Bases da análise genômica: estado da arte Cesar Martins cmartins@ibb.unesp.br Departamento de Morfologia Instituto de Biociências UNESP Universidade Estadual Paulista Botucatu, SP Avanços nas tecnologias para estudar genes e genomas - Enzimas de restrição e tecnologia do DNA recombinante; - Sequenciamento nucleotídico; - PCR Reação em Cadeia da Polimerase; - Sequenciamento em larga escala; - Bioinformática. 1
Conhecendo os genomas... # Mapeamento físico do genoma # Mapeamento genético (mapa de ligação) Conhecendo os genomas... # Mapeamento genético (mapa de ligação) # Mapeamento físico cromossômico # Mapeamento físico por restrição enzimática # Mapeamento físico de seqüência nucleotídica 2
Avanços no conhecimento dos genomas - Restrição enzimática - Construção de bibliotecas genômicas - PCR Reação em Cadeia da Polimerase Potencial das enzimas de restrição na manipulação do material genético 3
Potencial das enzimas de restrição na manipulação do material genético Arber, Smith e Nathans Prêmio Nobel em Fisiologia e Medicina em 1978 Enzimas de Restrição Sítio de clivagem Fragmentos gerados Finais retos Finais coesivos 4
Produção de moléculas recombinantes Complementariedade entre os finais gerados pela enzima de restrição e produção de moléculas recombinantes Propagação de moléculas de DNA DNA exógeno DNA recombinante Bactéria P - nucleóide plasmídeo Bactéria P + Bactéria P + 5
Construção de bibliotecas genômicas Vetores de clonagem para propagação de DNA de interesse BAC limite de clonagem 100-300 kb Plasmídeo Fago Cosmídio limite de clonagem 100-10.000 pb limite de clonagem Até 20 kb limite de clonagem 35-50 kb YAC limite de clonagem 100-1000 kb O que é um BAC? Vetor de clonagem para propagação de um DNA de interesse Bacterial Artificial Chromosome Construção recombinante baseada no plasmídeo F de E. coli 6
BAC Bacterial Artificial Chromosome Vantagens: 100-300 kb maior estabilidade menor quimerismo cópia única Construção de bibliotecas em BACs e sua utilização como sondas cromossômicas Genomic DNA Large fragments used to construct BAC lybraries BAC clone Análise 7
Construção de bibliotecas em BACs BACs como vetores de clonagem Cm(R) orif promoter S E pbace3.6 11.5 kb E SacBII SacB+: SacBII codifica levansucrase, que converte sucrose em levan, um composto tóximo para a bacteria. Abrir com enzima de restrição Ligar com fragmento de DNA genomico promoter S grande fragmento, 300kb SacBII Cm(R) orif SacB-: Não há a pordução de levan: seleção positiva de recombinantes. 8
BACs como vetores de clonagem Vetor BAC utilizado para construção de bibliotecas de O. niloticus (Tilápia do Nilo) Construção de bibliotecas em BACs DNA genômico de alta qualidade purificado Células espermáticas Digestão parcial do DNA genômico com HindIII 1 E. Coli DH10B Purificação dos fragmentos digeridos PFGE para separar fragmentos digeridos Clivagem com HindIII e defosforilação pbac-lac - Ligação (1:10, excesso de BAC) pbac-lac+ Clones recombinantes 9
Construção de bibliotecas em BACs pbac-lac - pbac-lac+ Eletroporação E. Coli DH10B Número de colônias a serem estocadas? Seleção de recombinantes 3a Estocagem das colônias em placas 384 wells Construção de bibliotecas em BACs Número de colônias a serem estocadas???? Depende do tamanho médio dos fragmentos de DNA inseridos nos BACs Tamanho do genoma: O. Niloticus genoma de 1.000.000.000 nt Número de clones para cobrir totalmente o genoma da espécie BACs com insertos médios de 200 kb: 5.000 clones 1x genoma Biblioteca de O. niloticus: 30.000 BAC-clones Cobertura de 6x o genoma 10
Construção de bibliotecas em BACs Número de colônias a serem estocadas???? Biblioteca de O. niloticus: 30.000 BAC-clones Cobertura de 6x o genoma Placas de 384 wells 78 placas de 384 wells Coleta dos clones das placas originais e estocagem em placas 384 wells Robotizado!! Construção de bibliotecas em BACs Katagiri et al. 2001, Animal Genetics 32: 200-204 Análises em PFGE após digestão com NotI de BACs representativos das bibliotecas construídas 11
