IDENTIFICAÇÃO DOS COMPOSTOS FENÓLICOS E DETERMINAÇÃO DO POTENCIAL ANTIMICROBIANO, ANTIOXIDANTE E ANTIFÚNGICO DOS EXTRATOS DE FOLHAS E FLORES DE Allamanda cathartica L. Henriquy Aguiar Coelho 1 ; Luiz Henrique Carvalho Silveira 2 ; Angela Kwiatkowski 3 ; José Hilton Bernardino de Araújo 4 1.Aluno do 2º. ano do Curso Técnico Informática, Universidade Tecnológica Federal do Paraná UTFPR. Campus Campo Mourão, aguiar.hc@gmail.com 2.Aluno do 2º. ano do Curso Técnico Informática, Universidade Tecnológica Federal do Paraná UTFPR. Campus Campo Mourão, silveira.lh@gmail.com 3.Coorientadora, Universidade Tecnológica Federal do Paraná UTFPR. Campus Campo Mourão, angelak.k@gmail.com 4.Orientador, Universidade Tecnológica Federal do Paraná UTFPR. Campus Campo Mourão, jaraujo@utfpr.edu.br 1 INTRODUÇÃO Os desafios no tratamento de doenças infecciosas vêm crescendo de forma significativa, tendo em vista que bactérias resistentes a múltiplos antimicrobianos representam uma fonte de incertezas para a cura de diversas infecções, havendo a necessidade de se buscar novas substâncias com propriedades antibióticas para serem aplicadas no combate a esses microrganismos, abrindo assim caminhos para a evolução das pesquisas no desenvolvimento de novos fármacos efetivos as constantes modificações dos mecanismos de resistência microbiana. A aplicação da medicina natural tem levado a comunidade científica a investigar a potencialidade de cura de compostos naturais na utilização medicinal. Por outro lado, devido ao desconhecimento da possível existência da ação tóxica, bem como de sua indicação adequada, as plantas medicinais são muitas vezes usadas de forma incorreta, não produzindo o efeito desejado (Pereira et al., 2004). Dessa forma, conhecer as aplicações fitoterápicas e a fisiologia das espécies vegetais promove uma maior otimização do uso desses princípios ativos presentes nas plantas. Segundo Salvagnini et al. (2008) a utilização de plantas medicinais, tem recebido apoio da Organização Mundial de Saúde (OMS) por se tratar de uma prática tradicional ainda existente entre os povos de todo o mundo trazendo inúmeros benefícios para quem emprega essas técnicas curativas. São muitos os fatores que vêm colaborando para o desenvolvimento de práticas de saúde que incluam plantas medicinais, principalmente no âmbito econômico e social (Elisabetsky, 1991). O estudo da resistência bacteriana, geralmente é baseado em microrganismos de importância epidemiológica, tais como Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa e fungos leveduriformes como Aspergullis niger e Penicillium chrysogenum, responsáveis por diferentes processos etiológicos tanto em pacientes imunocompetentes quanto em pacientes imunodeprimidos (Antunes et al., 2006). Os testes de sensibilidade in vitro, para fungos, não têm sido empregados rotineiramente, contudo, eles são de grande importância para a verificação de resistência destes microrganismos. Alguns fungos podem ser inofensivos, no entanto, algumas espécies estão apresentando riscos à saúde do ser humano e também prejuízos em industrias agrícolas, pois algumas espécies liberam toxinas que interferem na qualidade de alguns alimentos como trigo, arroz, soja, ervilha, feijão, milho, etc.. É importante salientar que
muitas pesquisas sobre frutos, flores e folhas, principalmente da flora nativa, baseiam-se na determinação da atividade antioxidante e dos compostos fenólicos. Acredita-se que as propriedades relacionadas à saúde humana exercidas pelos compostos fenólicos, destacando-se os flavonóides, são baseadas principalmente na sua atividade antioxidante (Pires, 2010). As lesões causadas pelos radicais livres nas células podem ser prevenidas ou reduzidas por meio da atividade de antioxidantes, sendo estes encontrados em muitos alimentos ou plantas. Os antioxidantes podem agir diretamente na neutralização da ação dos radicais livres ou participar indiretamente de sistemas enzimáticos com essa função (MORAES & COLLA, 2006). O dano oxidativo de biomoléculas pode levar à inativação enzimática, mutação, ruptura de membrana, ao aumento na aterogenicidade de lipoproteínas plasmáticas de baixa densidade e à morte celular. Estes efeitos tóxicos do oxigênio têm sido associados ao envelhecimento e ao desenvolvimento de doenças crônicas, inflamatórias e degenerativas (CERQUEIRA et al, 2007). 