ESTUDO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DO EXTRATO DE FOLHAS DE LOURO (LAURUS NOBILIS L) EM BACTÉRIAS CAUSADORAS DE TOXINFECÇÃO ALIMENTAR Santos, D. D. M. dos 1 ; Coelho, A. F. S. 2 1 Aluna do Curso de Engenharia de Alimentos; Campus de Palmas; e-mail: drielly.dayanne@gmail.com, PIBIC/CNPq 2 Professora Ajunta do Curso de Engenharia de Alimentos; Campus de Palmas; e-mail: anaflavia@mail.uft.edu.br RESUMO Laurus nobilis L. é uma árvore de folhas odoríferas onde são encontrados alguns componentes de óleo essencial. Este trabalho objetivou estudar a atividade antimicrobiana em cepas de micro-organismos causadores de toxinfecção alimentar. Obteve-se o óleo por meio do método de Destilação por Arraste a Vapor e foram testadas dezoito concentrações de óleo essencial diluída em água destilada esterilizada: 100%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20% e 15%, sendo a 100% isenta de água destilada esterilizada. Os sorotipos de Salmonella Typhi, Salmonella Typhimurium e Salmonella Enteritidis e as cepas de Staphylococcus aureus, Bacillus cereus e Listeria monocytogenes foram inoculadas em placa de Petri, obtendo colônias isoladas. Para cada microrganismo foram selecionadas três colônias isoladas e transferidas para um tubo contendo 4 ml de água peptonada a 35ºC por 24h até alcançar a turbidez de uma solução padrão de McFarland 0,5. Com um Swab, foram inoculados fazendo estrias por toda a placa contendo Ágar Mueller-Hinton. Com o fundo de ponteiras esterilizadas foi feito um poço no meio inoculado e preenchido com 20μL do óleo essencial extraído na concentração testada, outro com 20μL de água destilada estéril, no controle negativo. Cada concentração foi testada utilizando 3 placas de Petri para cada micro-organismo. As placas foram levadas para a estufa a 35ºC por 24h. Foi observada a formação de halos de inibição e medidos com um paquímetro. As cepas foram sensíveis ao óleo essencial de folha de louro, com exceção do Bacillus cereus. Palavras-chave: atividade antimicrobiana; óleo essencial; halo de inibição, micro-organismos patogênicos.
INTRODUÇÃO De acordo com a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), condimentos ou temperos são produtos constituídos de uma ou diversas substâncias sápidas, de origem natural, com ou sem valor nutritivo, empregado nos alimentos com o fim de modificar ou exaltar o seu sabor. Os condimentos são designados de acordo com a sua natureza com nomes de fantasia ou nomes tradicionais. O condimento vegetal, de acordo com a sua composição, pode ser simples, quando constituído por uma especiaria genuína e pura, e misto quando constituído da mistura de especiarias (Resolução - CNNPA nº 12, de 1978). A folha de louro (Laurus Nobilis L), denominada comumente de louro ou loureiro, é uma árvore de tronco liso, com muitos ramos e folhas, inflorescências amarelas e frutos globosos escuros, originário da Ásia Menor. Estudos fitoquímicos identificaram componentes do óleo essencial, como eugenol, linalol, sabineno, limoneno, pineno, cineol, geraniol e canfeno (SKIDMORE-ROTH, 2004). Em concentrações relativamente menores, foram detectados taninos, mucilagem, lactonas sesquiterpênicas e alcalóides, como reticulina (CHIEJ, 1983; SKIDMORE-ROTH, 2004; MARINO et al., 2005). O objetivo deste trabalho foi estudar a atividade antimicrobiana em cepas de microorganismos causadores de toxinfecção alimentar determinando sua concentração inibitória