CRIOPRESERVAÇÃO DE FUNGOS LIGNOCELULÓSICOS E OTIMIZAÇÃO DE SUBSTRATOS A PARTIR DE RESÍDUOS AGROINDUSTRIAIS

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Walter de Oliveira Maranhão
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1 UNIVERSIDADE PARANAENSE MESTRADO EM BIOTECNOLOGIA APLICADA À AGRICULTURA CRIOPRESERVAÇÃO DE FUNGOS LIGNOCELULÓSICOS E OTIMIZAÇÃO DE SUBSTRATOS A PARTIR DE RESÍDUOS AGROINDUSTRIAIS TALITA RAFAELE D AGOSTINI MANTOVANI UMUARAMA 2008

2 TALITA RAFAELE D AGOSTINI MANTOVANI CRIOPRESERVAÇÃO DE FUNGOS LIGNOCELULÓSICOS E OTIMIZAÇÃO DE SUBSTRATOS A PARTIR DE RESÍDUOS AGROINDUSTRIAIS Dissertação apresentada como parte das exigências para a obtenção do grau de mestre no programa de Mestrado em Biotecnologia Aplicada à Agricultura da Universidade Paranaense UNIPAR, sob orientação do Prof. Dr. Nelson Barros Colauto UMUARAMA 2008

para a obtenção do grau de mestre no programa de Mestrado em Biotecnologia Aplicada à Agricultura

3 Dedico este trabalho a minha família, meu marido e meu filho.

4 AGRADECIMENTOS - A Deus, que me deu forças para superar as dificuldades, conforto nas horas difíceis e a oportunidade de concluir mais esta etapa em minha vida. - À Fundação Araucária pela bolsa concedida. - Ao meu orientador, Dr. Nelson Barros Colauto pelos ensinamentos, paciência e conselhos. - Igualmente à Professora Drª. Giani Andrea Linde Colauto, pela contribuição neste trabalho e experiência de vida que soube transmitir dentro e fora do laboratório. - Aos meus colegas de Mestrado, Liliana, Keiko, Cleiton, Fabiano e Rafael, e principalmente à Francielly que dividiu comigo todos os momentos. - Aos colegas do Laboratório de Biologia Molecular, que sempre me socorreram quando precisei de ajuda, bem como à Profª. MSc. Juliana Silveira do Valle e todos os técnicos de laboratório da Unipar. - A todos os professores que sempre me incentivaram no amor à biologia; - Aos meus pais, Rivaldo e Laura, que nunca mediram esforços para o meu sucesso; às minhas irmãs, Páblia e Érica, que sempre me auxiliaram, especialmente à Érica que com toda a ajuda no laboratório foi fundamental para a conclusão deste trabalho. - E finalmente ao meu marido, João Paulo, por toda paciência nestes anos de pesquisa, e ao meu filho Leonardo, que nasceu durante o mestrado e mesmo tão pequeno soube compreender minhas ausências e me confortar com seu amor.

Giani Andrea Linde Colauto, pela contribuição neste trabalho e experiência de vida que soube transmitir dentro e fora do laboratório.

