UNIVERSIDADE ESTADUAL DE FEIRA DE SANTANA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE FEIRA DE SANTANA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA SIDNEI CERQUEIRA DOS SANTOS PROSPECÇÃO DE LINHAGENS BACTERIANAS PRODUTORAS DE BIOSSURFACTANTES COM POTENCIAL BIOTECNOLÓGICO NO SEMI-ÁRIDO BAIANO Feira de Santana, BA 2008

SIDNEI CERQUEIRA DOS SANTOS PROSPECÇÃO DE LINHAGENS BACTERIANAS PRODUTORAS DE BIOSSURFACTANTES COM POTENCIAL BIOTECNOLÓGICO NO SEMI-ÁRIDO BAIANO Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Biotecnologia, da Universidade Estadual de Feira de Santana como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Biotecnologia. Orientador: Prof. Dr. Milton Ricardo de Abreu Roque Co-Orientador: Prof. Dr. Juan Carlos Rossi Alva Feira de Santana, BA 2008

SIDNEI CERQUEIRA DOS SANTOS Prospecção de linhagens bacterianas produtoras de biossurfactantes com potencial biotecnológico no semi-árido baiano Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Biotecnologia da Universidade Estadual de Feira de Santana, como requisito parcial para obtenção do título de mestre em Biotecnologia. NÃO IMPRIMIR ESTÁ PÁGINA BANCA EXAMINADORA: Prof. Dra. Cristina Maria Assis Lopes Tavares da Mata Hermida Quintella Professora de Química (UFBA) e coordenadora do Laboratório de Cinética e Dinâmica Molecular (LABLASER/UFBA). Profa. Dra. Sandra Aparecida de Assis Professora de Bromatologia Aplicada e Enzimologia e Tecnologia das Fermentações (UEFS). Prof. Dr. Milton Ricardo de Abreu Roque Professor de Microbiologia (UEFS) e coordenador do Laboratório de Microbiologia Aplicada e Saúde Pública (LAMASP/UEFS). Feira de Santana, 22 de fevereiro de 2008.

AGRADECIMENTOS Especiais agradecimentos a Deus, aos meus pais, irmãos e meu cunhado, a minha namorada e a sua família, que me apoiaram e incentivaram na minha trajetória como mestrando. Meu reconhecimento é dedicado aos meus orientadores: Prof. Dr. Milton Ricardo de Abreu Roque, por ter confiado no meu trabalho e por proporcionar a conquista de mais um objetivo; e ao Prof. Dr. Juan Carlos Rossi Alva, por mais uma vez ter colaborado na minha trajetória acadêmica. Também demonstro a minha gratidão ao Prof. Dr. Milton Ricardo de Abreu Roque, coordenador do Laboratório de Microbiologia Aplicada e Saúde Pública (LAMASP) e ao Prof. Dr. Aristóteles Góes Neto, coordenador do Laboratório de Pesquisa em Microbiologia (LAPEM) da Universidade Estadual de Feira de Santana (UEFS); a Profa. Dra. Luzimar Gonzaga Fernandez, por promover o desenvolvimento de algumas atividades práticas no Laboratório de Estudos em Meio Ambiente (LEMA) da Universidade Católica do Salvador (UCSal); e a Prof. Dra. Cristina Maria Assis Lopes Tavares da Mata Hermida Quintella, coordenadora do Laboratório de Cinética e Dinâmica Molecular (LABLASER) da Universidade Federal da Bahia (UFBA), por ter me dado à oportunidade de realizar um treinamento na área de tensiometria e desenvolver os testes de tensão superficial. E por fim, os meus cordiais agradecimentos a graduanda em Ciências Biológicas Narah Cabral, ao Farmacêutico Fábio Santos Ferreira, ao M.Sc. Henrique Fortes Bahia e aos Biólogos Wilson Nascimento de Matos, Lidiane Karla Xisto Oliveira e Suikinai Nobre Santos, por ter colaborado na realização dos experimentos; ao secretário do PPGBiotec (UEFS/FIOCRUZ-BA) Helton Ricardo, pela paciência, competência e clareza na orientação administrativa do corpo discente e docente; aos colegas do Curso de PGBiotec, pela importante troca de conhecimento; aos Lemianos; ao grupo MicroAmb e ao grupo Lablaser, que me ajudaram direta ou indiretamente para a conquista do meu objetivo.

RESUMO O semi-árido brasileiro apresenta um dos mais diversificados ecossistemas de cerrado, a Chapada Diamantina, que está localizada no centro do Estado da Bahia. A biodiversidade da região representa um grande potencial para bioprospecção de produtos, pelo fato de apresentar uma originalidade fisiológica, ecológica e genética de sua biota. O objetivo do trabalho foi selecionar linhagens bacterianas, provenientes do solo rizosférico e adjacente de plantas do semi-árido baiano, visando avaliar a produção de biossurfactantes com potencial biotecnológico, utilizando substratos alternativos como fonte de carbono. O estudo foi feito a partir de linhagens bacterianas isoladas de amostras de solo rizosférico e adjacente de plantas endêmicas coletadas no Parque Municipal de Mucugê, Município de Mucugê, Bahia. As linhagens bacterianas foram selecionadas pelo método drop-collapse e a otimização da concentração de substrato, ph e temperatura no tempo realizada através do ensaio de emulsificação. A medida da tensão superficial, dos caldos livres de células cultivados nas melhores condições de cultivo, foi analisada pelo método da gota pendente. As duas linhagens bacterianas competentes foram selecionadas do solo rizosférico de Actinocephalus spp. e pertencem ao gênero Pseudomonas. As melhores condições de cultivo para produção de biossurfactante (>55%) foram à concentração de 0.5% de substrato, ph 7.0, temperatura na escala de 30-40ºC e o período de 24 a 48h de incubação. As duas linhagens de Pseudomonas spp. possuem a capacidade de reduzir as tensões superficial e interfacial dos meios e do óleo cru, respectivamente, tornando uma interessante alternativa para aplicações biotecnológicas. Palavras-Chave: Semi-árido. Mucugê. Solo. Pseudomonas. Biossurfactante. Substrato alternativo.

