(11) Número de Publicação: PT 106520 (51) Classificação Internacional: C12N 9/60 (2006) (12) FASCÍCULO DE PATENTE DE INVENÇÃO (22) Data de pedido: 2012.09.05 (30) Prioridade(s): (43) Data de publicação do pedido: 2014.03.05 (73) Titular(es): UNIVERSIDADE DO PORTO GABINETE UPIN, PRAÇA GOMES TEIXEIRA 4º ANDAR, SALA 419 4099-002 PORTO PT CIENCINVEST - VALORIZAÇÃO ECONÓMICA DA CIÊNCIA, S.A. AVENIDA DR. ANTUNES GUIMARÃES, Nº 103 4100-079 PORTO PT UNICER - BEBIDAS, S.A. VIA NORTE MATOSINHOS 4466-955 LEÇA DO BALIO PT (72) Inventor(es): ISABEL MARIA PINTO LEITE VIEGAS OLIVEIRA FERREIRA SANDRA JULIANA VIEIRA TEIXEIRA OLÍVIA MARIA CASTRO PINHO ELSA MARISA FERREIRA VIEIRA PT PT PT PT (74) Mandatário: MARIA SILVINA VIEIRA PEREIRA FERREIRA RUA CASTILHO, N.º 50, 5º - ANDAR 1269-163 LISBOA PT (54) Epígrafe: MÉTODO DE OBTENÇÃO DE EXTRATOS ENZIMÁTICOS, EXTRATOS ENZIMATICOS OBTIDOS PELO REFERIDO MÉTODO E SUAS APLICAÇÕES (57) Resumo: A PRESENTE INVENÇÃO ESTÁ RELACIONADA COM UM MÉTODO DE OBTENÇÃO DE EXTRATOS ENZIMÁTICOS, EXTRATOS ENZIMATICOS OBTIDOS PELO REFERIDO MÉTODO E SUAS APLICAÇÕES, A UTILIZAÇÃO DOS EXTRATOS ENZIMÁTICOS DO EXCEDENTE DE LEVEDURA CERVEJEIRA OBTIDOS PARA A HIDRÓLISE DAS PROTEÍNAS DA DRECHE CERVEJEIRA, CARNE, PEIXE E DE OUTROS SUBSTRATOS PROTEICOS. A PRESENTE INVENÇÃO TEM APLICAÇÃO NAS ÁREAS DE APROVEITAMENTO/VALORIZAÇÃO DE SUBPRODUTOS DA INDÚSTRIA CERVEJEIRA, COM VISTA À OBTENÇÃO DE INGREDIENTES OU ALIMENTOS TRATADOS. O EXTRATO ENZIMÁTICO CONTENDO PEPTIDASES DO EXCEDENTE DE LEVEDURA PODE SER USADO PARA HIDROLISAR AS PROTEÍNAS DA DRECHE CERVEJEIRA OU DE OUTRAS INDÚSTRIAS, NOMEADAMENTE, PROTEÍNAS DO MÚSCULO DE PEIXE E DE CARNE E PROTEÍNAS DE LEITE. AS PEPTIDASES DO EXTRATO ENZIMÁTICO PODEM AINDA SER USADAS PARA MELHORAR AS CARACTERÍSTICAS ORGANOLÉPTICAS DOS PRODUTOS CÁRNEOS, REMOVER NÓDOAS DA ROUPA, FACILITAR A ESFOLIAÇÃO E LIMPEZA DA PELE, NA CONSERVAÇÃO DO PATRIMÓNIO CULTURAL E NA REMOÇÃO VERNIZES PROTEICOS.
RESUMO MÉTODO DE OBTENÇÃO DE EXTRATOS ENZIMÁTICOS, EXTRATOS ENZIMATICOS OBTIDOS PELO REFERIDO MÉTODO E SUAS APLICAÇÕES A presente invenção está relacionada com um método de obtenção de extratos enzimáticos, extratos enzimaticos obtidos pelo referido método e suas aplicações, a utilização dos extratos enzimáticos do excedente de levedura cervejeira obtidos para a hidrólise das proteínas da dreche cervejeira, carne, peixe e de outros substratos proteicos. A presente invenção tem aplicação nas áreas de aproveitamento/valorização de subprodutos da indústria cervejeira, com vista à obtenção de ingredientes ou alimentos tratados. O extrato enzimático contendo peptidases do excedente de levedura pode ser usado para hidrolisar as proteínas da dreche cervejeira ou de outras indústrias, nomeadamente, proteínas do músculo de peixe e de carne e proteínas de leite. As peptidases do extrato enzimático podem ainda ser usadas para melhorar as características organolépticas dos produtos cárneos, remover nódoas da roupa, facilitar a esfoliação e limpeza da pele, na conservação do património cultural ena remoção vernizes proteicos.