Construção de bibliotecas em BACs Plotagem dos clones em membrana de nylon (robô) Hibridação para busca de genes de interesse Construção de bibliotecas em BACs Checagem Crescimento do clone de interesse Purificação dos BACs Análise do BAC identificado 12
Bibliotecas em BACs Aplicações... Bibliotecas em BACs Construção... Conhecendo os genomas... # Mapeamento genético (mapa de ligação) # Mapeamento físico cromossômico # Mapeamento físico por restrição enzimática # Mapeamento físico de seqüência nucleotídica 13
Conhecendo os genomas... # Mapeamento genético (mapa de ligação) # Mapeamento físico cromossômico # Mapeamento físico por restrição enzimática # Mapeamento físico de seqüência nucleotídica Mapa genético de ligação Thomas H. Morgan: (1911) propôs a hipótese de que os fatores hereditários (genes) estariam localizados em lugares definidos nos cromossomos e dispostos em uma ordem linear. 14
Mapa genético de ligação: -frequência de recombinação entre características 1% de recombinação entre dois genes ligados = 1 unidade de mapa 1 unidade de mapa = 1 centimorgan (cm) Mapa genético de ligação 1% de recombinação entre dois genes ligados = 1 unidade de mapa 1 unidade de mapa = 1centiMorgan (cm) 15
Mapa genético de ligação (clássico) Exemplo de mapa de ligação: 4 cromossomos de Drosophila foram mapeados extensivamente pelo estudo genético de recombinantes Mapa genético de ligação (marcadores moleculares) Lee et al. 2005, Genetics 170: 237 244 16
Conhecendo os genomas... # Mapeamento genético (mapa de ligação) # Mapeamento físico cromossômico # Mapeamento físico por restrição enzimática # Mapeamento físico de seqüência nucleotídica Mapa físico cromossômico Homo sapiens 2n=46 Myrmecia pilosula, 2n=2 Ophioglossum reticulatum Pteridófita (Samambaia), 2n=1260 17
Mapa físico cromossômico Chromosomos metafásicos humanos Genoma Termo cunhado em 1920 por Hans Winkler: conjugação de gene e cromossomo Winkler escreveu (em tradução grosseira): I propose the expression Genome for the haploid chromosome set, which, together with the pertinent protoplasm, specifies the material foundations of the species... Mapa físico cromossômico 18
Mapa físico cromossômico -hibridação in situ fluorescente; -genes/fragmentos de DNA como sondas cromossômicas; -cromossomos inteiros ou segmentos; Muntiacus muntjak (Cervídeo) Mapa físico cromossômico Humano 19
Conhecendo os genomas... # Mapeamento genético (mapa de ligação) # Mapeamento físico cromossômico # Mapeamento físico por restrição enzimática # Mapeamento físico de seqüência nucleotídica Mapeamento físico por restrição enzimática 20
Mapeamento físico por restrição enzimática Mapeamento físico por restrição enzimática de bibliotecas genômicas DNA genômico Fragmentaçã por restrição enzimática Fragmentos utilizados para construir bibliotecas em BACs (Bacteria Artificial Chromosomes) Clivagem dos BACs e verificação dos perfis gerados 21
Mapeamento físico por restrição enzimática de bibliotecas genômicas Fragmentação do BAC por restrição enzimática Mapeamento físico por restrição enzimática de bibliotecas genômicas 22
Mapeamento físico por restrição enzimática de bibliotecas genômicas Mapa físico de bibliotecas genômicas 23
Mapeamento físico por restrição enzimática de bibliotecas genômicas Organização dos BACs em contigs Contig 1 Contig 2 Mapeamento físico por restrição enzimática de bibliotecas genômicas BACs Contigs *BAC-end sequencing Segmento cromossômico Genome (chromosome) scaffold 24
Mapeamento físico por restrição enzimática de bibliotecas genômicas Identificação de sequencias repetitivas no genoma # Mapeamento genético (mapa de ligação) # Mapeamento físico cromossômico # Mapeamento físico por restrição enzimática # Mapeamento físico de seqüência nucleotídica 25
Mapa físico de seqüência nucleotídica Sanger et al. 1977, Nature 265: 687-695 Mapa físico de seqüência nucleotídica Montagem das sequências 26
A evolução no sequenciamento de DNA Mapa físico de seqüência nucleotídica http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/genbankstats-2008/ 27