ABSTRACT The semi-arid Brazilian has one of the most diverse ecossystems the Chapada Diamantina, which is located in the center of the state of Bahia. The biodiversity of the region represents a great potential for bioprospecting of products, by the fact present a unique physiological, ecological and genetic of its biota. The work objective was selected bacterial strains, from the rhizosphere soil and adjacent of plants in the semi-arid Bahia, to aiming at assesses the production of biosurfactants with biotechnology potential, using substrates alternative as a source of carbon. The study was done from sampling of rhizosphere soil and adjacent of plants endemic collected in the National Park of Municipal de Mucugê, Município de Mucugê, Bahia. The bacterial strains were selected by the method drop-collapse and optimization of the concentration of substrate, ph and temperature in the time held through the test of emulsification. The measurement of the surface tension of the free broths cells grown in the best conditions of cultivation was examined by the method of drop pending. The two bacterial strains competent were selected soil rhizosphere of Actinocephalus spp. and belong to the genus Pseudomonas. The best conditions for cultivation for the production of biossurfactante (>55%) were 0.5% of the concentration of substrate, ph 7.0, temperature in the range of 30-40 C and the period of 24 to 48h of incubation. The two strains of Pseudomonas spp. have the ability to reduce the surface tension and interfacial from culture media and crude oil, respectively, making an interesting alternative for biotechnological applications. Keywords: Semi-árido. Mucugê. Soil. Pseudomonas. Biosurfactant. Alternative substratum.

LISTA DE TABELAS INTRODUÇÃO GERAL Figura 1: Forças intermoleculares no interior e na superfície de um líquido (PIRÔLLO, 2006)...14 Figura 2: Diagrama esquemático da variação da tensão superficial, interfacial e solubilização em função da concentração de biossurfactante (MULLIGAN, 2005)...15 Figura 3: Estruturas químicas de alguns biossurfactantes (CAMEOTRA; MAKKAR, 1998)...16 CAPÍTULO 1 Figura 1: Comparação da produção de emulsificado em diferentes concentrações de carboidratos no tempo: Isolados Slim03 (A1) e Slim15 (A2) nas concentrações de 0,25% ( ), 0.5% ( ), 1% ( ), 2% (X) e 3% (+) de glicose...36 Figura 2: Comparação da produção de emulsificado dos isolados Slim03 ( ) e Slim15 ( ) na concentração de 0.5% de glicose no período de 24 a 120h...37 Figura 3: Comparação da produção de emulsificado em diferentes phs e temperaturas no tempo: A1 - ph 5.0, B1 - ph 6.0, C1 - ph 7.0 e D1 - ph 8.0 nas temperaturas de 25 C ( ), 30 C ( ), 35 C ( ) e 40ºC (X) para a linhagem Slim03; A2 - ph 5.0, B2 - ph 6.0, C2 - ph 7.0 e D2 - ph 8.0 nas temperaturas de 25 C ( ), 30 C ( ), 35 C ( ) e 40ºC (X) para a linhagem Slim15...39 Figura 4: Variação da concentração da biomassa (mg/ml) ( ) e do índice de emulsificação (%)( ) dos isolados Slim03 (A1) e Slim15 (A2) no tempo...40 Figura 5: Tensão superficial (mn/m) versus concentração do caldo livre de células (%) dos isolados Slim03 ( ) e Slim15( )...41 CAPÍTULO 2 Figura 1: Comparação da produção de emulsificado com diferentes fontes de carbono no tempo: A1 - óleo de milho, B1 - óleo de girassol e C1 - glicerol para a linhagem de Pseudomonas sp. pdl01; A2 - óleo de milho, B2 - óleo de girassol e C2 - glicerol a linhagem de P. fluorescens 3B, nas concentrações de 0.5% ( ), 1% ( ), 2% ( ) e 3% (X) dos respectivos substratos...54

Figura 2: Variação da concentração da biomassa bacteriana (mg/ml) ( ) e do índice de emulsificação (%) ( ) com os substratos alternativos: A 1 - óleo de milho a 0.5%, B 1 - óleo de girassol a 0.5% e C 1 - glicerol a 5% para a linhagem de Pseudomonas sp. pdl01; e A 2 - óleo de milho a 0.5%, B 2 - óleo de girassol a 0.5% e C 2 - glicerol a 5% para a linhagem de P. fluorescens 3B...57 Figura 3: Tensão superficial (mn/m) versus concentração do caldo livre de células (%) de Pseudomonas sp. pdl01 ( ) e P. fluorescens 3B ( ): A - óleo de milho; B - óleo de girassol; e C - glicerol...59 APÊNCICE A Figura1: Curva do peso seco versus absorbância dos isolados Slim03 ( ) e Slim15 ( )...66

LISTA DE ABREVEATURAS E SIGLAS ABIP Agar Base para Isolamento de Pseudomonas APF Agar Pseudomonas para Fluorescente APP Agar Pseudomonas para Piocianina BA Bahia BLST Local Alignment Search Tool BSA Albumina de Soro Bovino CMC Concentração Micelar Crítica Dez. Dezembro DMSO Dimetilsulfóxido E 24 Índice de Emulsificação Ed. Editor ESALQ Escola Superior de Agricultura "Luiz de Queiroz" FIOCRUZ Fundação Osvaldo Cruz HUEFS Herbário da UEFS LABLASER Laboratório de Cinética e Dinâmica Molecular LEMA Laboratório de Estudos em Meio Ambiente LAMASP Laboratório de Microbiologia Aplicada e Saúde Pública LAPEM Laboratório de Pesquisa em Microbiologia MEOR Recuperação Melhorada de Petróleo MMJE Meio Mineral Jones e Edington MSM Meio Salino Mineral NCBI National Center for Biotechnology Information PCR Reação em Cadeia da Polimerase PMM Parque Municipal de Mucugê PGBiotec Pós-graduação em Biotecnologia PPGBiotec Programa de Pós-graduação em Biotecnologia SDS Sodium Dodecyl Sulfate Set. Setembro TIF Tensão Interfacial TBE Tris-Borate-EDTA TS Tensão Superficial

TSA Tryptic Soy Agar TSB Tryptic Soy Broth UCSal Universidade Católica do Salvador UEFS Universidade Estadual de Feira de Santana UFBA Universidade Federal da Bahia USP Universidade de São Paulo