1 DESCRIÇÃO MÉTODO DE OBTENÇÃO DE EXTRATOS ENZIMÁTICOS, EXTRATOS ENZIMATICOS OBTIDOS PELO REFERIDO MÉTODO E SUAS APLICAÇÕES Domínio Técnico da Invenção A presente invenção tem aplicação nas áreas de aproveitamento/valorização de subprodutos da indústria cervejeira, com vista à obtenção de ingredientes e alimentos previamente hidrolisados. A presente invenção diz ainda respeito à utilização das peptidases do excedente da levedura, obtidas por disrupção mecânica das células, na hidrólise de substratos proteicos de origem vegetal ou animal, podendo ser aplicadas na hidrólise de proteínas da dreche, caseínas, proteínas da clara de ovo, proteínas de soro de leite, proteínas do músculo de peixe e de carne, como a elastina, entre outras. Antecedentes da Invenção O excedente de levedura e a dreche são produzidos em larga escala a nível mundial e têm potencialidades para serem usados como matéria-prima de baixo custo para a obtenção de produtos de valor acrescentado. A valorização de subprodutos é um conceito inovador no domínio da gestão dos resíduos contribuindo para um desenvolvimento sustentável. A indústria cervejeira produz anualmente vários subprodutos, sendo a dreche e o excedente de levedura os subprodutos produzidos em maior quantidade. Contudo, as suas principais aplicações limitam-se à alimentação animal e muitas vezes o aterro é um dos destinos destes subprodutos. Várias aplicações agro-
2 industriais têm sido estudadas, em particular na alimentação humana e a utilização a nível biotecnológico, conforme apresentadas nos documentos CN101748076A e CN101074431A, no entanto, a aplicação industrial ainda é limitada. A levedura da cerveja é utilizada pelo cervejeiro várias vezes geralmente, três a seis vezes e recolhida de uma fermentação para iniciar a seguinte. O excedente de levedura contém várias peptidases intracelulares, dos principais tipos catalíticos. Contudo, as peptidases da levedura da cerveja não têm sido alvo de interesse comercial, provavelmente, devido à sua natureza intracelular, que obriga à utilização de métodos de disrupção celular (mecânicos ou não mecânicos). Os métodos de disrupção celular mecânicos frequentemente utilizados na ruptura de células de leveduras, para obtenção de enzimas intracelulares incluem técnicas como, agitação com esferas de vidro (também denominada Bead mill quando aplicada a nível industrial) e homogeneização por alta pressão. Os métodos mecânicos apresentam uma elevada eficiência comparativamente com os métodos não mecânicos. No entanto, apesar de eficientes, e de apresentarem potencial aplicação à escala industrial, apresentam alguns inconvenientes, uma vez que são pouco selectivos e conduzem a um aumento de temperatura, o que requer um sistema de refrigeração adequado, para evitar a desnaturação das enzimas pelo calor (Balasundaram et al., 2009).
3 Os métodos não mecânicos podem ser físicos, químicos e enzimáticos (Balasundaram et al., 2009). Os métodos químicos apresentam limitações económicas devido ao elevado custo dos reagentes necessários para a ruptura a larga escala, bem como, devido à dificuldade em remover esses reagentes do produto de interesse. A exposição das enzimas a agentes químicos pode conduzir à desnaturação (Balasundaram et al., 2009). As peptidases das leveduras podem ser utilizadas na hidrólise de proteínas intracelulares da própria levedura, por um processo designado de autólise (Neklyudov et al., 2000). Este pode ser induzido pela exposição das células a solventes orgânicos e/ou altas temperaturas. O controlo da temperatura é essencial para impedir a desnaturação das enzimas. De acordo com a literatura o excedente de levedura após autólise pode ser utilizado para obtenção de hidrolisados de proteínas. Roy e colaboradores (Roy et al., 2000) estudaram a obtenção de hidrolisados a partir das proteínas do leite com peptidases presentes em extratos enzimáticos de levedura Saccharomyces cerevisiae. A peptidase B, presente nos extratos enzimáticos obtidos por autólise, permitiu a obtenção de hidrolisados com actividade inibidora da enzima de conversão da angiotensina I. Neklyudov e colaboradores (Neklyudov et al., 1996; Neklyudov et al., 1998) utilizaram a levedura da cerveja, em particular, a levedura Saccharomyces carlsbergensis, como fonte de peptidases para obtenção de hidrolisados a partir de proteínas de sangue animal. Os hidrolisados obtidos são ricos em aminoácidos essenciais, como por exemplo, a isoleucina.
4 Um factor chave na produção industrial de enzimas intracelulares é o tempo requerido para obter uma disrupção celular eficiente. A autólise, mesmo quando acelerada pela presença de solventes, detergentes e/ou temperatura demora cerca de 24 h. Pelo contrário, os métodos mecânicos permitem a disrupção celular num período de tempo curto (alguns minutos) e sob refrigeração, o que permite elevada eficiência e maior conservação da actividade enzimática. No que respeita ao aproveitamento do excedente de levedura cervejeira, está descrito um método para produzir hidrolisados proteicos do excedente de levedura recorrendo à adição de enzimas hidrolíticas documento CN101074431A. Está também descrito um método de preparação de meios de cultura, utilizando como substrato, para peptidases e glucanases, os componentes do excedente de levedura cervejeira, no documento CN101748076A. No entanto, o excedente de levedura nestes casos é usado como substrato e não como extracto enzimático. A dreche corresponde à fração sólida que resulta da filtração do mosto durante o processo de fabrico da cerveja, é um subproduto rico em proteínas (25% da matéria seca), mas a sua reduzida solubilidade constitui uma das principais limitações para a utilização a nível alimentar. A potencial aplicação das proteínas insolúveis da dreche requer a utilização de métodos de extração químicos, físicos e/ou bioquímicos (Celus et al., 2007; Treimo et al., 2008, Pedido Provisório de Patente nº 105401). As proteínas da dreche podem ser utilizadas como substrato para peptidases. Celus e colaboradores (Celus et al., 2007; Celus et al., 2009) descreveram a hidrólise enzimática das