5 TALITA RAFAELE D AGOSTINI MANTOVANI CRIOPRESERVAÇÃO DE FUNGOS LIGNOCELULÓSICOS E OTIMIZAÇÃO DE SUBSTRATOS A PARTIR DE RESÍDUOS AGROINDUSTRIAIS RESUMO Os basidiomicetos Pleurotus sp e Lentinula edodes são fungos lignocelulósicos com capacidade de degradar diversos materiais, devido à produção de enzimas extracelulares, principalmente enzimas lignolíticas como a lacase. Esta enzima atua em materiais lignocelulósicos, possibilitando a utilização de diversos resíduos agroindustriais para o cultivo de cogumelos, produzindo biomassa de interesse terapêutico e nutricional, agregando valor a resíduos que seriam descartados. A manutenção adequada do micélio destes fungos é necessária para a preservação de suas características biológicas. A criopreservação é uma das técnicas mais utilizadas na preservação de fungos, sendo que a utilização de temperaturas mais elevadas neste processo o torna acessível à produtores e a centros de pesquisa. Dessa forma o objetivo deste trabalho foi avaliar aspectos da criopreservação de fungos lignocelulósicos e otimização de substratos a partir de resíduos agroindustriais. Realizou-se o crescimento micelial de Pleurotus sp e Lentinula edodes em diferentes subprodutos da agroindústria, caracterizados físico e quimicamente, em placas de Petri. Os melhores meios de cultivo em placas de Petri e a melhor linhagem foram selecionados para o crescimento micelial dos fungos em tubos de borosilicato. Após estas etapas foi realizada a determinação da atividade da enzima lacase nos dois melhores substratos de cultivo do teste em tubos de borosilicato. Para a preservação das linhagens foi realizado primeiramente um teste de inibição do crescimento micelial em diferentes concentrações de crioprotetores. A concentração de crioprotetor mais adequada foi utilizada para criopreservar a temperaturas de -20 ºC ou -70 ºC os fungos previamente crescidos em meio de batata-dextrose-ágar e em diferentes grãos. A recuperação do fungo foi feita após 30 dias e um ano de congelamento. Observou-se que os fungos Pleurotus sp e Lentinula edodes são capazes de degradar diversos resíduos da agroindústria, sendo que a produção de biomassa e de lacase é influenciada pelas características físico-químicas do substrato de cultivo. A utilização de grãos associados à crioprotetores viabiliza a criopreservação de Pleurotus ostreatus à -20 ºC, mas não viabilizam a criopreservação de Lentinula edodes nas mesmas condições. Palavras-chave: Crescimento micelial, resíduos agroindustriais, lignina, substrato, criopreservação.

Esta enzima atua em materiais lignocelulósicos, possibilitando a utilização de diversos resíduos agroindustriais para o cultivo de cogumelos, produzindo biomassa de interesse terapêutico e

6 TALITA RAFAELE D AGOSTINI MANTOVANI AGROINDUSTRIAL BY-PRODUCT SUBSTRATUM OTIMIZATION AND CRYOPRESERVATION OF LIGNOCELLULOSIC FUNGI ABSTRACT Pleurotus sp and Lentinula edodes are lignocellulolytic Basidiomycetes that degrade several lignocellulosic materials with extracellular enzymes as lacase. This enzyme acts in lignocellulosic materials turning possible the use of different agroindustrial byproducts for therapeutic and nutritional mycelial biomass production adding value to residues. To preservation of biological characteristics the appropriate maintenance of fungi is necessary. Cryopreservation is one of the main techniques used on fungus preservation, and the use of higher temperatures for preservation would make this process more accessible to mushroom producers and research centers. The objective of this study was to optimize agroindustrial by-product substratum and cryopreserve lignocellulosic fungi. Pleurotus sp and Lentinula edodes. Firstly different agroindustrial by-products on a Petri dish was tested for mycelial growth. The best substratum and strain selected were tested in cylindrical borosilicate test tubes. After that the best two results were used to proceed the laccase activity test. For preservation of the strains it was done a mycelial growth inhibition test on agarpotato-dextrose with different cryoprotector concentrations. The best cryoprotector concentration was used to cryopreserve the fungi mycelial, previously grew on agarpotato-dextrose and on different grains, at both -20 ºC and -70 ºC. The recovery of the strains was made after 30 days and a year of freezing. It was observed that Pleurotus sp and Lentinula edodes are able to degrade several lignocellulosic residues, depending of physical and chemical characteristics of the substrate, producing different quantities of biomass and laccase. The use of grains associated with cryoprotectors make it possible to cryopreserve Pleurotus ostreatus at -20 ºC but not Lentinula edodes. Key words: Mycelial growth, agroindustrial by-products, lignin, preservation, cryopreservation.

This enzyme acts in lignocellulosic materials turning possible the use of different agroindustrial byproducts for therapeutic and nutritional mycelial biomass production adding value to residues.

8 SUMÁRIO RESUMO ABSTRACT 1. INTRODUÇÃO Fatores físico-químicos presentes no substrato de cultivo de Pleurotus sp Fatores físico-químicos presentes no substrato de cultivo de Lentinula edodes Uso de grãos para criopreservação a -20 ºC e a -70 ºC de Pleurotus ostreatus Uso de grãos para criopreservação a -20 ºC e a -70 ºC de Lentinula edodes CONCLUSÕES GERAIS REFERÊNCIAS GERAIS... 85

Fatores físico-químicos presentes no substrato de cultivo de Lentinula edodes... 35 4.

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