mínima. MATERIAL E MÉTODOS As amostras de folhas de louro (Laurus nobilis L) foram coletadas em supermercados na cidade de Palmas-TO. A extração do óleo essencial foi realizado no Laboratório de Frutas e Hortaliças da UFT e levado ao Laboratório de Microbiologia de Alimentos da UFT para a realização dos teste para atividade antimicrobiana. Obtenção do extrato vegetal e da solução antimicrobiana O óleo essencial foi obtido pelo método de Destilação por Arraste a Vapor utilizando o equipamento Clevenger, durando aproximadamente 4 horas. No protocolo estabelecido para extração do óleo essencial da folha de louro para cada 250 g da material picado, colocado em balão volumétrico, foram adicionados 500 ml de água destilada. O aparelho foi ligado na temperatura máxima até a água atingir seu ponto de ebulição, sendo a partir deste ponto a temperatura reduzida à metade. Ao mesmo tempo a vazão da água de refrigeração percorreu o condensador na temperatura ambiente (água de torneira) por 15 minutos resultando em aproximadamente 0,25 ml de óleo essencial
por sessão. O processo foi repetido por 4 vezes até a obtenção de 1 ml de óleo. Foram testadas dezoito concentrações de óleo essencial diluída em água destilada esterilizada: 100%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20% e 15%. A concentração de 100% foi isenta de água destilada esterilizada. Cultura microbiana e preparo do inoculo Os sorotipos de Salmonella Typhi, Salmonella Typhimurium e Salmonella Enteritidis e as cepas de Staphylococcus aureus, Bacillus cereus e Listeria monocytogenes foram inoculadas em placa de Petri contendo Ágar Nutriente, fazendo-se três estrias, com o objetivo de se obter colônias isoladas. Para cada micro-organismo, foram selecionadas três colônias isoladas com uma alça, sendo os microorganismos transferidos para um tubo contendo 4mL de água peptonada para cada cepa. O caldo foi incubado a 35ºC durante 4 horas e meia até alcançar uma turbidez de uma solução padrão de McFarland 0,5 (CEFAR, s/d). Esta solução foi usada para padronizar a densidade do inóculo para o teste. Avaliação da atividade antimicrobiana in vitro Método de difusão em poços A avaliação da atividade antimicrobiana foi realizada utilizando o método de Dorman e Deans (2000) modificado. A cultura bacteriana dos micro-organismos foi desenvolvida em água peptonada a 35 C até atingir a diluição de 10 8 UFC/mL (aproximadamente 4 horas e meia), em seguida com o auxílio de um Swab, foram inoculados fazendo estrias nos sentidos horizontal e vertical nas placas contendo Ágar Mueller-Hinton. Com o fundo de ponteiras esterilizadas foi feito um poço no meio de cultura e preenchido com 20μL do óleo essencial, outro poço no mesmo meio foi feito e preenchido com 20μL de água destilada estéril, consistindo no controle negativo. O controle positivo foi realizado apenas no início da pesquisa, em que foi testado o antibiótico cloranfenicol. Cada concentração foi testada utilizando 3 placas de Petri para cada cepa. As placas foram levadas para a estufa a 35ºC por 24 horas. Foi observada a formação de halos de inibição e medidos com um paquímetro. RESULTADOS E DISCUSSÃO As culturas de Salmonella Typhi, Salmonella Typhimurium, Salmonella Enteritidis, Staphylococcus aureus e Listeria monocytogenes apresentaram halos decrescentes de inibição do crescimento bacteriano de acordo com a redução da concentração do óleo essencial, por meio da técnica de difusão em poços.