5 proteínas da dreche, obtidas por extração alcalina e posterior precipitação em meio ácido, com peptidases comerciais. Treimo e colaboradores (Treimo et al., 2008) também utilizaram peptidases comerciais para solubilizar as proteínas da dreche sem realizar qualquer extração prévia. Os hidrolisados de proteínas têm inúmeras aplicações a nível alimentar e terapêutico devido às suas propriedades nutricionais e funcionais. A hidrólise enzimática pode produzir péptidos bioativos com efeitos anti-hipertensivos, antioxidantes, hipocolesterolémicos, antitrombóticos, imunomodulatórios e antimicrobianos. Os hidrolisados podem ser usados em suplementos alimentares como fonte de azoto e aminoácidos essenciais. A hidrólise enzimática melhora a digestibilidade das proteínas e permite obter hidrolisados com uma determinada composição em aminoácidos. A hidrólise enzimática de proteínas depende de vários fatores, tais como, o tipo de peptidases, as caraterísticas físicas e químicas das proteínas utilizadas como substrato e as condições de hidrólise, tais como o ph, a temperatura, a concentração de enzima, a concentração de substrato e o tempo. As principais limitações associadas ao uso industrial de peptidases estão relacionadas com a especificidade do substrato e a economia de aplicação. As peptidases com uma especificidade mais ampla em geral hidrolisam em maior extensão as proteínas utilizadas como substrato. A produção de peptidases com ampla aplicação em diferentes indústrias é importante. É de realçar que a nível industrial as peptidases representam cerca de 60% do
6 mercado total de enzimas com aplicação tanto na indústria alimentar, de detergentes e têxtil, como a nível médico e biotecnológico. Com base nos estudos referidos, a presente invenção propõe a obtenção de um extrato enzimático que contém peptidases de diferentes tipos catalíticos, com diferentes especificidades e que permite a hidrólise de vários substratos proteicos. O extrato enzimático também contém, cerca de 7% (em resíduo seco) de RNA, sendo uma fonte de nucleótidos que têm propriedades intensificadoras do sabor dos alimentos. Adicionalmente, o excedente de levedura é uma fonte económica de outros produtos de valor acrescentado, tais como os β-glucanos da parede celular, compostos com interesse na indústria farmacêutica/cosmética e dos alimentos funcionais. O invento apresenta uma solução inovadora para valorizar os dois principais subprodutos da indústria cervejeira, bem como de outros subprodutos da indústria alimentar (como por exemplo, o soro de leite, carne e peixe). Os hidrolisados obtidos com o presente invento são uma fonte de péptidos com potencial aplicação a nível alimentar e terapêutico. No caso de o substrato proteico ser constituído pelas proteínas da dreche, esta pode ser obtida a partir das frações proteicas resultantes do processo descrito no documento PCT/IB2010/055699.
7 Sumário da Invenção A presente invenção descreve um método de obtenção de um extrato enzimático que compreende os seguintes passos: a) obtenção das células do excedente de levedura da cerveja; b) lavagem das referidas células do excedente de levedura da cerveja, de preferência com água ou com uma solução alcalina ph 8-9; c) extração das peptidases das referidas células por métodos mecânicos, de preferência por agitação com esferas de vidro sob refrigeração com uma solução tampão, e ainda com maior preferência entre 2 a 6ºC a ph 6-7 com solução tampão de fosfato de sódio ou de potássio, ou tampão de TRIS-HCl; d) separação das peptidases das referidas células do restante conteúdo intracelular, esta separação pode ser feita de preferência por centrifugação. Numa realização mais preferencial, os passos do método de obtenção de extratos enzimáticos anteriormente descrito podem ser realizados em contínuo, semi-contínuo ou em batelada. A presente invenção descreve ainda extratos enzimáticos do excedente de levedura cervejeira obteníveis pelo método anteriormente descrito. A composição do extrato enzimático varia, e verificaram-se atividades diferentes se o excedente de levedura utilizado no método de obtenção de extratos enzimáticos foi utilizado três, quatro, cinco ou seis vezes, ou mais, ou suas misturas. Assim sendo, a composição química dos extratos enzimáticos é variável dependendo de quantas vezes foi reutilizado o excedente de
8 levedura da cerveja utilizado no método de obtenção de extratos enzimáticos. O Método de hidrólise de substratos proteicos apresentado compreende os seguintes passos: a) colocar o substrato de natureza proteica em contacto os extratos enzimáticos anteriormente descritos durante pelo menos 20 minutos; b) inativação das enzimas; c) e em alguns casos pode compreender ainda a remoção dos componentes insolúveis de preferência por centrifugação ou filtração. Os substratos podem ser proteínas da dreche cervejeira, caseínas, proteínas da clara de ovo, proteínas do músculo de carne e de peixe ou proteínas de soro de leite, ou suas misturas, entre outros. Em realizações mais preferenciais do método de hidrólise anteriormente descrito a hidrólise enzimática pode decorrer durante um período de pelo menos 20 minutos, a um ph entre 5 10 de preferência a um ph 6-7, a uma temperatura entre 25-65ºC, de preferência a temperatura entre 37-50ºC. A inativação das enzimas referida no método de hidrólise de substratos proteicos pode ser conseguida por diversos métodos do conhecimento geral, como por exemplo pela ação do calor, do frio, precipitação com ácidos ou solventes orgânicos. Numa realização preferencial a referida inativação das enzimas pode ser efectuada por calor a uma temperatura entre 70-100ºC, de preferência 80-90ºC.
9 A remoção dos compostos insolúveis referidos no método de hidrólise de substratos proteicos pode ser efectuada por diversos métodos, do conhecimento geral, como por exemplo centrifugação ou filtração. Numa realização preferencial, a remoção dos componentes insolúveis pode ser aplicada quando se pretende separar a fracção peptídica que foi hidrolisada, para ser usada como ingrediente. Numa outra realização preferencial, quando se pretende a obtenção de um alimento tratado não se efetua este passo. Assim sendo, a presente invenção permite hidrolisados proteicos obteníveis pelo presente método. A presente invenção descreve ainda produtos alimentares tratados pelo método de hidrólise de substratos proteicos. Numa realização preferencial, os substratos proteicos podem ser diferentes produtos alimentares, carne, peixe, clara de ovo ou leite, entre outros, como por exemplo, produtos fumados ou conservas, em particular fiambre. Numa outra realização preferencial o produto final poderá incluir os extratos proteicos anteriormente descritos. A presente invenção descreve ainda detergentes, cosméticos os quais incluem na sua composição os extratos proteicos anteriormente descritos. A presente invenção descreve ainda a utilização dos extratos enzimáticos anteriormente descritos na remoção de revestimentos de base proteica presentes nas camadas superficiais de objectos de arte, de preferência obras de arte policromadas, quadros, entre outros. Como por exemplo vernizes com componente proteica, clara de ovo, cola animal e cola de peixe, caseína, ou suas misturas.
