EXAMES ELISA COM CUT OFF E OD. O QUE SIGNIFICAM? O limiar de reatividade ou cut off de um teste é entendido como o ponto de corte de um teste, isto é, o valor acima do qual se deverá considerar o resultado como reagente, e abaixo do qual é considerado não reagente. No ELISA o resultado de uma reação é definido pela leitura da absorbância ou densidade óptica (OD) em espectrofotômetro, utilizando um filtro com comprimento de onda indicado pelo fabricante. Cada conjunto para diagnóstico (kit) tem a sua forma de calcular o cut-off (CO), ou seja, o seu ponto de corte, acima ou abaixo do qual as amostras são consideradas reagentes, ou não reagentes. Da mesma forma o fabricante define se os testes podem apresentar resultados indeterminados. As amostras indeterminadas são aquelas cujos valores de OD estão incluídos na zona cinza ( borderline ). A zona cinza compreende a faixa de valores em torno do CO, dentro da qual não se pode ter certeza do resultado, e podem corresponder a resultados falso negativos e falso positivos. Esta condição é observada, por exemplo, nos testes para leishmaniose. Em geral, o fabricante do conjunto diagnóstico indica como definir a zona cinza. Quando não existir a orientação do fabricante, recomenda-se que sejam interpretados com critérios clínicos os resultados com valores de OD incluídas no intervalo de 10% a 20% abaixo ou acima do valor do cut-off. A rigor, não existe um teste sorológico que estabeleça sempre o que é um resultado positivo e um negativo, pois sempre podem existir amostras cujos resultados ficam em uma zona duvidosa ou zona cinza. É importante ter em mente que os testes sorológicos pesquisam a resposta do paciente ao contato com o agente (seja pesquisa de anticorpos da classe IgM ou IgG), e por isso não podem ser interpretados diretamente como presença de infecção, a partir de um resultado reagente. Reagente representa que há anticorpos em nível considerado compatível com aquele que é observado em um animal infectado, mas não significa que o animal está infectado por que tem anticorpos nesse determinado nível.
Por que a informação do cut off e OD da amostra no laudo pode trazer benefício à interpretação do resultado? Afinal, a informação que interessa é se o resultado é reagente/positivo ou não reagente/negativo... Interpretar o resultado considerando além do status reagente ou não reagente a proximidade do ponto de corte pode auxiliar a tomada de decisões. Animais com quadro suspeito, resultado não reagente, mas próximos ao limite do ponto de corte podem, com essa informação, e dentro de um critério clínico, ser reavaliados dentro de 30 dias para verificar a evolução da resposta de anticorpos. Da mesma forma, animais assintomáticos, reagentes, mas próximos ao ponto de corte, deverão ser reavaliados para confirmar o resultado. Animais já diagnosticados e submetidos a tratamento podem ser acompanhados (no mínimo 60 dias após tratamento), pois apesar de haver anticorpos (IgG pode permanecer por meses) é possível comparar a diferença entre a OD e o cut off do primeiro teste, com a diferença entre a OD e o cut off do segundo teste, para verificar se há declínio na leitura (não é indicado comparar apenas a OD de um teste com a OD do outro). O conhecimento do cutt off permite melhor avaliação do resultado obtido, o que juntamente com dados do histórico, achados clínicos e exames complementares pode orientar a conduta clínica, tanto no sentido de iniciar a terapêutica, quanto a necessidade de avaliação com exames complementares para confirmar a ausência/presença da infecção. Quais exames complementares básicos posso utilizar para auxiliar a interpretar os testes sorológicos para Babesia, Ehrlichia e Leishmania? O hemograma oferece, a grosso modo, informações sobre os 3 principais tipos de células no sangue (eritrócitos/hemácias, leucócitos e plaquetas). As contagens destas células, tanto total como o percentual delas em relação ao todo auxiliam a interpretar as respostas do organismo a uma série de condições anormais, ou não-fisiológicas. Outro exame que pode contribuir é a urinálise, oferecendo informações sobre o estado de hidratação, lesão e função renal e principalmente a perda de proteínas (importante marcador precoce de lesão glomerular, observada nas infecções por estes agentes). Mas a obtenção da amostra limita seu uso. E considerando um perfil básico, a determinação de proteínas séricas totais e suas frações, também denominada relação AG, que é a relação entre as frações albumina e globulina. A eletroforese de proteínas oferece uma avaliação mais ampla, e pode ser utilizada, sempre que possível (sobretudo na leishmaniose). Lembrando que sorologia reagente representa que há anticorpos, mas não significa que o animal está infectado e precisa ser tratado.
