ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DO ÓLEO ESSENCIAL DE FRUTOS DA PLANTA Illicium verum HOOK

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1 ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DO ÓLEO ESSENCIAL DE FRUTOS DA PLANTA Illicium verum HOOK I.I. Santi 1 ; R.A. Freitag 1 ; M.R.G. Machado 2 ; F.N.Victoria 2 ; C.P. Bastos 2 ; R.S. Rodrigues 2 1- Laboratório de Pesquisa de Produtos Naturais. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica e Bioprospecção. Universidade Federal de Pelotas, CEP , Telefone: (53) (ivandra.santi@yahoo.com.br), Pelotas RS, Brasil. 2 Laboratório de Microbiologia - Centro de Ciências Químicas, Farmacêuticas e de Alimentos. Universidade Federal de Pelotas, CEP , Telefone: 55(53) miriangalvao@gmail.com Pelotas RS, Brasil. Resumo - Óleos essenciais (OE) estão presentes nas plantas como produto natural e apresentam compostos aromáticos voláteis originados do metabolismo secundário. O Anis estrelado é um OE incolor, fonte de sesquiterpenos, lignanas e flavonóides, e tem como composto majoritário o trans-anetol (70-94%). O objetivo do trabalho foi estudar a atividade antimicrobiana frente a bactérias Grampositivas e negativas do OE de Anis estrelado (Illicium verum Hook). A atividade antimicrobiana foi feita pelo método de microdiluição em caldo e determinação da concentração inibitória mínima (CIM) e Concentração bactericida mínima (CBM). O resultado demonstrou que o OE de Anis estrelado inibiu todas as cepas bacterianas nas concentrações de 1mg - 0,25mg/mL com atividade antimicrobiana promissora frente a bactérias Gram positivas e Gram negativas. Contudo, estudos adicionais são necessários para determinar o mecanismo de ação e a citotoxicidade do óleo essencial. Abstract Essential oils (EO) are present in plants as a natural product and have originated volatile aromatic compounds of secondary metabolism. The star anise is a colorless OE source of sesquiterpenes, lignans and flavonoids, and its major compound is trans-anethole (70-94%). The objective was to study the antimicrobial activity against Gram-positive and negative bacterias of star anise OE (Illicium verum Hook ). The antimicrobial activity was made by the microdilution broth method and determination of minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC). The result showed that the Star anise EO inhibited all bacterial strains at concentrations of 1 mg mg / ml with promising antimicrobial activity against Gram positive and Gram negative bacteria. However, further studies are needed to determine the mechanism of action and cytotoxicity of EO. Palavras-chaves: Anis estrelado, antimicrobianos naturais, anetol. Keywords : star anisium, antibacterial, anetole. 1 INTRODUÇÃO Óleos essenciais (OE) são produtos obtidos a partir de partes de plantas através de destilação por arraste a vapor d água. De forma geral, são misturas complexas de substâncias voláteis, lipofílicas, normalmente odoríferas e líquidas. Em virtude disso, os óleos essenciais apresentam propriedades biológicas cujos efeitos podem ser o resultado do sinergismo de todas essas moléculas presentes em concentrações mais elevadas (Perini, 2013; Santurio, 2011). A ação inibitória de especiarias e de seus óleos em diferentes micro-organismos tem sido relatada em diversos estudos, comprovando que estes compostos possuem atividade antibacteriana

