramento Teórico 2.1 Cianobactérias: Abordagem Inicial As cianobactérias são organismos procariontes fotossintéticos pertencentes ao Domínio Bacteria, Filo Cyanobacteria. Em termos taxonómicos, estas começaram por ter a designação de algas verdes-azuis, devido à coloração apresentada, tendo sido, posteriormente, denominadas por cianobactérias, uma vez que actualmente se sabe que estes organismos não têm qualquer relação filogenética com qualquer dos grupos de algas. Estes microrganismos podem encontrar-se sob forma de cocos, bastonetes, filamentos ou pseudofilamentos, sendo a sua coloração variável entre azul e várias tonalidades de verde. Estas características variam consoante os seus géneros e inúmeras espécies, das quais se destacam a Microcystis aeruginosa, a que pertence a estirpe de cianobactéria em estudo neste trabalho. A este nível é possível referir que nesta espécie as cianobactérias se apresentam sob a forma de cocos, tendo uma grande tendência para se agruparem em colónias. A maioria das espécies encontra-se em água doce, sendo que algumas também se podem encontrar em água salgada ou em solos húmidos. Ainda que menos frequentemente, podemos encontrar estes microrganismos em ambientes lacustres hipersalinos ou em ambientes congelados. Algumas espécies vivem em simbiose com líquenes, com protistas e corais, fornecendo matéria orgânica aos seus hospedeiros. A variedade de ambientes deve- -se à sua grande adaptação a uma vasta gama de condições ambientais e à sua tolerância a inúmeras situações de stress. Salienta-se o facto de que o registo fóssil destas microalgas, encontrado em rochas sedimentares do noroeste australiano, indicia que estes seres fotossintéticos terão apararecido no Éon Arcaico, estimando-se este aparecimento para há cerca de 2,5 mil milhões de anos. Tendo sido os primeiros seres vivos autotróficos a produzir oxigénio, foram também os principais produtores primários da biosfera, continuando actualmente a desempenhar esse 3

4 CAPÍTULO 2. ENQUADRAMENTO TEÓRICO papel ao nível dos oceanos. Terão sido, muito provavelmente, os responsáveis pelo aparecimento do oxigénio como constituinte da atmosfera terreste, há cerca de 1,2 mil milhões de anos. Para além de terem iniciado a produção de O 2, o seu papel ao nível da evolução da vida prende-se também com o facto de, e segundo a Teoria Endossimbiótica, as cianobactérias terem constituído os antepassados dos cloroplastos, pelo estabelecimento de associações endossimbióticas com células de maiores dimensões, dando origem aos primeiros seres eucariontes fotossintéticos. As cianobactérias de alguns géneros possuem células especializadas na fixação do azoto atmosférico (heterocistos), o que lhes permite sobreviver em meios desprovidos deste elemento na forma inorgânica, e tornando-se responsáveis pela sua introdução nas redes tróficas, nomeadamente aquáticas. Os organismos em estudo têm assumido, portanto, funções de suprema importância nos processos funcionais dos ecossistemas em que se integram e no fluxo global de nutrientes na biosfera. 2.2 Toxinas produzidas por cianobactérias As cianobactérias produzem uma grande diversidade de moléculas orgânicas tóxicas que, pelos efeitos que provocam no Homem, podem ser classificadas em três grupos principais: neurotoxinas, dermatotoxinas e hepatotoxinas. Apesar da natureza química destes seus compostos ser bastante diversificada e a função que desempenham nos organismos produtores ser ainda desconhecida, sabe-se que estas toxinas são produzidas e armazenadas no interior da célula, sendo apenas libertadas aquando da morte da mesma. Dos vários grupos de toxinas supra-referidos, destacam-se, pela frequência do seu aparecimento, as hepatotoxinas e, dentro destas, as microcistinas, devido ao carácter global e preponderante da sua ocorrência. É de salientar que, actualmente, são conhecidas cerca de 71 variantes de microcistinas, e que este tipo de toxinas recebeu este nome devido ao facto de terem sido encontradas pela primeira vez em cianobactérias do género Microcystis, no qual se insere a espécie em estudo (Microcystis aeruginosa). Esta espécie com que nos foi proposto trabalhar, produz estas microcistinas na sua variante mais comum que é a microcistina-lr (MC-LR). Trata-se assim de uma família de heptapéptidos cíclicos que actuam ao nível do fígado, alterando a actividade e produção de proteínas, sendo causadores de diversos desequilíbrios ao nível deste órgão, e podendo mesmo ser causadores de tumores hepáticos ou, em casos mais graves, de choques hipovolémicos. 1 Para além das microcistinas, as cianobactérias podem produzir outros tipos de hepatotoxinas, sendo estas menos frequentes, mas igualmente tóxicas, como é o caso das nodularinas e das cilindrospermopsinas que actuam também, fundamentalmente, ao nível do fígado. No que respeita às neurotoxinas, podemos afirmar que apresentam uma toxicidade mais