Porque utilizar as proteínas totais e frações como exame complementar nos casos de erliquiose, além do hemograma? O hemograma tem sido utilizado como principal ferramenta para auxiliar o diagnóstico da erliquiose canina, e em alguns casos, sozinho já pode fechar o diagnóstico. No hemograma, em geral, as principais alterações hematológicas observadas em casos de erliquiose incluem trombocitopenia, anemia e leucopenia leves durante a fase aguda, trombocitopenia leve, anemia leve e linfocitose relativa em alguns casos, na fase subclínica, e pancitopenia durante a fase crônica grave. Mas porque é indicado avaliar as proteínas séricas juntamente com o hemograma e os testes sorológicos? A hipoalbuminemia e hiperglobulinemia estão entre as principais alterações bioquímicas em casos de erliquiose. Nos hemogramas acompanhados pela proteína plasmática total já se nota a elevação das globulinas refletida na PPT, normalmente elevada já na fase aguda. O aumento da permeabilidade vascular e consequente perda de albumina é a causa da hipoalbuminemia durante a fase aguda e subclínica da infecção. Na fase crônica, a perda de albumina ocorre principalmente através dos rins quando há glomerulonefrite. Além disso, a diminuição da concentração de albumina é um mecanismo compensatório decorrente da hiperglobulinemia, de modo a manter o equilíbrio oncótico e prevenir hiperviscosidade sanguínea. Apesar dos altos níveis de globulinas (na eletroforese nota-se que é devido à hipergamaglobulinemia, geralmente de natureza policlonal) observados em casos de erliquiose, interessantemente, não há relação direta entre a produção de gamaglobulinas e o título de anticorpos; sugerindo que o agente E. canis também induz a produção de anticorpos não específicos e que estes não são responsáveis pelo aumento nos níveis de gamaglobulinas. Este fenômeno é descrito em doenças que cursam com prolongada estimulação antigênica e corrobora a ocorrência de uma resposta imune exagerada porém de efeito protetor limitado. Em razão disso, a fração globulina se eleva durante o quadro infeccioso, mas retorna a seus níveis normais após o tratamento bem sucedido, mesmo com a permanência de anticorpos específicos detectáveis (e altos) pelos testes sorológicos. Da mesma forma, pacientes sem a infecção mas com altos níveis de anticorpos específicos (reagentes nos testes sorológicos), não apresentam elevação das globulinas compatível com um quadro infeccioso. Isso permite utilizar as proteínas séricas tanto para interpretar os testes sorológicos quanto para acompanhar o tratamento, já que retornam aos níveis basais muito antes do declínio de anticorpos.