SUMÁRIO INTRODUÇÃO GERAL...12 OBJETIVOS...20 GERAL... 20 ESPECÍFICOS... 20 ORGANIZAÇÃO DA PESQUISA...21 REFERÊNCAIS...22 CAPÍTULO 1: RESPOSTA DA OTIMIZAÇÃO DAS CONDIÇÕES DE CULTIVO PARA A PRODUÇÃO DE BIOSSURFACTANTE DE LINHAGENS BACTERIANAS ISOLADAS NO SEMI-ÁRIDO BAIANO...26 RESUMO... 26 Palavras-chave... 26 ABSTRACT... 26 Keywords... 26 1 INTRODUÇÃO... 27 2 MATERIAIS E METÓDOS... 28 2.1 Coleta da Amostra... 28 2.2 Isolamento e Preservação de Linhagens Bacterianas... 29 2.3 Seleção de Linhagens Bacterianas Produtoras de Biossurfactante... 30 2.4 Identificação de Linhagens Bacterianas competentes... 31 2.5 Inóculo... 31 2.6 Efeito da Concentração de Glicose na Produção de Biossurfactante... 32 2.7 Efeito do ph e Temperatura na Produção de Biossurfactante... 32 2.8 Atividade Emulsificante... 32 2.9 Produção de Biossurfactante Associado ao Crescimento Celular... 33 2.10 Concentração da Biomassa Bacteriana... 33 2.11 Medida da Tensão Superficial... 34 2.12 Análise Estatística... 35 3 RESULTADOS E DISCUSSÃO... 35 3.1 Isolamento e seleção de linhagens bacterianas produtoras de biossurfactante... 35 3.2 Identificação de linhagens bacterianas competentes... 36

3.3 Efeito da Concentração de Glicose... 36 3.4 Efeito do ph e Temperatura... 38 3.5 Produção de Biossurfactante Associado ao Crescimento Celular... 41 3.6 Medida da Tensão Superficial... 42 REFERÊNCAIS...43 CAPÍTULO 2: PRODUÇÃO DE BIOSSURFACTANTE POR LINHAGENS DE Pseudomonas spp. USANDO SUBSTRATOS ALTERNATIVOS...47 RESUMO... 47 Palavras-chave... 47 ABSTRACT... 47 Keywords... 47 1 INTRODUÇÃO... 48 2 MATERIAIS E METÓDOS... 50 2.1 Microrganismo... 50 2.2 Inóculo... 50 2.3 Efeito de Substratos Alternativos na Produção de Biossurfactante... 51 2.4 Índice de Emulsificação (E 24 )... 51 2.5 Produção de Biossurfactante Associado ao Crescimento Celular... 52 2.6 Concentração da Biomassa Bacteriana... 52 2.7 Medida da Tensão Superficial... 52 2.8 Análise Estatística... 53 3 RESULTADOS E DISCUSSÃO... 53 REFERÊNCIAS...61 CONCLUSÃO GERAL...65 APÊNDICE A...66 ANEXO A...68 ANEXO B...69

12 INTRODUÇÃO GERAL O semi-árido brasileiro abrange uma área de 1.150.662Km2, que corresponde a 74,30% da Região Nordeste e a 13,52% da superfície do Brasil (PAES et al., 2003). A caatinga representa o principal tipo vegetacional característico da região semi-árida; enquanto as manchas de mata úmida, mata estacional, cerrado e cerradão, que ocorrem espalhadas pelo semi-árido, representam vegetações residuais de períodos climáticos mais úmidos (FERNANDES, 1996). A região apresenta um dos mais diversificados ecossistemas de cerrado da biosfera, a Chapada Diamantina, que está localizada no centro do Estado da Bahia, entre as coordenadas 10 00S e 40 30 a 43 00W. Compreende uma área de 41.994 Km, constituindo-se na porção da cadeia do Espinhaço, um dos principais conjuntos montanhosos do Brasil, que se estende da Bahia até Minas Gerais (JESUS et al., 1985). Toda a região possui relevo muito acidentado, solos pobres em nutrientes e extremamente ácidos, com clima mesotérmico, caracterizado por invernos secos e verões brandos e chuvosos (TORRES; CORDEIRO; GIULIETTI, 2003). A biodiversidade do semi-árido representa um grande potencial de matériaprima para o desenvolvimento de produtos diversos, além de possuir valor econômico, social, recreativo, cultural e estético (BORÉM, 2005). Com uma flora única e rica, a Chapada Diamantina exibe mais de 3.000 espécies de Angiospermas e as mais variadas fisionomias, sendo esta diversidade comparada apenas à encontrada em regiões de Mata Atlântica, Floresta Amazônica Ocidental, Península do Cabo e Austrália (HARLEY, 1995). É também composta de uma variedade de espécies animais e de microrganismos, que apresentam potencial pouco conhecido cientificamente. É certamente pela sua biodiversidade que a Chapada Diamantina tem atraído à atenção de pesquisadores no mundo inteiro (OLIVEIRA; LONGHI-WAGNER; GIULIETTE, 2003). Isso se justifica pelo fato do semi-árido apresentar uma das biotas mais particulares do mundo, em composição e adaptações às condições do meio (INSEAR, 2005), também pelo baixo conhecimento dessa diversidade, em particular dos microrganismos, pois representa a fração biológica mais numerosa do solo e da rizosfera; participando dos ciclos biogeoquímicos (EMBRAPA, 2001),