2.3. BLOOMS DE CIANOBACTÉRIAS 5 acentuada do que as hepatotoxinas, com efeitos muitas vezes letais para o Homem. Estas toxinas podem provocar, uma vez ingeridas, perdas rápidas de sensibilidade e dormência em várias zonas do corpo, tonturas e dores de cabeça, descoordenações motoras, dificuldades respiratórias, paralisia muscular, dispneia, hipoxia e morte. Estas consequências podem variar de acordo com o tipo de neurotoxina, bem como com a quantidade de água com toxinas que é ingerida. Quanto às dermatotoxinas, são toxinas produzidas por cianobactérias com efeitos fundamentais ao nível dermatológico, que podem constituir um maior risco para a saúde humana se estiverem localizadas em zonas de recreio, provocando frequentemente dermatites. A maior parte das intoxicações humanas resultantes da exposição a águas contaminadas com toxinas produzidas por cianobactérias foi atribuída à presença de microcistinas. Destaca-se um dos casos mais graves que ocorreu no Brasil, em meados da década de 90, com a morte de mais de 50 utentes de uma unidade de hemodiálise abastecida com água tratada de forma deficiente, proveniente de um reservatório superficial contaminado com uma florescência produtora de microcistinas. Também em Portugal um grave incidente ocorrido numa unidade hospitalar de Évora, de que resultou a morte de 20 pessoas, foi atribuído a uma intoxicação por hepatotoxinas. Ainda assim, estes são apenas exemplos dos inúmeros incidentes que têm ocorrido por intoxicações deste tipo, o que tem levado a uma crescente preocupação da comunidade mundial, nomeadamente, da Organização Mundial de Saúde. 2.3 Blooms de cianobactérias A ocorrência de florescências ou blooms de cianobactérias em massas de água doce é, de certo modo, um fenómeno imprevisível e ainda mal compreendido. Ainda assim, a capacidade para regular a sua posição na coluna de água, ajustar a composição relativa dos seus pigmentos em função da quantidade e intensidade luminosas, maximizar a afinidade e a eficiência na incorporação de fósforo e de ferro, fixar azoto atmosférico (ainda que nem todas o façam) e armazenar no seu citoplasma nutrientes essenciais ao seu metabolismo, são características que podem revelar-se competitivamente vantajosas e, em circunstâncias adequadas, permitir o desenvolvimento de acentuadas proliferações celulares. As causas da ocorrência destes blooms prendem-se essencialmente com a eutrofização das águas 2, que constitui um dos problemas de qualidade de água de maior importância na actualidade. Esta eutrofização consiste no excessivo enriquecimento das águas com excesso de nutrientes, nomeadamente, fósforo e azoto, compostos estes essenciais à sobrevivência e multiplicação das cianobactérias. As alterações naturais dos ecossistemas e as actividades humanas, nomeadamente no que diz respeito ao uso recorrente de adubos e fertilizantes, às descargas sanitárias e à exploração agrícola e agropecuária, têm contribuído para a degradação da qualidade das águas, tanto subterrâneas como superficiais (mares, rios, lagos e reservatórios), sendo a eutrofização nestas últimas um dos aspectos mais visíveis deste problema. 3