A Tabela 1 mostra os resultados obtidos do halo de inibição nas diferentes concentrações testadas após a aplicação do teste de Tukey (5% de significância) utilizando o programa Sisvar. De acordo com os ensaios realizados, as cepas foram sensíveis ao óleo essencial de folha de louro, com exceção do Bacillus cereus. Sofia et al. (2007) relataram forte atividade antimicrobiana quando utilizaram de extratos de cravo e canela em cepa de B. cereus. As bactérias Gram negativas Salmonella Typhi e Salmonella Typhimurium apresentaram halos de inibição até a concentração de 45% (CIM) e a Salmonella Enteritidis até 20% (CIM). As bactérias Gram positivas Staphylococcus aureus e Listeria monocytogenes apresentaram halos de inibição até a concentração de 35% (CIM) e 60% (CIM) respectivamente, sendo que o óleo essencial de folha de louro não inibiu a multiplicação de Bacillus cereus. Jeljaszewicz e Mlynarczyk (2000) mencionam que as bactérias Gram positivas são mais sensíveis à ação dos antibióticos do que bacilos Gram negativos, devido à falta de membrana externa, o que facilita a atuação da droga. O resultado obtido para a cepa de S. aureus no presente trabalho confirma esta afirmação. Entretanto, bactérias Gram positivas têm maior facilidade de adquirir uma resistência intrínseca às drogas que são utilizadas rotineiramente. A resistência bacteriana aos antibióticos comerciais é um fato emergente que atinge diretamente a saúde pública e o estudo de novos princípios ativos a base de produtos naturais tem sido estimulada nos últimos anos.
A suspeita sobre a toxidade de alguns aditivos químicos em produtos e o abuso na utilização destes compostos têm demandado medidas legislativas cada vez mais eficazes no panorama mundial (MOREIRA et al., 2005). No entanto há um crescente interesse em pesquisas pela busca de compostos alternativos para um emprego racional como conservantes de alimentos (IVANOVIC et al., 2012). LITERATURA CITADA ANVISA. Resolução - CNNPA nº 12, de 1978. Disponível em: < http://www.anvisa.gov.br/anvisalegis/resol/12_78_condimentos.htm> Acesso em: 12 de abril de 2012. CEFAR. Cefar Diagnóstica Ltda. Pesquisa e Desenvolvimento de Produtos para Diagnósticos. Antibiograma passo a passo. Teste de sensibilidade por disco difusão (Metodologia de Kirby-Bauer). 3p. s/d. CHIEJ, R. Guia de plantas medicinales. 3. ed. Barcelona: Grijalbo, 1983. p. 170. DORMAN, H.J.D.; DEANS, S.G. Antimicrobial agents from plants: antibacterial activity of plant volatile oils. Journal of Applied Microbiologia, v.88, p.308-316, 2000. IVANOVIC, J.; MISIC, D.; ZIZOVIC, I.; RISTIC, M. In vitro control of multiplication of some foodassociated bacteria thyme, rosemary and sage isolates. Food Control, v. 25, p. 110 116. JELJASZEWICZ, J.; MLYNARCZYK, G.; MLYNARCZYK, A. Antibiotic resistance in Grampositive cocci. International Journal of Antimicrobial Agents, n. 16, p. 473-478, 2000. MARINO,S.; BORBONE, N.; ZOLLO, F.; IANARO, A.; DI MEGLIO, P.; IORIZZI, M. New sesquiterpene lactones from Laurus nobilis leaves as inhibitors of nitric oxide production. Planta Med., Stuttgart, v. 71, n. 8, p. 706-10, 2005. MOREIRA, M. R.; PONCE, A. G.; VALLE, C. E.; ROURA, S. I. Inhibitory parameters of essential oils to reduce a foodborne pathogen. Food Science Technology, v. 38, p. 565 570. 2005. SKIDMORE-ROTH, L. Handbook of herbs and natural supplements. 2 nd ed. St. Louis: Mosby, 2004. p. 78-81. SOFIA, P. K.; PRASAD, R.; VIJAY, V. K.; SRIVASTAVA, A. K. Evaluation of antibacterial activity of Indian spices against common foodborne pathogens. International Journal of Food Science and Technology, v. 42, p. 910 915, 2007. O presente trabalho foi realizado com o apoio do Conselho Nacional de Desenvolvimento Cinetífico e Tecnológico CNPq Brasil.