13 realizando atividades metabólicas relevantes para o crescimento das plantas (COTANZA et al., 1997) e contribuindo com os processos ligados à cadeia trófica. Os microrganismos provenientes de ambientes, como do semi-árido, podem apresentar benefícios importantes no âmbito científico devido às condições extremas do seu habitat, como o espectro de ph, salinidade, temperatura e de nutrientes. Neste contexto, o estudo dos microrganismos fornecerá informações valiosas acerca de moléculas de interesse industrial e um excelente recurso para o desenvolvimento de novas aplicações biotecnológicas (CARDOSO et al., 2003). Bactérias, fungos e leveduras têm sido apontados como agentes transformadores eficazes, face a sua habilidade em degradar ampla gama de substâncias orgânicas (URURAHY; PEREIRA JR; MARTINS, 1998), tais como amido, celulose, quitina e hidrocarbonetos em compostos mais simples, utilizando essas substâncias como única fonte de carbono e de energia. Essas características dos microrganismos é resultado da produção de metabólitos secundários conhecidos como biossurfactantes. Algumas funções fisiológicas têm sido atribuídas aos biossurfactantes, são elas: emulsificação e solubilização de hidrocarbonetos ou compostos insolúveis em água, facilitando o crescimento de microrganismos nestes substratos (FRANCY et al., 1991), através do transporte e translocação de substrato insolúvel pela membrana celular (BOGNOLO, 1999). Porém, cepas de Bacillus subtilis produzem biossurfactantes apenas em substratos hidrossolúveis (COOPER et al., 1981); transporte de hidrocarbonetos, função atribuída aos biossurfactantes ligados à parede celular de Candida tropicalis (KAPPELI; FIECHTER, 1977), onde um aumento significativo da porção lipídica do polissacarídeo de membrana foi detectado quando o microrganismo crescia em alcanos, indicando que o complexo polissacarídeo-ácido-graxo presente na superfície celular estaria envolvido no transporte de hidrocarbonetos; aderência-liberação da célula a superfícies, uma das mais importantes estratégias de sobrevivência dos microrganismos é sua habilidade em colonizar um nicho ecológico onde possa se multiplicar. O elemento chave nesta estratégia são estruturas da superfície celular responsáveis pela aderência das células às superfícies. Os microrganismos podem utilizar surfactantes ligados à parede para regular as propriedades da superfície celular, visando aderir ou se desligar de um determinado local de acordo com sua necessidade para encontrar novos habitats com maior disponibilidade de nutrientes ou se livrar de ambientes desfavoráveis (ROSENBERG; RON, 1999); e atividade antibiótica, demonstrada por

14 vários biossurfactantes, principalmente da classe dos lipopeptídios e glicopeptídios. Os ramnolipídios de P. aeruginosa e a surfactina de B. subtilis funcionam como antibióticos, solubilizando os principais componentes das membranas celulares microbianas. Através da excreção destes biossurfactantes no meio, os microrganismos adquirem maior chance de sobrevivência e maior competitividade na busca por nutrientes (LIN, 1996). O biossurfactante é um grupo heterogêneo de molécula de superfície ativa, formado biologicamente pelo crescimento aeróbio, a partir de metabólitos microbianos (DESAI; BANAT, 1997a), utilizando como fonte de carbono carboidratos, óleos, alcanos e resíduos (LIN, 1996). Estas moléculas reduzem a tensão superficial (TS), concentração micelar crítica (CMC) e a tensão interfacial (TIF) de ambas as soluções aquosas e misturas de hidrocarbonetos (BANAT, 1995; NITSCHKE; PASTORE, 2003), além de apresentar propriedades de formação de macro e micro emulsões (BANAT, 1995; NITSCHKE; PASTORE, 2003). O efeito de um surfactante é determinado pela sua habilidade de diminuir a TS, que é a medida da superfície livre de energia requerida para conduzir a molécula da fase líquida para superfície (Figura 1). Devido à presença de um biossurfactante, menos trabalho é requerido para conduzir a molécula para superfície e a TS é reduzida. Um bom surfactante pode baixar a tensão de água de 72 para 35 mn/m e a TI (tensão entre líquidos polar e apolar) de água em face de n- hexadecano de 40 para 1mN/m (CHRISTOFI; IVSHINA, 2002; MULLIGAN, 2005). Figura 1: Forças intermoleculares no interior e na superfície de um líquido (PIRÔLLO, 2006).

15 A tensão superficial correlaciona-se com a concentração dos compostos tensoativos até o momento em que a concentração micelar crítica (CMC) é alcançada (Figura 2). A CMC é definida como a solubilidade de um tensoativo na fase aquosa, ou seja, a concentração mínima do tensoativo necessária para atingir os valores mais baixos de tensão superficial e interfacial, a partir da qual se inicia a formação de micelas, que são partículas de uma solução coloidal. Colóide é um sistema físico-químico que contém duas fases, uma das quais, a fase dispersa (micelas), está exatamente subdividida e imersa na outra, a fase dispersora. Surfactantes eficientes apresentam uma baixa concentração micelar crítica, ou seja, menos surfactante é utilizado para diminuir a tensão superficial. Na prática, a CMC é também a concentração máxima de biossurfactantes em água e é influenciada pelo ph, temperatura e força iônica (MULLIGAN, 2005). Outra função dos surfactantes é produzir emulsão, que são secretados em meio de cultura durante o crescimento dos microrganismos. O emulsificado ajuda no transporte e translocação de substrato insolúvel através da membrana celular (BOGNOLO, 1999). Figura 2: Diagrama esquemático da variação da tensão superficial, interfacial e solubilização em função da concentração de biossurfactante (MULLIGAN, 2005). Os surfactantes possuem uma estrutura molecular anfipática, constituída de uma porção hidrofóbica e uma porção hidrofílica. A cadeia apolar é freqüentemente uma cadeia hidrocarbonada enquanto a porção polar pode ser iônica (aniônica ou catiônica), não iônica ou anfotérica (Figura 3) (DESAI; BANAT, 1997b; GOUVEIA et al., 2003). Não existe relato na literatura de estrutura catiônica, entretanto em alguns

16 casos a presença de grupos contendo nitrogênio confere certo grau de caráter catiônico em partes da molécula, afetando, por exemplo, na adsorção sobre sólidos dispersados e floculação de partículas. Em comum com todas as espécies de superfície ativa, biossurfactantes contém uma ou várias partes lipofílicas e hidrofílicas. A metade lipofílica pode ser uma proteína ou um peptídio com uma alta proporção de cadeia de face hidrofóbica, mas é usualmente a cadeia de hidrocarboneto de um ácido graxo com 10-18 átomos de carbono, contudo ácido graxo de peso molecular maiores tem sido relatado. A metade hidrofílica pode ser um éster, uma hidroxila, um fosfato, um grupo carboxilado ou um carboidrato (BOGNOLO, 1999). Figura 3: Estruturas químicas de alguns biossurfactantes (CAMEOTRA; MAKKAR, 1998).