6 CAPÍTULO 2. ENQUADRAMENTO TEÓRICO Figura 2.1: Bloom de Microcystis aeruginosa na Lagoa Verde da Lagoa das Sete-Cidades, Açores (Foto cedida pela Professora Maria da Conceição Raimundo Santos - Faculdade de Ciências e Tecnologias - Universidade Nova de Lisboa). A espécie de cianobactérias em estudo (Microcystis aeruginosa) neste trabalho experimental é uma espécie predominante nestes blooms, nomeadamente em florescências que ocorrem muito frequentemente no arquipélago dos Açores, figuras 2.1 e 2.2. Em situação de bloom, e com condições meteorológicas calmas, esta espécie forma espumas densas à superfície das massas de água, com uma coloração amarela facilmente identificável. 2.4 Chlorella vulgaris e Artemia salina No desenrolar dos nossos trabalhos experimentais, para além da Microcystis aeruginosa, tomámos contacto com outras espécies, como é o caso de Chlorella vulgaris e da Artemia salina, com vista a avaliar as consequências das microcistinas ao nível do crescimento e sobrevivência destas espécies. Estes estudos de toxicidade têm por principal objectivo avaliar possíveis efeitos adversos destas toxinas na saúde humana, na medida em que a ecotoxicologia parte do pressuposto de que os efeitos adversos causados em diferentes organismos e no Homem podem ser semelhantes. Actualmente, em estudos de toxicidade deste tipo, utilizam-se, em alternativa a ensaios com mamíferos, ensaios de toxicidade com

2.4. CHLORELLA VULGARIS E ARTEMIA SALINA 7 Figura 2.2: Bloom de Cianobactérias na Lagoa das Sete-Cidades, Açores (Foto cedida pela Professora Maria da Conceição Raimundo Santos - Faculdade de Ciências e Tecnologias - Universidade Nova de Lisboa). algas do fitoplâncton, invertebrados do zooplâncton, bactérias, peixes, entre outros mais complexos, dos quais se destacam os ensaios de toxicidade utilizando linhas celulares. Nesta medida, a Chlorella, para além de ser um género de algas verdes unicelulares, pertencentes ao Filo Chlorophyta, constitui também, ao nível dos ecossistemas marítimos, um papel de produtor primário, o que se revela de uma grande importância para o trabalho a realizar. Estas microalgas apresentam, geralmente, uma forma esférica e ausência de flagelo, figura 2.3, página 8. A Chlorella contém os vários pigmentos verdes fotossintéticos, como é o caso das clorofilas a e b nos seus cloroplastos e, através da fotossíntese, multiplica-se rapidamente, uma vez que para tal necessita apenas de dióxido de carbono, água, luz solar e pequenas quantidades de minerais. A Artemia salina é uma espécie pertencente ao género Artemia, que engloba pequenos crustáceos da ordem Anostraca e que apresentam tamanho e coloração variadas, que podem variar do rosa pálido ao avermelhado, ao branco, ou mesmo ao esverdeado, dependendo do tipo de alimento que consumirem. Artemia é um organismo zooplanctónico e, como tal, um consumidor primário nos ecossistemas marinhos. Foram recebidos quistos de Artemia salina, que eclodindo originaram náuplios, o seu estado larvar, típico da maioria dos crustáceos aquáticos, figura 2.4, página 9.

8 CAPÍTULO 2. ENQUADRAMENTO TEÓRICO Figura 2.3: Chlorella vulgaris. Dado o interesse que a problemática das florescências de cianobactérias tóxicas tem suscitado nas comunidades científicas e da saúde, bem como no público em geral, pretendeu-se, com este trabalho experimental, avaliar o potencial tóxico de uma estirpe de cianobactéria face a organismos de dois níveis tróficos distintos (produtor primário e consumidor primário) de um ecossistema aquático, no sentido de sensibilizar para as consequências da sua ocorrência. 2.5 Meio de Cultura A sobrevivência e o suporte de vida dos organismos depende do fornecimento adequado de nutrientes e de condições convenientes de crescimento, nomeadamente no que diz respeito a ph, luz e temperatura. Nesta medida, no que diz respeito aos nutrientes, grande parte dos microrganismos apenas necessitam de substâncias solúveis de baixo peso molecular. Uma solução que contenha estes nutrientes é designada como meio de cultura. Todos os nutrientes do meio nutritivo seleccionado são preparados como soluções stock concentradas, armazenadas no frigorífico e em alguns casos no escuro. Todas as soluções stock são esterilizadas e o meio é preparado através da adição de uma determinada quantidade de cada solução stock a água destilada estéril, tendo o cuidado para que não ocorra nenhuma contaminação. Um dos meios usados na cultura de microalgas é o meio Z8, tabela 2.1, composto por uma solução rica em azoto (solução A), tabela 2.2, uma solução rica