2 OBJETIVOS O objetivo desse trabalho foi identificar os compostos fenólicos e determinar o potencial antimicrobiano, antioxidante e antifúngico dos extratos de folhas e flores de Allamanda cathartica L, visando futuramente sua aplicação na área farmacológica e cosmetologia. 3 MATERIAL E MÉTODOS Coleta: As folhas e flores da planta utilizada nos testes foram coletadas na Universidade Tecnológica Federal do Paraná (UTFPR), campus Campo Mourão, sendo esta espécie identificada pelo professor Dr. Marcelo Galeazzi Caxambú, responsável pelo Herbário da UTFPR, campus Campo Mourão (HCF), onde confeccionou-se uma exsicata a qual está coligada sob o número de voucher 139. Extrato (preparação e diluição dos extratos): Após a coleta, as folhas e flores foram secas em estufa com circulação de ar forçada e em seguida triturada para a extração dos princípios ativos. Foi utilizado etanol 99,5% como solvente. A proporção usada para a diluição foi de 1:3 em massa. Os testes antimicrobianos foram realizados em 5 concentrações: 0,1; 0,5; 1,0; 1,5 e 2,0% (p/v). Etanol 70% (v/v) foi usado como controle nos testes. Para os testes antifúngicos foram utilizadas 3 concentrações do extrato diluído em água: 1,0; 1,5 e 2,0% (p/v) mais o controle. O extrato utilizado para identificação dos compostos fenólicos foi centrifugado e o sobrenadante, então, foi separado para posteriormente ser analisado por cromatografia em HPLC (High Performance Liquid Cromatography). Para a determinação da atividade antioxidante foram utilizadas três concentrações (0,005 g/ml, 0,01 g/ml e 0,04 g/ml) diluídas em alcool metílico, homogenizado e centrifugado. Atividade antimicrobiana: A atividade antimicrobiana do extrato foi constatada pela técnica de difusão em disco de papel descrito pela metodologia de Kirby-Bauer como citado por Okura e Rende (2008), onde as suspensões dos microrganismos convenientemente diluídas foram inseridas às placas contendo o meio de cultura em estado sólido. Os fatores de diluição foram ajustados a turvação de acordo com a escala 0,5 de Mc Farland (10 8 UFC/mL) e em seguida as bactérias foram diluídas 1:1000 para uso no ensaio de atividade antimicrobiana obedecendo as recomendações do National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS, 1997).
Ao final os discos de papel de área equivalente a 20mm 2 receberam 20 µl das soluções do extrato resultando nas concentrações de 0,001mg.mm -2, 0,005mg.mm -2, 0,01mg.mm -2, 0,015mg.mm -2 e 0,02mg.mm -2 que posteriormente foram aplicadas às placas e incubadas a 37 ºC durante 24 horas em posição invertida. Após o período de incubação foram realizadas leituras visuais observando-se os halos de inibição de crescimento bacteriano e quantificado em milímetros com o auxílio de paquímetro. Foram realizados três ensaios independentes para cada um dos três testes. Foram preparadas soluções do antibiótico amoxicilina como controle nas mesmas concentrações do extrato das folhas e flores da planta. Testes antifúngicos: Para avaliação da atividade antifúngica do extrato liofilizado de folhas de Allamanda cathartica L. utilizou-se o método adaptado de AUER & BETTIOL (1986) e STANGARLIN et al. (1999). O extrato liofilizado foi préviamente diluido em água destilada e em seguida incorporadas ao meio de cultivo BDA (Batata-Dextrose-Ágar) nas concentrações de 1,0; 1,5 e 2,0% (p/v). Após uma hora do meio BDA contendo o extrato das folhas da planta ter sido vertidos na placa de Petri, foram inoculados esporos dos patógenos Penicillium chrysogenum e Aspergillus niger, e em seguida incubadas a temperatura ambiente no escuro durante 7 dias. Os controles continham apenas o meio BDA. Os testes foram realizados em triplicada em duas etapas diferentes para confirmação do potencial do extrato das folhas da planta. Quantificação dos compostos fenólicos individuais: A análise de cromatografia líquida de alta eficiência é utilizada para quantificar a