17 A presença de grupos hidrofílicos e hidrofóbicos na mesma molécula possibilita a distribuição dos surfactantes nas interfaces entre faces fluídas com diferentes graus de polaridade (óleo/água e água/óleo) (NITSCHKE; PASTORE, 2003). Os surfactantes são classificados de acordo com sua composição química e sua origem microbiana, sendo o tipo, a quantidade e a qualidade dos biossurfactantes influenciados pela natureza do substrato, concentrações de íons como P, N, Mg, O 2 e Fe - no meio de cultura, além das condições de cultivo (GEORGIOU; LIN; SHARMA, 1992). As principais classes de biossurfactantes incluem glicolipídeos, lipossacarídeos, lipopeptídeos, fosfolipídeos, ácidos graxos e lipídios neutros (BOGNOLO, 1999). As classes de biossurfactantes e os microrganismos produtores estão distribuídos entre uma extensa variedade de tipos e gêneros, respectivamente, de acordo a tabela 1. Tabela 1: Principais classes de biossurfactantes e microrganismos envolvidos. CLASSES E TIPOS DE BIOSSURFACTANTES MICRORGANISMOS Glicolipídios ramnolipídios Pseudomonas aeroginosa soforolipídios Torulopsis bombicola trehalolipídios Rhodococccus erythropolis. Mycobacterium sp. Lipopeptídios e lipoproteínas peptídio-lipídio Bacillus licheniformis viscosina Pseudomonas fluorescens serravetina Serratia marcescens subtilisina Bacillus subtilis surfactina Baciluus subtilis gramicidina Bacillus brevis polimixina Bacilllus polymyxa Ácidos graxos, lipídios neutros e fosfolipídios ácidos graxos Corynebacterium lepus lipídios neutros Nocardia erythoropolis fosfolipídios Thiobacillus thiooxidans Surfactantes poliméricos emulsan Acinetobacter calcoaceticus biodispersan Acinetobacter calcoaceticus liposan Candida lipolytica carboidrato-lipídio-proteína Pseudomonas fluorescens manana-lipídio-proteína Candida tropicalis Surfactantes particulados vesículas Acinetobacter calcoaceticus células Várias bactérias Fonte: DESAI; BANAT, 1997b.

18 O maior mercado para os biossurfactantes é a indústria petrolífera, onde são utilizados na produção de petróleo ou incorporados em formulações de óleos lubrificantes (BANAT, 1995). Outras aplicações incluem biorremediação e dispersão no derramamento de óleos, remoção e mobilização de resíduos de óleo em tanques de estocagem, e a recuperação melhorada de petróleo (MEOR). Porém, atualmente, as aplicações se distribuem entre os mais diversos setores industriais (NITSCHKE et al, 2002), entre elas, à indústria farmacêutica, de cosméticos e de alimentos, devido sua atuação como dispersantes e/ou solubilizantes de compostos orgânicos com baixa solubilidade em água (GOUVEIA et al., 2003). Acidentes com derramamento de óleo e seus derivados vem se tornando constante e têm causado muitos problemas ecológicos e sociais. A introdução desses poluentes em diferentes ambientes com relativa freqüência pode sobrepor à capacidade de recuperação do ecossistema e assim resultar na acumulação em níveis prejudiciais (RAHMAN et al., 2002), podendo levar a eliminação seletiva de espécies e acarretar modificações estruturais e funcionais da comunidade ecológica (GAYLARDE; BELLINASO; MANFIO, 2005). Os surfactantes microbianos têm grande importância na recuperação de áreas contaminadas por atividade petrolífera, devido a sua capacidade de decomposição de químicos xenobióticos no ambiente (EMBRAPA, 2001). Os xenobiontes são moléculas orgânicas produzidas por tecnologias industriais modernas e ausentes no ambiente natural. Estas moléculas se encontram em vários tipos de compostos, aplicados à indústria petrolífera, associadas com as atividades de produção, transporte e refino de petróleo, como por exemplo, as borras oleosas (RIBEIRO; 1979; TALES, 2004; URURAHY; PEREIRA JR; MARTINS, 1998); e indústria química, tais como, agrotóxicos, corantes, fármacos, polímeros e plásticos, podendo ser tóxicos a sistemas biológicos, uma vez que não fazem parte do conjunto de moléculas produzidas pelo metabolismo evolutivo que propicia a vida na Terra (GAYLARDE; BELLINASO; MANFIO, 2005). A revolução na base de conhecimento dos sistemas biológicos, a partir da biotecnologia moderna vem gerando novas oportunidades de inovação (LOPES, 2005), como a técnica de biorremediação. Métodos de biorremediação estão atualmente recebendo apoio como promissora tecnologia de tratamento ambiental de remediação de hidrocarbonetos (DESAI; BANAT, 1997b). A biorremediação pode ser definida como a conversão de compostos químicos por organismos viáveis,

19 especialmente microrganismos, que apresente funções metabólicas específicas, derivada de seleção ou pela introdução de genes, codificando tais funções em energia, massa celular e produtos de resíduo biológico inofensivo (WALTER et al., 1997). O objetivo de usar técnicas de remediação biológica é aumentar as condições de fertilidade nativa de tais solos e de melhorar a taxa de degradação dos químicos xenobiontes; eliminando, desta forma, a concentração de fontes contaminantes no ambiente e melhorando a remoção dos mesmos (RAHMAN et al., 2002). A utilização dessas substâncias como única fonte de carbono e de energia para os microrganismos, aponta como poderosa alternativa aos métodos convencionais de tratamento, sendo cada vez mais empregados na resolução de problemas ambientais (URURAHY; PEREIRA JR; MARTINS, 1998).

20 OBJETIVOS GERAL Selecionar linhagens bacterianas, provenientes do solo rizosférico e adjacente de plantas do semi-árido baiano, visando avaliar a produção de biossurfactante com potencial biotecnológico, utilizando substratos alternativos como fonte de carbono. ESPECÍFICOS Isolar, selecionar e caracterizar linhagens bacterianas produtoras de biossurfactantes, a partir de amostras de solo rizosférico e adjacente de plantas endêmicas coletadas na área do Parque Municipal de Mucugê, Chapada Diamantina. Analisar as melhores condições de cultivo para produção de biossurfactante usando matérias primas de baixo custo. Avaliar a produção de biossurfactante dos isolados bacterianos através de análise qualitativa (prova de emulsificação) e quantitativa (medida da tensão superficial). Identificar as linhagens bacterianas competentes para a produção de biossurfactantes.