2.5. MEIO DE CULTURA 9 Figura 2.4: Quistos de Artemia salina e dois naúplios recém-eclodidos. em fósforo (solução B), tabela 2.3, uma solução de ferro (solução de Fe-EDTA), tabela 2.4, e uma solução de micronutrientes, tabela 2.7. Desta forma, o meio utilizado nas actividades experimentais foi o Meio Z8, para a formação do qual se adicionaram as soluções stock a água destilada, segundo as concentrações que se mostra na tabela 2.1. A informação inscrita nas tabelas 2.2 a 2.7, onde se encontra descrita a composição química do Meio Z8, foi disponibilizada pela instituição Ciência Viva - Agência Nacional para a Cultura Científica e Tecnológica. Soluções Concentrações (ml/l) Sol. A 10 Sol. B 10 Sol. Fe-EDTA 10 Sol. Micronutrientes 1 Tabela 2.1: Soluções que compõem o meio de cultura.

10 CAPÍTULO 2. ENQUADRAMENTO TEÓRICO Composto químico Concentração (g/l) NaNO 3 46,7 Ca(NO 3 ) 2 4H 2 O 5,9 MgSO 4 7H 2 O 2,5 Tabela 2.2: Preparação da solução A. Composto químico Concentração (g/l) K 2 HPO 4 3,1 Na 2 CO 3 2,1 Tabela 2.3: Preparação da solução B. Composto químico Concentração (ml/l) Solução FeCl 3 10 Solução EDTA Na 9,5 Tabela 2.4: Preparação da solução Fe-EDTA. As soluções de FeCl 3 e de EDTA Na foram feitas como é descrito nas tabelas 2.5 e 2.6, respectivamente. Composto químico FeCl 3 6H 2 O HCl 100 ml 2,8 g 100 ml Tabela 2.5: Preparação de FeCl 3. Composto químico EDTA NaOH(0,1N)) 100 ml 2,8 g 100 ml Tabela 2.6: Preparação de EDTA Na.

2.5. MEIO DE CULTURA 11 Composto químico g/l 1 Na 2 WO 2H 2 O 0,33 2 (NH 4 ) 6 Mo 7 O 24 2H 2 O) 0,88 3 KBr 1,2 4 KI 0,83 5 ZnSO 4 7H 2 O 2,87 6 Cd(NO 3 ) 4H 2 O 1,55 7 Co(NO 3 ) 2 6H 2 O 1,46 8 CuSO 4 5H 2 O 1,25 9 NiSO 4 (NH 4 ) 2 SO 4 6H 2 O 1,98 10 Cr(NO 3 ) 3 9H 2 O 0,41 11 V 2 O 5 0,089 12 Al 2 (SO 4 ) 3 K 2 SO 4 24H 2 O 4,74 13 H 3 BO 3 3,1 14 MnSO 4 4H 2 O 2,23 Tabela 2.7: Soluções de micronutrientes. Da solução 1 a 12, 10 ml/l, da solução 13 a 14, 100 ml/l.