2 contra um grande número de bactérias incluindo espécies resistentes a antibióticos e antifúngicos, podendo apresentar ação tanto contra bactérias Gram-positivas como Gram-negativas, além de leveduras e fungos filamentosos (Trajano, et al., 2009; Bertini, et al., 2005). A planta Illicium verum Hook pertence à família Illiciaceae e seu fruto é conhecido popularmente como Anis estrelado. Nos países da Ásia, principalmente na China, tem seu uso reconhecido na medicina tradicional, sendo também utilizado como condimento e em perfumaria. O óleo essencial do Anis é uma rica fonte de sesquiterpenos, lignanas e flavonóides, apresenta-se incolor e destacam-se os compostos químicos estragol, limoneno, cis-anethole, pineno, β-felandreno, α- terpineol, sendo majoritário o trans-anetol (70-94%). O Anis também possui o ácido chiquímico, um composto essencial para a produção da droga antiviral Tamiflu (fosfato de oseltamivir) (Lima, 2008; Farmacopeia 2010). Na farmacologia, o óleo essencial do Anis é reconhecido devido às suas propriedades antifúngicas, antimicrobianas, carminativas, antispasmódicas, expectorantes, estimulantes e antioxidantes e, além destas possui atividade inseticida e repelente (Padmashree, et al., 2007; Freire, 2008; Lima, et al., 2008). O composto principal anetol, isolado do óleo de anis, possui atividade antibacteriana, antifúngica e antisséptica (De, et al., 2002) bem como os extratos da planta I. verum Hook que apresentaram atividade antibacteriana frente a bactérias clínicas isoladas (Yang, et al., 2010). Devido aos relatos de diversas atividade biológicas e com a perspectiva de encontrar novos compostos com atividade antimicrobiana de interesse para indústria alimentícia e farmacêutica, buscase nas plantas novos compostos com essa atividade. Nesse contexto, o objetivo do presente estudo foi determinar a atividade antimicrobiana do óleo essencial da planta Illicium verum Hook frente a cepas bacterianas Gram positivas e negativas. 2. MATERIAL E MÉTODOS 2.1 Material Vegetal Os frutos maduros de Illicium verum Hook utilizados, foram adquiridos da empresa Polico Alimentos com especificação do produto e número de lote 65/ Extração do Óleo Essencial O óleo essencial foi extraído pelo método de hidrodestilação onde pesou-se 100g da semente, previamente triturada em moinho de bolas com nitrogênio líquido, colocou-se em balão juntamente com 1500mL de água destilada, e este foi acoplado ao aparelho Clevenger por um período de 4 horas à uma temperatura de 100ºC. A extração foi realizada conforme descrito na Farmacopeia Brasileira (2010). 2.3 Micro-organismos A atividade antimicrobiana do óleo essencial foi testada com quatro cepas padrão: Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Listeria monocytogenes ATCC 7644 e Salmonela typhimurium ATCC Em um tubo de ensaio contendo solução salina 0,85% preparam-se suspensões das cepas testes, as quais foram padronizadas de acordo com 0,5 da escala Mac Farland, correspondendo à concentração de aproximadamente 1,5x10 8 Unidades Formadoras de Colônia (UFC.mL -1 ). A padronização da densidade ótica dos inóculos foi realizada em espectrofotômetro num comprimento de onda λ= 625nm em uma Absorbância entre 0,08 0,10.

3 2.4 Ensaios da Atividade Antimicrobiana O método utilizado para a determinação da atividade antimicrobiana foi o método de concentração mínima inibitória (MIC), todos os testes foram realizados em triplicatas. O MIC do óleo essencial contra micro-organismos de ensaio foi determinado pelo método de microdiluição em caldo (NCCLS, 2003) com modificações. No controle de inibição no método de microdiluição em caldo, utilizou-se o Dimetilsulfóxido (DMSO). 2.5 Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) O ensaio de susceptibilidade em caldo, foi realizada utilizando o método NCLLS (2003) para a determinação da CIM. Todos os testes foram realizados em Caldo Soja Tripticaseína (TSB). O óleo essencial foi diluído em DMSO tendo como concentração inicial 1mg/mL. Preparou-se uma suspensão com uma concentração de 5x10 5 UFC/mL. Em um volume total de 100µL da suspensão de microorganismos padronizados, após foram inoculadas em cada poço, e a seguir, adicionou-se 100µL da solução do óleo essencial. As placas de microdiluição foram incubadas a 37ºC durante um período de 24h. A CIM foi calculada como a diluição mais elevada que mostrou a inibição completa da cepa padrão utilizada. 2.6 Determinação da Concentração Bactericida Mínima (CBM) A partir dos resultados do CIM, as cavidades que mostraram ausência completa do crescimento em cada poço foram identificadas, e destes foram transferidos 7µL para placas de petri descartáveis contendo Agar Mueller Hinton, sendo após incubadas a 37ºC por 24h. A completa ausência de crescimento foi considerada como a concentração bactericida mínima (CBM). 3 RESULTADOS E DISCUSSÃO Os resultados do método de microdiluição em caldo do óleo essencial do Anis estrelado estão dispostos na Tabela 1. Tabela 1- Resultado do teste de microdiluição em caldo, em diferentes concentrações, do óleo essencial de Anis estrelado frente a bactérias patogênicas Gram positivas e Gram negativas. Salmonela thypimurium Staphylococcus aureus Escherichia coli Listeria monocytogenes Concentrações (mg/ml) CIM CBM CIM CBM CIM CBM CIM CBM Óleo essencial 0, , Inibição de crescimento: (-); Crescimento Bacteriano: (+); CIM:Concentração Inibitória Mínima; CBM: Concentração Bactericida Mínima Com base no CIM, pode-se observar que o óleo inibiu todas as cepas bacterianas nas concentrações de 1mg/ml à 0,25mg/ml. Na CBM, a concentração de 1mg/ml apresentou a atividade bactericida, exceto para Escherichia coli e nas demais concentrações testadas a atividade do óleo essencial foi bacteriostática. Esse resultado pode ser atribuído ao seu composto majoritário anetol (Cu,