presença de compostos fenólicos individuais. Foi utilizado um sistema Dionex Ultimate 3000 HPLC (Dionex, Idstein, Alemanha) equipado com uma bomba Ultimate 3000, coluna do compartimento de amostra Ultimate 3000, detector de fotodiodo Ultimate 3000 e software Chromeleon para qualificação e quantificação dos compostos fenólicos. Foi utilizado uma coluna de fase reversa Acclaim 120, C18 5 mm 120 A (4,6 mm x 250 mm) para a separação dos compostos fenólicos. A coluna foi mantida a 40 C durante toda a análise e a detecção realizada em três comprimentos de onda (280, 300 e 320 nm). O volume de injeção das amostras foi de 10,0 µl. A fase móvel (A) foi composta de água acidificada com ácido fosfórico 1% e metanol fase (B). A eluição dos compostos fenólicos foi realizada através de gradiente entre as duas fases móveis, onde no tempo de 45 minutos a coluna foi mantida com 100% de fase móvel B por 5 minutos. Após este período, a fase (B) foi reduzida gradualmente até as condições iniciais de injeção para o condicionamento da coluna (95% A e 5% B), trabalhando-se com uma vazão de 1,0 ml/min. Os padrões de ácido gálico, ácido clorogênico, ácido cafêico, ácido p- cumárico, ácido ferrúlico, rutina, catequina, miricetina, quercetina, kaempferol foram utilizados para a identificação e quantificação dos compostos fenólicos. Determinação da Atividade Antioxidante total em folhas de A. cathartica: A atividade antioxidante (AA) total foi avaliada utilizando o radical DPPH (1,1-difenil-2-picrilhidrazil) de acordo com o método descrito por Mensor et al. (2001) com modificações, onde o volume do meio reacional (extrato diluído em álcool metílico absoluto + solução de DPPH + álcool metílico absoluto) foi de 3,5 ml. Para cada concentração do extrato foram utilizados frascos de 10 ml contendo 2,4 ml de álcool metílico absoluto, 1 ml de solução de DPPH (2,4 mg/100 ml) e uma alíquota de 0,1 ml do extrato em sua respectiva concentração. Os testes foram feitos em duplicata. Para cada amostra, foi realizado em paralelo, para a correção de uma possível contribuição da coloração dos extratos, um teste branco consistindo do 0,1 ml do extrato e 3,4 ml de álcool metílico absoluto.
O controle foi preparado pela mistura de 1,0 ml de solução de DPPH (2,4 ml/100 ml) com 2,5 ml de álcool metílico absoluto. Após um período de 30 minutos de incubação no escuro em temperatura ambiente, as absorbâncias das amostras foram registradas contra um branco em 515 nm. A inibição do radical livre DPPH (em %) foi calculada pela seguinte equação: AA% = 100 [(Aa Ab) x 100] / Ac Onde: Aa = absorbância da amostra; Ab = absorbância do branco; Ac = absorbância do controle. 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO Atividade Antimicrobiana: O extrato das folhas e flores da A. cathartica L. demonstrou-se eficiente na inibição das três bactérias testadas. Na concentração de 0,02 mg/mm -2, o halo de inibição para a bactéria Klebsiella sp. foi de 1,04 cm paras folhas, e 0,80 cm para as flores. Para a bactéria E. coli o halo médio foi de 0,79 cm usando as flores e de 0,92 cm para as folhas, na mesma concentração. Quando utilizou-se a bactéria S. aureus o halo foi de 0,90 cm, para o extrato das flores e 0,99cm para o extrato das folhas, na concentração de 0,02mg.mm -2. Após analisados os efeitos inibitórios do extrato, foram realizados ensaios para fins comparativos com o medicamento comercialmente produzido amoxicilina, sendo esta droga a responsável pelo combate ao S. aureus, E.coli e Klebsiella sp. Nos testes, a bactéria E. coli apresentou maior sensibilidade ao medicamento, apresentando halos de inibição de 3,4 cm, para o S. aureus a média dos diâmetros de inibição foi de 2,65 cm, e para a Klebsiella sp a média dos halos de inibição foi de 2,4 cm, todos para a concentração de 0,02 mg.mm -2 Testes de inibição antifúngica: Após incubação de 7 dias as placas de Petri foram retiradas para análise dos resultados. Como observado nas figuras 8 e 9 o extrato bruto das folhas de Allamanda cathartica L. nas 3 concentrações diferentes demonstrou-se eficiente, inibindo totalmente o crescimento dos fungos Aspergillus niger e