21 ORGANIZAÇÃO DA PESQUISA O trabalho de dissertação está estruturado em dois capítulos, a saber: o primeiro intitulado Resposta da otimização das condições de cultivo para a produção de biossurfactante de linhagens bacterianas isoladas no semi-árido baiano aborda a seleção de linhagens bacterianas provenientes do solo rizosférico e adjacente de plantas, assim como a avaliação das melhores condições de cultivo para produção de biossurfactante; e o segundo intitulado Produção de biossurfactante por linhagens de Pseudomonas spp. usando substratos alternativos visa avaliar a produção de biossurfactante de linhagens de Pseudomonas spp., através da utilização de diferentes fontes de carbono. Por fim, a conclusão, onde são pontuadas o tipo de contribuição do trabalho para o avanço científico e tecnológico, e as possíveis perspectivas do objeto de estudo.

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26 CAPÍTULO 1: RESPOSTA DA OTIMIZAÇÃO DAS CONDIÇÕES DE CULTIVO PARA A PRODUÇÃO DE BIOSSURFACTANTE DE LINHAGENS BACTERIANAS ISOLADAS NO SEMI-ÁRIDO BAIANO RESUMO: A biodiversidade do semi-árido representa um grande potencial de matéria-prima devido às particularidades do seu ambiente, o que torna um importante local para o estudo de biomoléculas de interesse biotecnológico. O objetivo do trabalho foi selecionar linhagens bacterianas do solo rizosférico e adjacente de plantas do semi-árido baiano, visando avaliar as melhores condições de cultivo para produção de biossurfactante. As amostras de solo foram coletadas de plantas endêmicas da família Verbenaceae e Eriocaulaceae no Parque Municipal de Mucugê, Bahia. As linhagens bacterianas foram selecionadas pelo método dropcollapse, sendo a otimização dos tratamentos realizada através do ensaio de emulsificação e a medida da tensão superficial analisada pelo método da gota pendente. As duas linhagens bacterianas competentes foram selecionadas do solo rizosférico de Actinocephalus spp. e pertencem ao gênero Pseudomonas. As melhores condições de cultivo para produção de biossurfactante (>55%) foram a concentração de 0.5% de glicose, ph 7.0, temperatura na escala de 30-40ºC e o período de 24 a 48h de incubação. As duas linhagens bacterianas apresentaram a capacidade de reduzir as tensões superficial e interfacial do meio e do óleo cru, respectivamente. Os resultados obtidos confirmam a influência ambiental no metabolismo de microrganismos, tornando uma interessante alternativa para aplicações biotecnológicas. Palavras-chave: Semi-árido. Mucugê. Solo. Linhagem bacteriana. Biossurfactante. ABSTRACT: Biodiversity of the semi-arid region is a great potential of raw materials due to the particularities of their environment, which makes it an important place for the study of biomoleculs of interest biotechnology. The work objective was selected bacterial strains, from the rhizosphere soil and adjacent of plants in the semi-arid Bahia, to aiming at assesses the best conditions of cultivation for the production of biosurfactant. Soil samples were collected from plants endemic of the family Verbenaceae and Eriocaulaceae at Park Municipal de Mucugê, Bahia. The bacterial strains were selected by the method drop-collapse, and the optimization of processing performed by the test of emulsification and measurement of surface tension analyzed by the method of drop pending. The two bacterial strains competent were selected soil rhizosphere of Actinocephalus spp. and belong to the genus Pseudomonas. The best conditions for cultivation for the production of biosurfactant (>55%) were the concentration of 0.5% glucose, ph 7.0, temperature in the range of 30-40 C and the period of 24 to 48h of incubation. The two bacterial strains showed the ability to reduce the surface tension and interfacial from culture media and crude oil, respectively. The results confirm the environmental influence on the metabolism of microorganisms, making an interesting alternative for biotechnological applications. Keywords: Semi-árido. Mucugê. Soil. Bacterial strain. Biosurfactant.

27 1 INTRODUÇÃO O interesse em biossurfactantes tem crescido consideravelmente nos últimos anos, pois eles são candidatos em potencial para muitas aplicações comerciais, incluindo as indústrias de petróleo, farmacêutica, biomédica e de processamento de alimentos (DESAI; BANAT, 1997). Tal fato vem promovendo uma grande busca por isolamento de microrganismos capazes de produzir biossurfactantes. Entretanto, é preciso ficar atento às etapas de crescimento celular e ao acúmulo de produtos metabólicos, que são fortemente influenciados pela composição do meio, como por exemplo, fonte de carbono, nitrogênio e sais inorgânicos, pois isso dificulta a pesquisa por ser um fator importante para otimização de vários processos biotecnológicos, tendo em vista os vários parâmetros envolvidos (LI et al., 2002). A otimização do meio de cultivo envolve mudança de uma variável no tempo, ajustado a outros parâmetros fixos. Existem também experimentos com uma grande possibilidade de combinação fatorial, mas de difícil avaliação da variável teste, devido à necessidade de um grande número de experimentos (SEN, 1997). O mais recomendado é avaliar o resultado do cultivo e estimar o principal efeito de acordo ao modelo linear, selecionando a variável que tiver a melhor influência sob a produção para novos estudos (RODRIGUES et al., 2006). Fatores ambientais e condições de crescimento tais como ph, temperatura, agitação, viabilidade de oxigênio e salinidade também afetam a produção de biossurfactantes, alterando o crescimento celular e suas atividades vitais (DESAI; BANAT, 1997). Porém, pode fornecer informações importantes para a seleção da área de estudo, devido à relação paralela entre o ambiente e o crescimento celular associado à produção de biossurfactantes, visto que alguns biossurfactantes apresentam elevada estabilidade térmica e de ph podendo ser utilizados em ambientes com condições mais drásticas, apresentando estabilidade a temperaturas em torno de 75 C por até 140 h e de ph entre 5 e 12 (HOROWITZ; GILBERT; GRIFFIN, 1990), além de suportar concentrações de até 10% de NaCl (BOGNOLO, 1999). O semi-árido é uma das regiões que apresenta uma biodiversidade de grande relevância devido às particularidades da sua biota (INSEAR, 2005). Os organismos