12 CAPÍTULO 2. ENQUADRAMENTO TEÓRICO

Capítulo 3 Métodos Informáticos Utilizados 3.1 Método de Observação Microscópica Quando a experiência foi iniciada, verificou-se que a contagem das células na câmara de Neubauer (figura 3.1) através de um microscópio óptico comum, era bastante difícil de realizar, uma vez que, apesar das contagens serem realizadas por mais do que uma pessoa, existia sempre uma diferença, por vezes significativa, entre o número de células contadas pelos diversos elementos do grupo. Mais tarde soube-se que existia um defeito de fabrico na câmara, o que veio a justificar dificuldade. No entanto, antes de tal ter sido revelado, já tínhamos tentado encontrar uma solução que resolvesse o nosso problema, e que, simultaneamente, nos permitisse observar melhor os diversos organismos que teríamos de estudar ao longo da actividade experimental que se seguiria. Com vista à resolução do problema, adquiriu-se um Microscópio Digital Biolux Al da Bresser, com uma ampliação compreendida entre as 20 e as 1280. Desta forma, podendo ligar o microscópio ao computador, foi fácil encontrar um programa que nos permitisse observar num monitor, a imagem captada pela objectiva. Através da utilização dos softwares AM Cap USB PC câmara plus (a), Photomizer SE (b) e MicrOcular VGA (c) instalados no sistema operativo Windows XP (d), e com os softwares ImageJ (e), Gimp (f), e GTK UVC Video Viewer (g) instalados no sistema operativo Linux Sabayon 5.0 (h), passou a analisar-se a informação obtida pelo microscópio de um modo completamente diferente do usual. Desta forma, conseguiram captar-se imagens e gravar (a) AM Cap, http://amcap.en.softonic.com/ (b) Photomizer SE, http://www.photomizer.net/en/index.php (c) MicrOcular VGA, http://www.microcular.com (d) Windows, http://www.microsoft.com (e) ImageJ, http://rsbweb.nih.gov/ij/ (f) Gimp, http://www.gimp.org/ (g) GTK UVC Video Viewer, http://guvcview.berlios.de/ (h) Sabayon, http://www.sabayon.org/ 13

14 CAPÍTULO 3. MÉTODOS INFORMÁTICOS UTILIZADOS Figura 3.1: Pormenor de uma câmara de Neubauer. A zona colorida corresponde à área seccionada pelo script, Apendice A, correspondente ao corte, figura 3.3, realizado na imagem capturada inicialmente, figura 3.2. vídeos daquilo que se encontrava sob a objectiva do microscópio, além de trabalhar essas imagens digitalmente, o que veio permitir, mais tarde, uma grande poupança de tempo e trabalho (ver secção 3.2). Essencialmente, passou a ser possível a observar e guardar no computador aquilo que anteriormente apenas podia ser observado no microscópio, aumentando assim o nível de qualidade da imagem e passando a poder analisar a informação obtida alguns dias ou semanas, após a sua captação. 3.2 Métodos de Contagens Apesar de existirem alguns softwares específicos no mercado, não são de acesso fácil ao aluno do ensino secundário. Assim, tornou-se mais simples a adopção de um software que tem característas adequadas ao uso que lhes queríamos dar. Nesta medida, com o apoio do professor da disciplina de Área de Projecto, criou-se um script informático, Apêndice A, página 41, que seccionava as imagens previamente captadas pelo microscópio, figura

3.2. MÉTODOS DE CONTAGENS 15 3.2, numa geometria uniforme, que permitiu, por meio de cálculos de proporção simples, calcular o número de células num mililitro de solução, a partir da contagem automática de uma área do fotograma seccionado, figura 3.3. Considerando o campo de observação do microscópio utilizado, e a altura da câmara de Neubauer onde se analisaram as amostras, optou-se por definir essa medida como o equivalente em pixéis a um cubo com 0,5 milímetros de lado, e 0,10 milímetros de altura, o que equivale a quatro quadrículas da câmara em causa, figura 3.3. Desta forma, sabendo o volume de solução existente na área fotografada e delimitada da câmara de Neubauer (0,025 milímetros cúbicos, o que equivale a 0,5mm 0,5 mm 0,1 mm) e, considerando que cada milímetro cúbico equivale a 0,001 mililitros de solução, tornou-se simples obter o número de células existentes por cada mililitro a partir do número existente em cada fotografia modificada multiplicado por 40000. Figura 3.2: Fotografia feita à câmara de Neubaer, sem qualquer tratamento de imagem. Cada amostra foi fotografada quatro vezes. Todas as imagens capturadas foram depois cortadas, e analisadas. Os resultados numéricos das contagens registados, para posterior tratamento. No tratamento de resultados usámos para cálculo dos parâmetros estatísticos o R (i) numa plataforma Linux. Foram escritos vários scripts para esse objectivo e que podem ser con- (i) R, http://www.r-project.org/