10 A presente invenção tem aplicação nas áreas de aproveitamento/valorização de subprodutos da indústria cervejeira, com vista à obtenção de ingredientes ou alimentos tratados. O excedente de levedura e a dreche cervejeira têm potencialidades para serem usados como matéria-prima de baixo custo para a obtenção de produtos de valor acrescentado, contribuindo para um desenvolvimento sustentável. Descrição pormenorizada da Invenção O presente invento propõe a obtenção de um extrato enzimático, que contém peptidases, a partir do excedente da levedura cervejeira. O extrato enzimático, obtido por disrupção mecânica das células, pode ser utilizado na hidrólise das proteínas da dreche cervejeira e de outros substratos proteicos. A presente invenção descreve um método de obtenção de um extrato enzimático que compreende os seguintes passos: a) separação das células do excedente de levedura da cerveja o qual é que é recolhido no final da fermentação - dos restos de cerveja de preferência por centrifugação, filtração ou outros métodos; b) lavagem das células do excedente de levedura da cerveja com água, ou com soluções ligeiramente alcalinas de preferência com um ph 8-9, por de preferência centrifugação, filtração ou outros métodos. De preferência recomendam-se duas lavagens, utilizando de preferência a proporção de 1:1 (1 tonelada de células: 1 kl de água) ; c) ressuspensão das células de levedura em solução de tampão com concentração 10-100 mm, ph 6-7 (1:1);
11 d)disrupção mecânica das células de levedura sob refrigeração; e) separação, por centrifugação, dos restos celulares -componentes da parede celular- do conteúdo intracelular e obtenção do extrato enzimático, que contém as peptidases do excedente da levedura cervejeira. É ainda descrito um método de hidrólise de substratos proteicos que compreendem os seguintes passos: hidrólise enzimática de substratos proteicos -como por exemplo da dreche cervejeira com ou sem prétratamento, da clara de ovo, do leite, da carne e do peixe, entre outras - com o extracto enzimático obtido pelo método anteriormente descrito, - disrupção mecânica a partir do excedente de levedura cervejeira. A hidrólise enzimática poderá decorrer de preferência durante um período de incubação, de pelo menos, 20 minutos, a um ph de 5 a 10, de preferência de 6 a 7, e a uma temperatura de 25 a 65ºC, de preferência de 37 a 50ºC, não ultrapassando de preferência os 65ºC, ainda mais de preferência 60ªC; inativação das enzimas por métodos adequados como por exemplo pelo calor, frio, precipitação com ácidos ou solventes orgânicos; remoção dos componentes insolúveis de preferência por centrifugação, filtração ou outros métodos. Todas as etapas anteriormente descritas para o método de obtenção de um extracto enzimático podem ser realizadas em batelada batch, semi-contínuo - fed-batch ou em contínuo.
12 O método descrito é utilizado para obter extractos de enzimas em particular peptidases, passíveis de serem usadas na indústria de produtos cárneos, de peixe, ou leite para melhorar as características organolépticas dos mesmos, na indústria dos detergentes para ajudar a remover nódoas da roupa, na indústria de cosméticos para facilitar a esfoliação e limpeza da pele e na conservação do património cultural, na remoção vernizes proteicos presentes nas camadas superficiais de objetos em particular em objectos de arte policromados. O invento é também utilizado para obter hidrolisados proteicos que podem ser usados como ingredientes em suplementos alimentares, como fonte de azoto e aminoácidos essenciais, com elevada digestibilidade. Os substratos proteicos incluem as proteínas da dreche cervejeira, as proteínas da levedura e resíduos de outras indústrias, nomeadamente, proteínas de leite, de carne e de peixe. A presente invenção descreve a utilização de um extrato enzimático, obtido por disrupção mecânica, que contém as peptidases do excedente de levedura cervejeira, para realizar a hidrólise das proteínas da dreche cervejeira, com ou sem pré-tratamento de extração e isolamento da fração proteica, ou seja o aproveitamento simultâneo dos dois subprodutos da indústria cervejeira mais abundantes. É também novidade a aplicação de peptidases de levedura cervejeira para solubilizar as proteínas da dreche sem realizar qualquer extração prévia, assim como, para hidrolisar outros substratos, como proteínas da clara de ovo, de carne e de peixe.
13 Descrição das Figuras Para uma mais fácil compreensão da invenção junta-se em anexo a figura, que, representa realizações preferenciais do invento que, contudo, não pretende, limitar o objecto da presente invenção. A Figura 1 descreve algumas das etapas do método para obtenção do extrato enzimático e posterior hidrólise de substratos proteicos em que: (1) representa a obtenção do extrato da levedura da cerveja pela remoção dos restos de cerveja por centrifugação, filtração ou outros métodos. (2) representa a lavagem das células do excedente de levedura cervejeira com água ou com uma solução ligeiramente alcalina, por centrifugação, filtração ou outros métodos, para remover resíduos solúveis. (3) representa a disrupção celular por métodos mecânicos, de preferência em meio tamponado (ph 6-7) e com refrigeração. (4) representa a centrifugação da suspensão resultante da desintegração celular para separar os restos celulares (β-glucanos da parede celular e outros constituintes insolúveis) do conteúdo intracelular. (5) representa a hidrólise enzimática do substrato proteico após mistura com extrato enzimático pelo método anteriormente descrito, contendo peptidases do excedente de levedura da cerveja. Após a hidrólise as enzimas são inativadas pelo calor, precipitação com ácido ou solventes orgânicos. Remoção dos componentes insolúveis por centrifugação, filtração ou outras metodologias.