Penicilium chrysogenum. Identificação dos compostos fenólicos: Após a análise cromatográfica pela técnica de HPLC, foram identificados diversos compostos fenólicos nos extratos das folhas e flores da Allamanda cathartica L. Os identificados pelos padrões disponíveis foram o ácido clorogênico, ácido cafeico, ácido p-cumárico e o ácido ferrúlico. A concentração desses compostos pode ser vista na Tabela 1 para as folhas, e na Tabela 2 para as flores de Allamanda cathartica L.. Mesmo tendo identificado apenas 3 compostos para as folhas, podemos observar que ela possui maior concentração de ácido clorogênico, que é um importantíssimo fenol, responsável, principalmente, pelos radicais livres e células cancerígenas. Tabela 1 Conc. dos compostos presente no extrato das folhas de Allamanda cathartica L. Tabela 2 Conc. dos compostos presente no extrato das flores de Allamanda cathartica L. Determinação da atividade antioxidante: O extrato de folhas e flores de A. cathartica apresentaram um potencial altíssimo de atividade antioxidantesendo semelhante aos valores
encontrados por Goes et al (2010) que obteve esses valores para uma concentração de 10% de extrato. No entanto, pelos resultados encontrados, percebemos que o extrato das folhas apresenta maior atividade oxidante, sendo 89% para as folhas, tabela 1, contra 87% para as flores. Tabela 3 - Atividade antioxidante dos compostos fenólicos para o extrato das folhas de A. cathartica L. Tabela 4 - Atividade antioxidante dos compostos fenólicos para o extrato das flores de A. cathartica L Concentração g/ml Atividade antioxidante (%) 0,005 82,56 0,01 87,79 0,04 97,18 Média 89,17 Concentração g/ml Atividade antioxidante (%) 0,005 82,93 0,01 87,67 0,04 90,99 Média 87,19 5 CONCLUSÃO Este trabalho comprovou a atividade antimicrobiana in vitro do extrato de Allamanda cathartica L. frente aos microrganismos Staphyloccocus aureus, Escherichia coli e Klebsiella sp. Além disso, em comparação com a atividade antimicrobiana do antibiótico amoxicilina, o extrato da planta demonstrou-se eficiente. No entanto, o uso do extrato dessa planta pode apresentar toxicidade, por isso, a concentração a ser utilizada deve ser controlada para evitar efeitos colaterais indesejáveis. Comprovou-se também que o extrato da planta é eficiente na inibição de duas variedades de fungos, Aspergilus niger e Penicilium chrysogenum, comprovando seu potencial antifúngico. Neste trabalho podemos concluir que A. cathartica L. inibiu o crescimento de diversas bactérias, mesmo assim, outras pesquisas devem ser realizadas para confirmar a ação da planta no combate a outros tipos de microrganismos, e que um número maior e mais representativo de variedades, isolado de diversos pacientes e ambientes, devem ser testado em futuros trabalhos. Também confirmou-se o seu potencial antioxidante, efetivo tanto para as folhas quanto para as flores que auxiliam na neutralização dos radicais livres, prejudiciais à saúde humana. Além disso, foi verificado por meio de cromatografia HPLC que esses extratos apresentam grande variedade de compostos fenólicos. Entre os compostos identificados, os principais foram o acido clorogênico, o ácido cafeico, ácido p-cumárico e o ácido ferrúlico, que são muito importantes no metabolismo e servem como agentes protetores de reações oxidativas indesejáveis no organismo, protegendo contra efeitos maléficos do ambiente e de radicais livres. Com esse trabalho podemos comprovar que a Allamanda cathartica L. apresenta um potencial fitocomplexante e que pode ser muito útil na elaboração de novos compostos para a indústria farmacêutica, e cosmética, onde seus extratos tanto das folhas como das flores, podem ser incorporados para a formulação desses novos produtos cosméticos, como xampus, condicionadores, hidratantes, protetores solar, entre outros. 6 REFERÊNCIAS ANTUNES, R. M. P.; LIMA, E. O.; PEREIRA, M. S. V.; CAMARA, C. A.; ARRUDA, T. A.; CATÃO, R. M. R.; BARBOSA, T. P.; NUNES, X. P.; DIAS, C. S.; SILVA, T. M. S. Atividade antimicrobiana in vitro e determinação da concentração inibitória mínima (CIM) de
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