16 CAPÍTULO 3. MÉTODOS INFORMÁTICOS UTILIZADOS Figura 3.3: Quatro quadrículas extraídas da fotografia da figura 3.2. sultados no Apêndice B, página 43. Além de fazerem os cálculos estatísticos, desenham os gráficos e ainda preparam as tabelas em L A TEX (j) para serem incorporadas no texto. (j) http://www.latex-project.org/

Capítulo 4 Curva de Crescimento de Microcystis aeruginosa 4.1 Metodologia de Trabalho Com vista ao estudo da curva de crescimento desta espécie foi necessário recorrer a um protocolo experimental. Este protocolo foi-nos cedido pela Ciência Viva, no entanto, o grupo de trabalho realizou algumas adaptações ao mesmo. Desta forma, segue-se a descrição dos métodos de trabalho utilizados para este estudo. Ao iniciarmos o procedimento experimental, houve a necessidade de descobrir um recipiente ideal para a colocação do meio onde iria crescer a cultura de cianobactérias. Deveria ser um recipiente que possuísse todas as características que considerámos serem importantes para o bom desenvolvimento da actividade (possibilidade de colocação de um tubo de arejamento, controlo fácil e eficaz da temperatura do meio, sistema semi-isolado, possibilidade de visualização do seu conteúdo, entre outras características). Desta forma optámos pela criatividade e decidimos utilizar uma caixa cúbica e transparente, geralmente utilizada para a colocação e venda de telemóveis. Assim, lavou-se, desinfectou-se e isolou-se, com silicone para aquários, o recipiente antes de se realizar o ensaio. Uma vez escolhido e tratado o recipiente, passámos a assegurar a possibilidade de arejar o meio de cultura durante o crescimento da mesma. Para tal, foi fixado lateralmente à caixa, com silicone, um tubo de arejamento, ligado a uma bomba de aquário, que veio a permitir a circulação de ar, consequente oxigenação do meio, ajudando assim a impedir a fixação dos organismos no fundo e nas extremidades do recipiente. Estando tudo preparado para a colocação das cianobactérias, iniciámos o trabalho descrito no protocolo, adicionando 4 litros de água destilada, seguidos da colocação de um conjunto de soluções ricas em fósforo, azoto, ferro e micronutrientes, que constituem o meio Z8, ver secção 2.5, na página 8. Também uma agitação forte foi assegurada, o que permitiu homogeneizar bem as soluções. 17