14 Realizações Preferenciais Com o intuito de facilitar a compreensão da invenção descrevem-se de seguida algumas realizações preferenciais do invento, os quais, contudo, não pretendem, limitar o objeto da presente invenção. 1.ª Realização Preferencial: Preparação dos extratos enzimáticos a partir do excedente de levedura cervejeira Efetuou-se a pesagem de 15 20 g de suspensão de células de levedura (19-23% de matéria seca) e em seguida foi realizada uma centrifugação a 5000хg, durante 5 minutos. O pellet de células foi lavado duas vezes com água na proporção de 1:1 (células: água, p/v) por centrifugação a 5000хg durante 5 minutos. O pellet de células lavado foi novamente pesado (cerca de 5 g), ressuspendido em tampão fosfato de sódio 100 mm, ph 7 e foram adicionadas esferas de vidro à suspensão celular, na proporção de 1:1:1 (células:tampão:esferas, p/v/p). A disrupção celular foi realizada por agitação no vortex 10 vezes (1 minuto cada) com intervalos de 1 minuto no gelo. Após a remoção das esferas de vidro, foi realizada uma centrifugação a 15000хg durante 40 minutos. Todas as operações foram realizadas a 4ºC. O extrato enzimático obtido contém as peptidases do excedente da levedura cervejeira. A actividade proteolítica do extrato enzimático foi avaliada pelo método de hidrólise da caseína 1% (p/v), a ph 7 e à temperatura de 37ºC.
15 A solução de caseína foi preparada por suspensão de 1 g de caseína em 100 ml de tampão fosfato a ph 7 e em seguida, foi aquecida a 80-90ºC durante 15 minutos, com agitação. Após arrefecimento, 1 ml de substrato de caseína e 800 μl de tampão fosfato, ph 7 (100 mm) foram incubados durante 5 minutos à temperatura de 37ºC. A hidrólise enzimática foi iniciada após a adição de 200 μl de extrato enzimático (peptidases do excedente de levedura, ph 7). Após 30 minutos de incubação a 37ºC, foram adicionados 3 ml de uma mistura contendo 100 mm TCA, 1,9% (v/v) ácido acético e 220 mm de acetato de sódio, conservada a 4ºC. Deixou-se em repouso durante 30 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, o precipitado foi removido por centrifugação a 10000хg, durante 10 minutos. A quantidade de péptidos solúveis em TCA foi medida espectrofotometricamente a 280 nm. O ensaio em branco foi preparado pela adição de 3 ml da solução de TCA antes da adição das enzimas. O extrato enzimático tinha uma atividade de 3,57 U (Unidades de Actividade) a ph 7 e a 37ºC. Uma unidade foi definida como a quantidade de enzima necessária para libertar o equivalente a 1 μmol de L-tirosina por minuto nas condições do ensaio. A quantidade de tirosina foi determinada a partir de uma recta padrão de L-tirosina, utilizando uma solução de L-tirosina 1,1 mm. O excedente de levedura pode ser reutilizado três a seis vezes, ou mais, deste modo a composição química é variável dependendo do número de reutilizações da levedura. A análise do excedente de levedura proveniente de diferentes gerações revelou que este continha um teor variável de humidade, oscilando entre 77 e 81 %. No que respeita ao extrato enzimático, expresso em produto seco, este contém
16 entre 73 e 77 % de proteína, cerca de 7% de RNA, 6,5% de lípidos, 9 % de glúcidos e 1% de cinzas. Deste modo, a atividade proteolítica dos extratos enzimáticos também sofre oscilações dependendo do número de vezes que a levedura é reutilizada. Os extratos enzimáticos obtidos apresentaram uma concentração de proteína entre 21,5 e 34,2 mg/ml. A análise destes extratos por cromatografia líquida de alta performance, com coluna de exclusão de tamanho e deteção no UV a 280 nm, permitiu conhecer a distribuição do peso molecular das proteínas presentes no extrato enzimático, expressa como percentagem de área de cada fração relativa à área total do cromatograma: Peso molecular 66-40 KDa 40-20 KDa <10KDa % de área relativa à área total 45 35 20 A análise de extractos enzimáticos obtidos a partir de leveduras com 4, 5 e 6 reutilizações indicou um aumento da actividade enzimática e do teor de proteínas com o número de reutilizações da levedura. A análise de extractos enzimáticos obtidos a partir de duas amostras diferentes de levedura retiradas do tanque contendo a mistura das várias reutilizações da levedura que iam ser rejeitadas apresentou uma actividade enzimática intermédia.
