Eletroforese de DNA Gabriel M. Matos Nicolas Conceição
Eletroforese Usada para separar, identificar e purificar fragmentos de DNA; Bastante sensível, capaz de detectar até 20 pg de DNA; Permite a recuperação dos fragmentos após a separação.
Eletroforese em gel de agarose
Eletroforese em gel de agarose Etapas da eletroforese 1) Preparo do Gel Agarose ou Poliacrilamida 2) Migração 3) Visualização dos fragmentos
Tipos de géis A escolha da matriz de separação usada depende principalmente do tamanho dos fragmentos analisados. Agarose: Separa fragmentos de tamanhos muito distantes (100 3.000 pb) Poliacrilamida: Maior resolução. Separa fragmentos com até 1 pb de diferença.
Tipos de géis Agarose: polímero linear composto por resíduos de galactose unidos por ligações glicosídicas.
Tipos de géis Algas rodophytas utilizadas na extração do ágar A porcentagem utilizada é medida em peso/volume
Tipos de géis A agarose não é solúvel em temperatura ambiente e precisa ser aquecida e resfriada para formação do gel (Gelificação) 32-45 C 80-95 C
Tipos de géis Concentração do gel (w/v %) Faixa de separação de DNA (kb) 0.3 5 60 0.6 1 20 0.7 0.8 10 0.9 0.5 7 1.2 0.4 6 1.5 0.2 3 2.0 0.1 2 Sambrook et al., Molecular Cloning 3 ed - 2000 1% 0,3%
Tipos de géis
Tipos de tampões Solução Tampão: Manter ph estável (H+ e OH- podem influenciar na carga líquida da molécula) Maior força iônica (carrega mais corrente que a água)
Tipos de tampões Tris-Acetato e EDTA TAE Tris-Borato e EDTA -TBE Tris-Fosfato e EDTA - TPE Qual escolher??
Tipos de tampões Tris-Acetato e EDTA TAE Melhor resolução para fragmentos maiores. Tris-Borato e EDTA -TBE Tris-Fosfato e EDTA - TPE
Tipos de tampões Diferença entre gel feito com Tampão e Água
Tipos de tampões Gel-LoadingBuffer: usado para aumentar a densidade da amostra e dar cor a amostra; Azul de Bromofenol (migra mais rápido) Xileno Cianol Sacarose / Glicerol / Ficoll
Tipos de tampões
Corrida
Corrida Os ácidos nucleicos apresentam uma carga líquida negativa. Com aplicação de uma corrente elétrica eles migram em direção ao polo positivo Corrente elétrica
Corrida
Corrida
Migração Fatores que influenciam a migração em um gel de agarose: Tamanho da molécula de DNA;
Migração Fatores que influenciam a migração em um gel de agarose: Tamanho da molécula de DNA; A concentração de Agarose;
Poliacrilamida Poliacrilamida: Formado pela polimerização de monômeros de acrilamida e bis-acrilamida. Maior poder de resolução (até 1 pb)
Poliacrilamida Poliacrilamida: Formado pela polimerização de monômeros de acrilamida e bis-acrilamida. Dependente de radicais livres (PAS e TEMED)
Poliacrilamida Poliacrilamida: Formado pela polimerização de monômeros de acrilamida e bis-acrilamida.
Visualização dos fragmentos PCR Eletroforese Visualização
Visualização dos fragmentos PCR Eletroforese Visualização
Visualização dos fragmentos Colorimétrico Fluorescência
Visualização dos fragmentos Corantes Nitrato de prata Alta sensibilidade
Visualização dos fragmentos Corantes Nitrato de prata Prata DNA Alta sensibilidade Redução da prata Cor
Visualização dos fragmentos Corantes Nitrato de prata Prata DNA Alta sensibilidade Redução da prata Cor
Visualização dos fragmentos Fluorescência
Visualização dos fragmentos Intercalantes de DNA
Visualização dos fragmentos Intercalantes de DNA Moléculas que se inserem entre os pares de bases do DNA
Visualização dos fragmentos Intercalantes de DNA A T Moléculas que se inserem entre os pares de bases do DNA C G A T
Visualização dos fragmentos Intercalantes de DNA A T Moléculas que se inserem entre os pares de bases do DNA C G A T
Visualização dos fragmentos Intercalantes de DNA A T Moléculas que se inserem entre os pares de bases do DNA C G A T
Visualização dos fragmentos Intercalantes de DNA Moléculas que se inserem entre os pares de bases do DNA Fluorescência mais visível quando ligados ao DNA
Visualização dos fragmentos Intercalantes de DNA Água age como uma molécula quencher absorvendo a fluorescência. Moléculas que se inserem entre os pares de bases do DNA Fluorescência mais visível quando ligados ao DNA
Visualização dos fragmentos Intercalantes de DNA Moléculas que se inserem entre os pares de bases do DNA Fluorescência mais visível quando ligados ao DNA Como emitem fluorescência?
Visualização dos fragmentos Intercalantes de DNA Absorvem luz em um comprimento de onda e emitem em um comprimento menor (menos energia) A C T G A T
Visualização dos fragmentos Podem ser utilizados antes ou depois da eletroforese
Visualização dos fragmentos Podem ser utilizados antes ou depois da eletroforese A T C G A T A T C G A T A T C G A T A C A A C A A C T G T T G T T G A T
Visualização dos fragmentos Brometo de Etídio Intercalante muito utilizado para visualização do DNA
Visualização dos fragmentos Brometo de Etídio Intercalante muito utilizado para visualização do DNA Excitação em luz UV Emissão em luz laranja/vermelho
Visualização dos fragmentos
Visualização dos fragmentos Brometo de Etídio Intercalante muito utilizado para visualização do DNA Pico de excitação em 285 nm (luz UV) Pico de emissão em 605 nm (luz laranja/vermelho) É considerado tóxico
Visualização dos fragmentos Intercalantes alternativos Blue Green SYBR Green GelRed GelGreen
Visualização dos fragmentos Mas isso é do tamanho esperado?
Visualização dos fragmentos Mas isso é do tamanho esperado?
Interpretação de Resultados Presença ou ausência
Interpretação de Resultados Presença de fragmentos de diferentes tamanhos 500 pb 300 pb
Interpretação de Resultados Expressão diferencial de determinado gene
Interpretação de Resultados Expressão diferencial de determinado gene