18 CAPÍTULO 4. CURVA DE CRESCIMENTO DE MICROCYSTIS AERUGINOSA Da solução obtida, retirou-se 1 litro para um balão volumétrico devidamente lavado e desinfectado, tendo-se posto este de parte para ser utilizado no ensaio de toxicidade com a Chlorella vulgaris, secção 5.1, na página 25. Nos 3 litros de solução restantes adicionou-se uma solução com a estirpe de cianobactérias a utilizar, pertencentes à espécie Microcystis aeruginosa. O conjunto da Microcystis aeruginosa com o meio originou uma solução com uma concentração celular de 3,82 10 6 células por mililitro. A solução foi novamente agitada, de modo a ficar homogeneizada e evitar a predominância de cianobactérias em apenas algumas zonas da solução. Retiraram-se duas amostras de alguns mililitros da cultura para dois tubos Eppendorf e adicionaram-se duas gotas de uma solução concentrada de Lugol a cada amostra. Identificaram-se devidamente os tubos com o tipo de cianobactéria presente, o meio de cultura, e a referência t = 0 (que reporta para a recolha inicial, ou seja, recolha no tempo igual a 0). O Lugol adicionado levou à fixação e estabilização destes microrganismos, pelo que a solução pôde ser observada mais tarde sem o número de cianobactérias sofrer alterações. O uso do soluto de Lugol visa imobilizar as células, tornando-as mais pesadas, sendo mais rápida a sua sedimentação. Ligou-se a bomba de aquário e colocou-se o recipiente em cima de um agitador magnético ligado, de modo a que, com a utilização da bomba de arejamento, as cianobactérias não sedimentem nas paredes do recipiente, e, com a utilização do agitador magnético, não sedimentem no fundo. Colocou-se também um candeeiro de luz branca com o foco de luz apontado ao recipiente e climatizou-se o laboratório com a ajuda de um aquecedor a óleo, variando a temperatura da solução, durante a maior parte do tempo de crescimento da cultura, entre os 27 ºC e os 29 ºC. É de salientar que todos os equipamentos envolvidos na manutenção das condições do meio se mantiveram ligados, ininterruptamente, durante todo o tempo do ensaio. Estando reunidas, e sendo mantidas, as condições adequadas ao crescimento desta população, procedeu-se à recolha diária de amostras a partir da cultura. Em cada momento de amostragem, agitou-se manualmente a solução (com o auxilio de uma vareta de vidro) e retirou-se a amostra da mesma, colocando-a num tubo Eppendorf e fixando-a com 2 gotas de Lugol. Todas as amostras foram identificadas com a referência temporal, tendo sido registado, num caderno de laboratório, o dia e hora da recolha, a temperatura do meio de cultura e a respectiva referência temporal, tabela 4.1, página 19. Após as diversas recolhas diárias, realizou-se a observação das mesmas recorrendo à utilização do microscópio óptico digital após montagem da solução na câmara de Neubauer. Após estas observações, foram captadas quatro imagens de cada amostra, tendo sido tratadas como descrito no Capítulo 3. Com os resultados obtidos traçou-se um gráfico que traduz a variação da densidade celular em função do tempo (secção 4.2, página 19).

4.2. ANÁLISE DE RESULTADOS 19 Data Hora Registo efectuado T (ºC) 14/01/2010 20.05h Recolha de amostra Microcystis aeruginosa (t = 0) 20 15/01/2010 11.35h Recolha de amostra Microcystis aeruginosa (t = 1) 20 16/01/2010 09.00h Recolha de amostra Microcystis aeruginosa (t = 2) 28 17/01/2010 11.20h Recolha de amostra Microcystis aeruginosa (t = 3) 30 18/01/2010 11.35h Recolha de amostra Microcystis aeruginosa (t = 4) 29 19/01/2010 11.45h Recolha de amostra Microcystis aeruginosa (t = 5) 29 20/01/2010 10.20h Recolha de amostra Microcystis aeruginosa (t = 6) 29 21/01/2010 11.40h Recolha de amostra Microcystis aeruginosa (t = 7) 28 22/01/2010 11.40h Recolha de amostra Microcystis aeruginosa (t = 8) 29 23/01/2010 11.30h Recolha de amostra Microcystis aeruginosa (t = 9) 29 24/01/2010 11.30h Recolha de amostra Microcystis aeruginosa (t = 10) 28 25/01/2010 15.05h Recolha de amostra Microcystis aeruginosa (t = 11) 29 26/01/2010 11.40h Recolha de amostra Microcystis aeruginosa (t = 12) 28 27/01/2010 11.35h Recolha de amostra Microcystis aeruginosa (t = 13) 28 28/01/2010 11.30h Recolha de amostra Microcystis aeruginosa (t = 14) 28 29/01/2010 11.25h Recolha de amostra Microcystis aeruginosa (t = 15) 28 30/01/2010 11.15h Recolha de amostra Microcystis aeruginosa (t = 16) 28 31/01/2010 11.15h Recolha de amostra Microcystis aeruginosa (t = 17) 28 01/02/2010 11.35h Recolha de amostra Microcystis aeruginosa (t = 18) 28 02/02/2010 11.36h Recolha de amostra Microcystis aeruginosa (t = 19) 27 03/02/2010 11.05h Recolha de amostra Microcystis aeruginosa (t = 20) 28 04/02/2010 11.30h Recolha de amostra Microcystis aeruginosa (t = 21) 28 05/02/2010 11.30h Recolha de amostra Microcystis aeruginosa (t = 22) 29 06/02/2010 11.20h Recolha de amostra Microcystis aeruginosa (t = 23) 30 07/02/2010 11.15h Recolha de amostra Microcystis aeruginosa (t = 24) 28 08/02/2010 09.30h Recolha de amostra Microcystis aeruginosa (t = 25) 28 09/02/2010 11.45h Recolha de amostra Microcystis aeruginosa (t = 26) 28 10/02/2010 12.30h Recolha de amostra Microcystis aeruginosa (t = 27) 28 11/02/2010 13.15h Recolha de amostra Microcystis aeruginosa (t = 28) 28 Tabela 4.1: Dados das recolhas das amostras da cultura de Microcystis aeruginosa. 4.2 Análise de Resultados Ao longo da actividade experimental tentou introduzir-se o menor número possível de variáveis no procedimento efectuado. Contudo, com o passar do tempo, tornou-se inevitável alterar alguns factores que apesar de provavelmente não terem afectado o resultado final, não podem deixar de ser referidos. Assim, ao 12º dia de análise (t = 11), a solução de Lugol utilizada para fixar as amostras de meio de cultura foi substituída por uma de concentração inferior. Ao 14º dia de análise (t = 13), o meio de cultura deixou de fornecer nutrientes apenas