28 estão extremamente adaptados às condições desfavoráveis do ambiente como solos com alta salinidade, pobres em nutrientes e extremamente ácidos, além das altas temperaturas (CARDOSO et al., 2003), que chegam até 60 C na rocha nua. Esta alta taxa de biodiversidade do semi-árido, principalmente na Chapada Diamantina, tornou-se alvo de interesse da comunidade científica (OLIVEIRA; LONGHI- WAGNER; GIULIETTE, 2003), do governo e de empresas, visto que é uma área de pouco conhecimento quantitativo e qualitativo de suas espécies (INSEAR, 2005). A diversidade microbiana apresenta características aplicáveis à biotecnologia devido às condições extremas do ambiente, que fornecem aos microrganismos características metabólicas novas e/ou recombinação de genes de interesse, sendo o produto do seu metabolismo de grande importância para aplicação de processos biotecnológicos (CARDOSO et al., 2003). Neste contexto, o objetivo do trabalho foi selecionar linhagens bacterianas, provenientes do solo rizosférico e adjacente de plantas do semi-árido baiano, visando avaliar as melhores condições de cultivo para produção de biossurfactante. 2 MATERIAIS E METÓDOS 2.1 Coleta da Amostra A coleta do solo rizosférico e adjacente foi realizada em duas áreas do Parque Municipal de Mucugê (PMM), Município de Mucugê, Bahia, em um período de seca (verão) e em um período de frio (inverno), sendo a área 1 localizada à S13 00'06'' e W41 20'54'' e a área 2 à S12 59'36'' e W41 20'33'', dentro de um transecto de 50 X 2 metros. Para a obtenção de amostras da rizosfera, o sistema radicular de plantas da família Verbenaceae (Stachytarpheta crassifolia) e Eriocaulaceae (Actinocephalus spp., Syngonanthus giuliettae e S. mucugensis) foi retirado e acondicionado em sacos plásticos juntamente com o solo adjacente. As espécies vegetais foram catalogadas através de uma ficha de coleta com a

29 identificação confirmada no Herbário da UEFS (HUEFS) e as amostras de solo foram analisadas quanto à composição, de acordo a tabela 1. Tabela 1: Análise química dos solos adjacentes das espécies de plantas coletadas no Parque Municipal de Mucugê (PMM): Stachytarpheta crassifolia (Amostra 1), Actinocephalus spp. (Amostra 2), Syngonanthus mucugensis parte alta do PMM (Amostra 3) e S. mucugensis parte baixa do PMM (Amostra 4). CTC, capacidade de troca catiônica; V, condutividade; MO, matéria orgânica. 2.2 Isolamento e Preservação de Linhagens Bacterianas As amostras de solo rizosférico e adjacente foram peneiradas, homogeneizadas e deixadas por 30 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, foram retiradas sub-amostras de 10g de cada ponto de amostragem para serem adicionadas em Erlenmeyers de 500mL contendo 90mL de solução salina (0,9%). As amostras foram incubadas em agitador orbital (150rpm) a 30ºC, por 15 minutos (ROQUE; MELO, 2000). Após o período sob agitação, foram realizadas diluições em série, sendo retirada alíquotas de 100µL das diluições de 10-2, 10-3 e 10-4, inoculadas e semeadas, em triplicata, na superfície dos seguintes meios contidos em placas de Petri: King`s B (g/l de água destilada; protease peptona nº 03, 10,0g; K 2 HPO 4, 1,5g; MgSO 4.7H 2 O, 1,5g; glicerol, 10mL; ágar, 15,0g; ph 7,0 0,2), meio mineral Jones e Edington (MMJE) (água destilada, 1000mL; K 2 HPO 4, 2,0g; MgSO 4.7H 2 O, 0,2g; CaCl 2.2H 2 O, 0,1g; NaCl, 0,1g; FeCl 3, 0,01g; NH 4 NO 3, 0,5g; ágar, 15,0g) e meio salino mineral (MSM) (g/l de água destilada; K 2 HPO 4, 4,0g; Na 2 HPO 4, 1,5; NaNO 3, 1,0; MgSO 4.7H 2 O, 0,2g; CaCl 2.2H 2 O, 0,02g; FeCl 3.6H 2 O, 0,02g; ágar, 15,0g; ph 7,0 0,2), descrito por Bodour e Miller-Maier (1998), modificado. Após um período de 24 a 72h de incubação (30 C), foi realizada a contagem de unidades formadoras de

30 colônia por grama de solo (UFC/g -1 de solo). Os isolados bacterianos foram purificados em tryptic soy agar (TSA) (Himedia) e mantidos no meio preparado de tryptic soy broth (TSB) com 15% de glicerol a -80 C. 2.3 Seleção de Linhagens Bacterianas Produtoras de Biossurfactante As colônias puras isoladas foram inoculadas em 10mL de meio salino mineral (MSM) (água destilada, 1000mL; K 2 HPO 4, 4,0g; Na 2 HPO 4, 1,5; NaNO 3, 1,0; MgSO 4.7H 2 O, 0,2g; CaCl 2.2H 2 O, 0,02g; FeCl 3.6H 2 O, 0,02g; ph 7,0 0,2) (BODOUR; MILLER-MAIER, 1998, modificado), utilizando 2% glicose (p/v) como única fonte de carbono e energia. As culturas foram incubadas no agitador orbital a 30 C, sob agitação de 180 rpm, por 48. O cultivo dos isolados microbianos foi centrifugado (Hettich, Universal 32R) a 4.000 rpm, por 20 minutos (10ºC) (ILORI; AMOBI; ODOCHA, 2005), para remover as células bacterianas e sobrenadante obtido armazenado para o teste drop-collapse. As linhagens bacterianas foram selecionadas pela técnica drop-collapse (BODOUR; MILLER-MAIER, 1998; YOUSSEF, et al., 2004), onde 2µL de óleo mineral (Nujol), a base de hidrocarboneto de petróleo, foi adicionado em poços de uma microplaca de 96 poços. O óleo foi repousado nos poços por 24 horas a temperatura ambiente e 5 µl do caldo livre de células foi adicionado na superfície do óleo. O controle positivo foi realizado com 5 µl de sodium dodecyl sulfate (SDS) (J.T.BAKER) a 1% e os controles negativos com 5 µl de água destilada e 5 µl do meio não inoculado. Após 1 minuto, foi realizada a leitura visual da forma da gota na superfície do óleo, sendo o resultado considerado positivo quando ocorreu o espalhamento total ou parcial da gota e negativo quando a gota permaneceu inalterada.