Por que os resultados de testes que pesquisam IGM não apresentam boa sensibilidade para investigar quadros de erliquiose aguda ou exposição recente? IgM não é considerado um indicador fiável da exposição a E. canis devido ao desenvolvimento inconsistente de anticorpos IgM no decurso da doença. Muitos animais não apresentam níveis detectáveis de IgM na fase aguda (resposta tardia), e em grande parte dos casos o paciente só é apresentado para avaliação clínica na fase subclínica. Outro aspecto (comum em áreas endêmicas) é que em função de exposições consecutivas ao agente pode haver resposta anamnéstica (predominantemente de IgG) que suprime a produção de IgM, mesmo após exposição recente. A figura ao lado representa a linha do tempo das respostas imunes. A resposta primária ocorre após um período de latência (Lag). A resposta de IgM é a primeira, seguida pela resposta secundária (resposta anamnéstica) que atinge um título superior, dura mais tempo e é constituída predominantemente por IgG. Fonte: Microbiologia Médica - Patrick Murray,Ken S. Rosenthal,Michael A. Pfaller pág 78 Em contraste, os títulos de IgG > 1: 40 obtidos por RIFI, ou leitura da OD acima do ponte de corte, obtida por ELISA, são considerados positivos para a exposição de E. canis, mas não representam necessariamente infecção (resposta anamnéstica). Para infecções em curso dois testes IgG consecutivos, por RIFI (neste caso RIFI com diluição total para permitir acompanhar o título), ou por ELISA com cut off, com 20 dias de intervalo, são recomendados, e um aumento nos títulos de anticorpos ou na leitura da OD da amostra será sugestivo de uma infecção ativa. Novamente, utilizar as proteínas séricas pode auxiliar a interpretar os testes sorológicos, permitindo avaliar qual a melhor conduta no caso. Como avaliar o resultado do tratamento? Em todos os casos o resultado do tratamento deve ser avaliado pela remissão de sinais clínicos, juntamente com o retorno dos padrões hematológicos e diminuições na globulina (ou mais especificamente, na gamaglobulina avaliada por eletroforese), e se for realizada a urinálise, pela ausência de níveis elevados de proteínas na urina.
É esperado um declínio nos níveis de anticorpos. Porém, anticorpos IgG anti-ehrlichia (ou Babesia e Leishmania) podem persistir por vários meses a anos após o tratamento e eliminação dos agentes. Por isso repetir o teste sorológico logo após o tratamento pode não refletir o resultado observado na resposta clínica e nos exames complementares, o que gera dúvidas nos tutores (proprietários). Uma nova sorologia pode ser utilizada dois a três meses após o tratamento, e comparada à primeira (sempre avaliando a diferença entre a OD e seu respectivo cut off, e não comparando a OD do primeiro teste com a OD do segundo). Se não houver mais infecção, ou se o primeiro exame refletia resposta remanescente a um contato prévio, a avaliação do nível de anticorpos não apresentará elevação significante em testes pareados. Como avaliar o resultado do tratamento em relação à leishmaniose? Importante ressaltar que nos casos de leishmaniose, o ELISA é o teste confirmatório oficial para o diagnóstico, porém, para acompanhar o tratamento, o protocolo recomendado é utilizar RIFI com diluição total (realizar um teste antes de iniciar, e outro após), pois a técnica permite acompanhamento de títulos, diferentemente da técnica ELISA que informa a densidade óptica da amostra, informando o nível da resposta de anticorpos de forma indireta. A RIFI, apesar de estar sujeita a reações cruzadas, é menos sujeita a flutuações, por isso avalia o nível de anticorpos de forma mais estável. Contudo, o tratamento não tem um efeito tão importante no título de anticorpos antileishmania, pois títulos séricos não apresentam redução imediata (por isso pode não ser útil reavaliar os títulos antes de 60 dias após o tratamento). Mas o aumento dos títulos de anticorpos na RIFI quantitativa (diluição total), sugere normalmente doença clínica, recidiva e/ou reinfecção, e pode ser utilizado em um segundo momento. Pode-se utilizar as proteínas totais e frações como exame complementar? Altos níveis de globulinas (na eletroforese nota-se hipergamaglobulinemia, geralmente de natureza monoclonal) são observados em casos de leishmaniose. Vários trabalhos demonstram que durante o tratamento, a relação albumina/globulina (A/G) e os valores do proteinograma, retornam aos valores de normalidade, devido à diminuição das proteínas séricas totais e fração gamaglobulina, e o aumento da albumina sérica. No entanto, devido a este efeito ser gradual e dependente da resposta individual de cada paciente, não pode ser utilizado como único parâmetro indicativo da eficácia, nem é uma ferramenta válida para a determinação da interrupção terapêutica. Pode ser usado a cada quatro meses para acompanhar e avaliar possíveis recidivas e/ou reinfecções. A resposta subjetiva e individual ao tratamento deve ser avaliada com base no exame clínico (melhora das manifestações clínicas), exames hematológicos e bioquímicos (reestabelecimento dos valores de normalidade); redução drástica do número de formas parasitárias ou ausência (punção de linfonodo, medula óssea e imunoistoquímica de pele).
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