4 et al., 1990; Li e Liu, 2000; Freire et al., 2011) onde estudos realizados por DE et al. (2002), indicaram a atividade contra bactérias, leveduras e estirpes de fungo, atribuídos ao composto anetol. Freire et al. (2011) avaliando o óleo essencial do fruto de Anis estrelado, pelo método de difusão, não observou efeito inibitório frente a bactéria S. aureus apenas para E.coli, enquanto que na concentração mínima inibitória, o óleo essencial, inibiu nas concentrações de 0,25; e 2µL.mL -1 frente ao fungo Aspergillus parasiticus. Iauk et al. (2003) utilizaram o extrato metanólico do fruto, frente a bactérias de origem periodontais, sendo esse não muito ativo, embora tenha apresentado boa atividade contra Eikenella corrodens (CIM 512 mg/l). Das & Sneha (2013) estudou a atividade antibacteriana de diferentes extratos do fruto, sendo que os solventes polares demonstraram melhor atividade antimicrobiana em relação aos não polares frente a bactérias Gram positivas, dentre elas a Staphylococcus aureus e Gram negativas como a Escherichia coli. 4 CONCLUSÃO O resultado desse estudo demonstra que o óleo essencial da planta Illicium verum, conhecida como Anis estrelado, possui uma atividade antimicrobiana promissora frente a bactérias Gram positivas e Gram negativas. Contudo, estudos adicionas são necessários para determinar o mecanismo de ação e a citotoxicidade do óleo essencial. 5 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Bertini, L.M., Pereira, A.F., Oliveira, C.L.L, Menezes, E.A., Morais, S.M., Cunha, F.A., Cavalcanti, E.S.B. (2005). Perfil de sensibilidade de bactérias frente a óleos essenciais de algumas plantas do nordeste do Brasil. Infarma, 42(3/4). BRASIL (2010) Farmacopeia Brasileira. Agência Nacional de Vigilância Sanitária - ANVISA. v p. Brasília. Cu, J.Q., Perineau, F., Goepfert, G., (1990). GC/MS analysis of star anise oil. Journal of Essential Oil Research 2, Das, M. P., & Sneha, S. (2013) In vitro antibacterial and antifungal potential of Illicium verum. An International Journal 1(8), De, M., De, A. K., Sen, P., & Banerjee, A. B. (2002). Antimicrobial properties of star anise (Illicium verum Hook f). Phytotherapy Research, 16(1), Freire, J. M. (2008). Óleos essenciais de Canela, Manjerona e Anis-Estrelado: caracterização química e atividade biológica sobre: Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Aspergillus flavus e Aspergillus parasiticus. (Dissertação de Mestrado em Agroquímica). Universidade Federal de Lavras, Minas Gerais. Freire, J. M., Cardoso, M. G., Batista, L. R., & Andrade, M. A. (2011). Essential oil of Origanum majorana L., Illicium verum Hook. f. and Cinnamomum zeylanicum Blume: chemical and antimicrobial characterization. Revista Brasileira de Plantas Medicinais, 13(2), Iauk, L., Lo Bue, A. M., Milazzo, I., Rapisarda, A., & Blandino, G. (2003). Antibacterial activity of medicinal plant extracts against periodontopathic bacteria. Phytotherapy Research, 17(6), Li, S., & Liu, S. (2000). Chemical constituents of essential oil from Cenxi s Illicium. China Condiment 20, Lima, R.K. Cardoso, M.G., Moraes, J., Vieira, S., Melo, B., Filgueiras, C. (2008). Composição dos Óleos Essenciais de Anis-estrelado Illicium verum L. e de Capim-limão Cymbopogon citratus (DC.) Stapf: Avaliação do Efeito Repelente sobre Brevicoryne brassicae (L.) (Hemiptera: Aphididae). BioAssay, 3.

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