17 A actividade máxima verificada foi considerada 100% e as actividades relativas foram calculadas: Nº de Mistura Mistura reutilizações 4 5 6 A B da levedura Atividade 82 91 100 87 84 Relativa (%) 2.ª Realização Preferencial: Aplicação das peptidases do excedente da levedura da cerveja na hidrólise enzimática das proteínas da dreche a 37 ºC e ph entre 5 e 10 1)Preparação do substrato proteico (solução de proteínas da dreche cervejeira) Preparou-se um Concentrado de Proteína da dreche por extracção alcalina da dreche húmida 150 g (78 % humidade) com 300 ml de KOH 0,1 M (43% (p/v)), durante 60 minutos, a 60ºC e com agitação. Em seguida, foi realizada uma centrifugação a 15000хg, durante 15 minutos a 4ºC. As proteínas presentes no sobrenadante foram precipitadas por acidificação a ph 4, com ácido cítrico 2 M. Posteriormente foi realizada uma centrifugação a 15000хg, durante 15 minutos a 4ºC. O precipitado contendo 52-64 % proteínas foi recolhido e liofilizado. Três gramas do liofilizado foram solubilizadas em 100 ml de tampão Tris-HCl, a ph 8, durante 60 minutos, à temperatura ambiente. Após a solubilização, foi realizada uma centrifugação (15000хg durante 15 minutos), o sobrenadante é uma solução com cerca de 1,9% de proteínas da dreche. Esta solução foi diluída de forma a obter uma concentração
18 de proteína de 2 mg/ml, a qual foi utilizada como substrato para as peptidases nos exemplos 2 e 3. A análise da solução de proteínas da dreche por cromatografia líquida de alta performance, com coluna de exclusão de tamanho e deteção no UV a 280 nm, permitiu conhecer a distribuição do peso molecular nas proteínas da dreche, expressa como percentagem de área de cada fração relativa à área total do cromatograma: Peso molecular 60-14 KDa* < 14KDa % de área relativa à 85 15 área total * fração proteica que correspondente às hordeínas A, B, C e gluteninas 2) Hidrólise das proteínas da dreche a 37 ºC e ph entre 5 e 10 1 ml de substrato (proteínas da dreche, 2 mg/ml) e 800 μl de tampão (100 mm) [tampão acetato de sódio (ph 5), fosfato de sódio (ph 6-7), Tris-HCl (ph 8) e glicina-naoh (ph 9-10)] foram incubados durante 5 minutos à temperatura de 37ºC. A hidrólise enzimática foi iniciada após a adição de 200 μl de extrato enzimático (peptidases do excedente de levedura). Após 30 minutos de incubação a 37ºC, foram adicionados 3 ml de uma mistura contendo 100 mm TCA, 1,9% (v/v) ácido acético e 220 mm de acetato de sódio, conservada a 4ºC. Deixou-se em repouso durante 30 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, o precipitado foi removido por centrifugação a 10000хg, durante 10 minutos. A quantidade de péptidos solúveis em TCA foi medida espectrofotometricamente a 280 nm. Os ensaios em branco
19 foram preparados pela adição de 3 ml da solução de TCA antes da adição das enzimas. A actividade máxima verificada foi considerada 100% e as actividades relativas foram calculadas: ph 5 6 7 8 9 10 Atividade Relativa (%) 32 100 83 44 18 1 3.ª Realização Preferencial: Aplicação das peptidases do excedente da levedura da cerveja na hidrólise enzimática das proteínas da dreche a ph 6 e temperatura de 25, 37, 45, 50, 60 e 70 ºC 1 ml de substrato (proteínas da dreche, 2 mg/ml) e 800 μl de tampão fosfato de sódio ph 6, 100 mm, foram incubados durante 5 minutos a diferentes temperaturas (25, 37, 45, 50, 60 e 70 ºC). A hidrólise enzimática foi iniciada após a adição de 200 μl de extrato enzimático (peptidases do excedente de levedura). Após 30 minutos de incubação a 25, 37, 45, 50, 60 e 70 ºC, foram adicionados 3 ml de uma mistura contendo 100 mm TCA, 1,9% (v/v) ácido acético e 220 mm de acetato de sódio, conservada a 4ºC. Deixou-se em repouso durante 30 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, o precipitado foi removido por centrifugação a 10000хg, durante 10 minutos. A quantidade de péptidos solúveis em TCA foi medida espectrofotometricamente a 280 nm. Os ensaios em branco foram preparados pela adição de 3 ml da solução de TCA antes da adição das enzimas.
20 A atividade máxima verificada foi considerada 100% e as atividades relativas foram calculadas: Temperatura (ºC) 25 37 45 50 60 70 Atividade Relativa (%) 13 47 84 100 96 6 4.ª Realização Preferencial: Aplicação das peptidases do excedente da levedura da cerveja na hidrólise enzimática das proteínas da dreche, a 50 ºC e ph 6 1) Substrato proteico: solução de proteínas da dreche Três gramas de concentrado de proteínas da dreche liofilizado (obtido no exemplo 2.1) foram solubilizados em 100 ml de água, alcalinizando com NaOH até ph 8, com agitação durante 60 minutos, à temperatura ambiente. A concentração desta solução era cerca de 1,9% de proteínas da dreche. A hidrólise enzimática foi iniciada após a adição de 2 ml de extrato enzimático (peptidases do excedente de levedura, ph 6) a 10 ml da solução de proteínas da dreche, ajustou-se o ph final a 6 com 3 ml de tampão fosfato, 100 mm. Após 30 minutos de incubação a 50ºC, a reacção enzimática foi interrompida por aquecimento a 90 ºC durante 30 segundos. Paralelamente, efetuou-se o seguinte ensaio: 10 ml de solução de proteínas da dreche, 3 ml de tampão fosfato ph 6 (100 mm) e 2 ml de extrato enzimático (peptidases do excedente de levedura, ph 6). As proteínas foram desnaturadas isto é, inactivadas, logo após a adição do extrato enzimático, por aquecimento a 90ºC. A mistura de proteínas da dreche com o extrato enzimático e o hidrolisado foram analisados por cromatografia líquida de alta performance com coluna de exclusão de tamanho e detetor de UV a 280 nm. Quantificou-se a percentagem de
21 área de cada fração proteica relativamente à área total do cromatograma: Peso molecular 66-14 KDa < 14KDa Mistura proteínas da dreche + 85* extrato enzimático 15* Hidrolisado de proteínas da dreche 14* 86* * resultados expressos em percentagem de área de cada fração proteica relativamente à área total do cromatograma 2) Substrato proteico: suspensão de dreche em NaOH sem qualquer pré-tratamento 50 gramas de dreche cervejeira sem qualquer tratamento prévio foram misturadas com 100 ml de água, alcalinizando com NaOH até ph 8, a mistura foi agitada durante 60 minutos, à temperatura ambiente (a concentração de proteínas da dreche no sobrenadante era 1,2%). A 10 ml da suspensão de dreche em solução alcalina adicionaram-se 3 ml de tampão fosfato, ph 6 100 mm e 2 ml de extrato enzimático (peptidases do excedente de levedura, ph 6). Após 30 minutos de incubação a 50ºC, a reacção enzimática foi interrompida por aquecimento a 90 ºC durante 30 segundos. Paralelamente, efetuou-se o seguinte ensaio: 10 ml de substrato (suspensão de dreche em solução alcalina), 3 ml de tampão fosfato ph 6 (100 mm) e 2 ml de extrato enzimático (peptidases do excedente de levedura, ph 6). As proteínas foram desnaturadas logo após a adição do extrato enzimático por aquecimento a 90ºC.