20 CAPÍTULO 4. CURVA DE CRESCIMENTO DE MICROCYSTIS AERUGINOSA à Microcystis aeruginosa, para passar a servir de alimento também a um(ns) organismo(s) invasor(es) que se fixou(aram) nas extremidades do recipiente onde o meio se encontrava. Ao 17.º dia de análise (t = 16), as amostras recolhidas deixaram de conter apenas cianobactérias, para passarem a incluir uma estrutura microscópica esférica de coloração semelhante ao Lugol. É de salientar que, com o passar do tempo, a solução adquiriu um tom cada vez mais esverdeado, consequência do aumento do número de cianobactérias na solução, e que, nos últimos dias de contagem, surgiu uma espuma acastanhada na superfície da solução, em contacto com o recipiente que a continha, que poderá corresponder à formação de espumas densas à superfície, em situações de blooms, referidas no âmbito do enquadramento teórico. Após a realização das diversas recolhas, o número de cianobactérias por mililitro de solução, em cada uma delas, foi calculado e registado, tendo com estes dados sido construída uma tabela onde consta o número de células por cada 0,025 milímetros cúbicos de cultura, tabela 4.2. Realizou-se a média do número de células, e converteu-se esse valor para o correspondente em cada mililitro de solução, através do produto dessa média por 40000, tabela 4.3, página 22. Através dos valores obtidos, e relacionando o tempo com o número de células, traçou- -se um gráfico que mostra a curva de crescimento das cianobactérias durante a actividade experimental, figura 4.1, página 23. Os valores obtidos não se afastam significativamente dos resultados esperados. A fase de latência inicial (fase Lag) praticamente não se fez sentir, o que pode ser explicado, por exemplo, pelo facto de o inóculo ter sido obtido numa fase exponencial de crescimento de uma determinada cultura. Não era de esperar, no entanto, a desaceleração no aumento dos valores que ocorre entre t = 7 e t = 15, pois o normal seria que as cianobactérias, implantadas num meio rico em azoto, fósforo e micronutrientes, proliferassem até começarem a esgotar os recursos presentes no meio de cultura (entre t = 21 e t = 23), ou o espaço disponível no recipiente. Existem, no entanto, muitos factores que justificam esta estabilização, sendo o mais evidente o facto de se dever considerar o desvio padrão e não apenas os resultados e médias obtidas. Após a fase exponencial (fase Exp), embora com a referida desaceleração intermédia, o número de células no meio estabilizou, embora não se tenha assistido a uma verdadeira fase estacionária, porque rapidamente (no intervalo de três dias) se iniciou a fase de morte, decrescendo gradualmente a densidade celular, dado que o metabolismo das células já não podia ser mantido. Apesar de já não ser visível, se o procedimento experimental continuasse por tempo indefinido, acabariam por deixar de existir cianobactérias na solução, pois as mais resistentes acabariam por consumir os recursos existentes, morrendo progressivamente face ao esgota-