31 2.4 Identificação de Linhagens Bacterianas competentes As linhagens bacterianas selecionadas foram identificadas baseadas nas caracterizadas fenotípicas tais como: morfologia das colônias e celular em esfregaços corados pelo método de Gram; provas bioquímicas; meios seletivos - agar Pseudomonas para fluorescente (APF) (Himedia), agar Pseudomonas para piocianina (APP) (Himedia), agar base para isolamento de Pseudomonas (ABIP) (Himedia) e agar cetrimide (Merck); e análise filogenética. O DNA genômico foi extraído usando o protocolo Fenol-Clorofórmio-Álcool isoamílico (25:24:1), descrito por Sambrook, Maniatis e Frisch (2001) (Anexo A). A região do 16S rrna foi amplificada no termociclador (GeneAmp, PCR System 9700), utilizando os iniciadores fd1 (5 - AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3 ) e rp2 (5 - ACGGCTACCTTGTTACGACTT 3 ), segundo Weisburg e colaboradores (1991) (Anexo B). A eletroforese em gel de agarose do produto da PCR foi realizada com 0.8% de agarose (Pronadisa) em tampão Tris-borate-EDTA (TBE) (SAMBROOK; FRITSH; MANIATIS, 2001), a 100 V, por 50 minutos, a temperatura ambiente. O produto amplificado foi purificado com o kit GFX TM PCR DNA, seguindo as especificações do manual da Amersham Biosciences. O fragmento de 16S rrna obtido foi seqüenciado e analisado quanto a sua similaridade para pesquisa de nucleotídeos no Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) do National Center for Biotechnology Information (NCBI, www.ncbi.nlm.nih.gov), visando a identificação da espécie. 2.5 Inóculo As linhagens bacterianas foram semeadas em TSA e incubadas a 30ºC por 24h. Em seguida, foi feito um novo repique a partir do cultivo anterior e semeado em TSA por mais 24h. Após essa etapa, foi realizado uma suspensão bacteriana em solução salina (0,9%), a partir da escala padrão de densidade ótica 1.0 (10 8 UFC ml -1 ) no filtro de 600 nm (ROBERT et al., 1989, modificado).

32 2.6 Efeito da Concentração de Glicose na Produção de Biossurfactante Foi realizado um inóculo de 3 ml da suspensão bacteriana analisada em um erlenmeyer de 500 ml contendo 100 ml de MSM (ph 7.0 ± 0.2) com as seguintes concentrações de glicose: 0.25, 0.5, 1, 2, 3, 4% (p/v), como única fonte de carbono e energia, correspondendo as taxas de 2.5, 5, 10, 20, 30 e 40 g/l, respectivamente. Um erlenmeyer controle de 500 ml contendo 100 ml de MSM (ph 7.0 ± 0.2) não inoculado foi preparado para cada concentração de glicose. A amostra foi incubada no agitador orbital a 30 C, na rotação de 180 rpm, por 5 dias, sendo retirado alíquota de 2,5 ml do cultivo bacteriano a cada 24h e centrifugado (4000 rpm, 20 min, 10 C) para determinação do índice de emulsificação (E 24 ). 2.7 Efeito do ph e Temperatura na Produção de Biossurfactante Foi realizado um inóculo de 3 ml da suspensão bacteriana em um erlenmeyer de 500 ml contendo 100 ml de MSM, utilizando a melhor concentração de glicose (p/v) como única fonte de carbono e energia, com as temperaturas de 25, 30, 35 e 40 C (± 0,2 C) e phs de 5,0; 6,0; 7,0 e 8,0 (± 0,2). Um erlenmeyer controle de 500 ml contendo 100 ml de MSM (0.5% de glicose) não inoculado foi preparado para cada temperatura e ph analisado. A amostra foi incubada no agitador orbital na rotação de 180 rpm, por 5 dias, sendo retirado alíquota de 2,5 ml do cultivo bacteriano a cada 24h e centrifugado (4000 rpm, 20 min, 10 C) para determinação do índice de emulsificação (E 24 ). 2.8 Atividade Emulsificante O ensaio de emulsificação foi realizado usando 2 ml do caldo livre de células e 2 ml de óleo mineral puro (Nujol), a base de hidrocarboneto de petróleo, foram

33 transferidos para tubos (100mm x 15mm). Em seguida, a mistura foi agitada no vórtex (Ika, MS1 Minishaker) durante 2 minutos e deixado em repouso por 24 horas. A produção de biossurfactante foi medida através do índice de emulsificação (E 24 ), dividindo a altura da camada emulsificada (mm) pela altura total da coluna líquida (mm) e multiplicado por 100. O controle negativo foi realizado com 2 ml de MSM não cultivado e o controle positivo com 2 ml de SDS (J.T.BAKER) a 1%. Os resultados foram expressos em porcentagem (%) (IQBAL et al., 1995; DAS et al., 1998). 2.9 Produção de Biossurfactante Associado ao Crescimento Celular Foi determinada a relação entre crescimento celular e a produção de emulsificado com as melhores condições de cultivo no tempo. Foi retirado alíquotas de 3 ml do cultivo a cada 24h e transferido 2,5 ml para uma cubeta de quartzo (Plastibrand) para leitura da densidade ótica (600 nm), no programa simple reads do espectrofotómetro (Cary, 50 Probe), visando obter a concentração da biomassa bacteriana, de acordo a curva de calibração do peso seco versus absorbância. A produção de biossurfactante foi observada através da formação de emulsificado, retirando alíquotas de 2,5 ml a cada 24h de incubação e centrifugado a 4000 rpm, por 20 min, a 10 C, para a obtenção do caldo livre de células. 2.10 Concentração da Biomassa Bacteriana As linhagens bacterianas foram semeadas em TSA e incubadas na estufa de crescimento a 30 C, por 24h. Posteriormente, as colônias bacterianas foram transferidas para erlenmeyers de 500 ml, contendo 100mL de TSB, sob a agitação de 180 rpm, a 30 C, por 48h. O cultivo bacteriano foi centrifugado a 4.000 rpm, por 20 minutos, e a biomassa bacteriana ressuspendida em 5 ml de água destilada para