22 A suspensão da dreche com o extrato enzimático e o hidrolisado foram analisados por cromatografia líquida de alta performance com coluna de exclusão de tamanho e detetor de UV a 280 nm. Quantificou-se a percentagem de área de cada fração proteica relativamente à área total do cromatograma: Peso molecular 66-14 KDa < 14KDa Mistura proteínas da dreche + extrato enzimático 85* 15* Hidrolisado de proteínas da dreche 12* 88* * resultados expressos em percentagem de área de cada fração proteica relativamente à área total do cromatograma 5.ª Realização Preferencial: Aplicação das peptidases do excedente da levedura da cerveja na hidrólise enzimática das proteínas da clara de ovo e das proteínas do leite. 1)Preparação dos substratos proteicos (proteínas da clara de ovo e proteínas do leite) Efetuou-se a desnaturação proteica de 100 g de clara do ovo por processo mecânico até obter espuma consistente (claras em castelo). Deixou-se em repouso 12 h e a fração líquida, contendo as proteínas desnaturadas, foi diluída de forma a obter uma concentração de proteína de 10 mg/ml, a qual foi utilizada como substrato para as peptidases. Leite de vaca cru (25 ml), contendo 3,5 % de gordura, foi centrifugado a 5000g durante 5 minutos, a 4ºC e a gordura removida com auxílio de uma espátula. O leite desnatado foi diluído com água até obter uma concentração de 10 mg/ml.
23 2) Hidrólise das proteínas da clara de ovo e das proteínas do leite 1 ml de substrato (de proteínas da clara de ovo ou de proteínas do leite) e 700 μl de tampão fosfato ph 7 (100 mm) foram incubados durante 5 minutos à temperatura de 50ºC. A hidrólise enzimática foi iniciada após a adição de 300 μl de extrato enzimático (peptidases do excedente de levedura, ph 7). Após 30 minutos de incubação a 50ºC, as enzimas foram inativadas a 90ºC durante 30 segundos. Paralelamente, efetuou-se o seguinte ensaio: 1 ml de substrato (de proteínas da clara de ovo ou de proteínas do leite), 700 μl de tampão fosfato ph 7 (100 mm) e 300 μl de extrato enzimático (peptidases do excedente de levedura, ph 7). As proteínas desnaturadas logo após a adição do extrato enzimático por aquecimento a 90ºC. A mistura de proteínas da clara de ovo ou de proteínas do leite com o extrato enzimático e os respectivos hidrolisados foram analisados por cromatografia líquida de alta performance com coluna de exclusão de tamanho e detetor de UV a 280 nm, tendo sido quantificada a percentagem de área de cada fração proteica relativamente à área total do cromatograma. 84 % das proteínas da clara de ovo apresentam peso molecular entre 45 e 20 KDa. Nos hidrolisados das proteínas da clara do ovo 34% da fração proteica corresponde a péptidos com peso molecular entre 10 e 0,2 KDA, o resto das proteínas permaneceram intactas. No que respeita às proteínas mais abundantes do leite [caseínas (25-35 KDa), β-lactoglobulina (18 KDa) e α- lactalbumina (14 KDa)] estas sofreram hidrólise na presença das peptidases do excedente de levedura, com formação de
24 péptidos e aminoácidos livres (entre 10-0,1 KDa). Verificou-se, no entanto, diferente rendimento de hidrólise dependendo das proteínas, 88% para a caseína, 100% para a α-lactalbumina e 48 % para a β-lactoglobulina. 5.ª Realização Preferencial: Aplicação das peptidases do excedente da levedura da cerveja na hidrólise enzimática de elastina a 37ºC e ph entre 7, durante 48 horas. 1 mg de elastina SigmaAldrich (liofilizado obtido do ligamento do pescoço de bovino lyophilized powder from bovine neck ligament) e 800 μl de tampão fosfato ph 7 (100 mm) foram incubados durante 5 minutos à temperatura de 37ºC. A hidrólise enzimática foi iniciada após a adição de 400 μl de extrato enzimático (peptidases do excedente de levedura, ph 7). Após 48 horas de incubação a 37ºC, as enzimas foram inativadas por adição de 3 ml de TCA 10% (m/v) a 4ºC. A suspensão de elastina com o extrato enzimático e os respectivos hidrolisados foram analisados por cromatografia líquida de alta performance, com coluna de fase reversa e detetor de UV a 214 nm, tendo sido quantificada a percentagem de área de três frações proteicas distintas: (i) péptidos hidrofílicos com tempo de retenção (TR) entre 7 e 10 minutos; (ii) péptidos hidrofóbicos com tempo de retenção entre 15 e 20 minutos; (iii) proteínas intactas com tempo de retenção superior a 25 minutos. Quantificou-se a percentagem de área de cada uma destas frações proteicas relativamente à área total do cromatograma:
25 Péptidos hidrofílicos TR: 7-10 min Péptidos hidrofóbicos TR: 15-20 min Proteínas TR: >25 min Mistura elastina + extrato enzimático 1%* 3%* 96%* Hidrolisado de elastina 8%* 35%* 53%* * resultados expressos em percentagem de área de cada fração proteica relativamente à área total do cromatograma integrada após os 5 minutos de eluição. Nos hidrolisados da elastina, 43% da fração proteica corresponde a péptidos, com tempos de retenção entre os 7 e os 20 minutos. Referências: BALASUNDARAM, B., HARRISON, S. e BRACEWELL, D.G. 2009. Advances in product release strategies and impact on bioprocess design. Trends Biotechnol 27(8), 477-485. FERREIRA, I.M.P.L.V.O., PINHO, O., VIEIRA, E. e TAVARELA, J.G. 2010. Brewer's Saccharomyces yeast biomass: characteristics and potential applications. Trends Food Sci Tech 21(2), 77-84. MUSSATTO, S.I. 2009. Biotechnological Potential of Brewing Industry By-Products. In Biotechnology for Agro- Industrial Residues Utilisation: Utilisation of Agro- Residues, (P.S. Nigam and A. Pandey) pp. 313-326, Springer.
26 MUSSATTO, S.I., DRAGONE, G. e ROBERTO, I.C. 2006. Brewers' spent grain: generation, characteristics and potential applications. J Cereal Sci 43(1), 1-14. NEKLYUDOV, A.D., ILYUKHINA, V.P., MOSINA, G.I., PETRAKOVA, A.N., FEDOROVA, N.F. e KUZNETSOV, V.D. 1996. Hydrolysis of protein substrates by yeast proteases. Appl Biochem Micro+ 32(2), 213-218. NEKLYUDOV, A.D., IVANKIN, A.N., MOSINA, G.I., PETRAKOVA, A.N. e GOROSHKO, G.P. 1998. Optimum conditions for hydrolysis of protein substrate by yeast proteases from Saccharomyces carlsbergensis. Appl Biochem Micro+ 34(4), 358-361. NEKLYUDOV, A.D., IVANKIN, A.N. e BERDUTINA, A.V. 2000. Production and purification of protein hydrolysates (Review). Appl Biochem Micro+ 36(4), 317-324. ROY, M.K., WATANABE, Y. e TAMAI, Y. 2000. Yeast protease B-digested skimmed milk inhibits angiotensin-iconverting-enzyme activity. Biotechnol Appl Bioc 31, 95-100. CELUS, I., BRIJS, K. e DELCOUR, J.A. 2007. Enzymatic hydrolysis of brewers' spent grain proteins and technofunctional properties of the resulting hydrolysates. J Agr Food Chem 55(21), 8703-8710. CELUS, I., BRIJS, K. e DELCOUR, J.A. 2009. Fractionation and characterization of brewers' spent grain protein hydrolysates. J Agric Food Chem 57(12), 5563-5570. TREIMO, J., ASPMO, S.I., EIJSINK, V.G. e HORN, S.J. 2008. Enzymatic solubilization of proteins in brewer's spent grain. J Agric Food Chem 56(13), 5359-5365. A presente invenção não é, naturalmente, de modo algum restrito às realizações descritas neste documento e uma
27 pessoa com conhecimentos médios da área poderá prever muitas possibilidades de modificação da mesma sem se afastar da ideia geral da invenção, tal como definido nas reivindicações. As realizações preferenciais acima descritas são obviamente combináveis entre si. As seguintes reivindicações definem adicionalmente realizações preferenciais da presente invenção. Lisboa, 5 de Setembro de 2013.
1 REIVINDICAÇÕES 1. Método de obtenção de um extracto enzimático caracterizado por compreender os seguintes passos: a) obtenção das células do excedente de levedura da cerveja; b) lavagem das referidas células do excedente de levedura da cerveja; c) extração das enzimas das referidas células por métodos mecânicos; d) separação das enzimas das referidas células do restante conteúdo intracelular. 2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por as enzimas serem peptidases. 3. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por o método mecânico utilizado no passo c) ser a agitação com esferas de vidro sob refrigeração com uma solução tampão, de preferência entre 2 a 6ºC a ph 6-7 com solução tampão de fosfato de sódio ou de potássio, ou tampão de TRIS-HCl. 4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por a lavagem das referidas células ser com água ou solução alcalina ph 8-9. 5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por a separação das peptidases referida no passo d) ser por centrifugação.
2 6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por os passos serem em contínuo, semi-contínuo ou em batelada. 7. Extratos enzimáticos do excedente de levedura cervejeira caracterizados por serem obteníveis pelo método descrito nas reivindicações anteriores. 8. Método de hidrolise de substratos proteicos caracterizado por compreender os seguintes passos: a) colocar o substratos de natureza proteica em contacto os extractos de enzimáticos descritos na reivindicação anterior durante pelo menos 20 minutos; b) inativação das enzimas. 9. Método de hidrolise de acordo com a reivindicação anterior, caracterizado por compreender ainda a remoção dos componentes insolúveis de preferência por centrifugação ou filtração. 10. Método de acordo com a reivindicação anterior, caracterizado por os substratos de natureza proteica serem proteínas da dreche cervejeira, caseínas, proteínas da clara de ovo, proteínas de carne, proteínas de peixe ou proteínas de soro de leite. 11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 8-10, caracterizado por a hidrólise enzimática decorrer durante um período de pelo menos 20 minutos, a um ph entre 5-10, a uma temperatura entre 25-65ºC.
3 12. Método de acordo com a reivindicação anterior caracterizado por o ph estar entre 6-7, e a temperatura entre 37-50ºC. 13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 8-12, caracterizado por a referida inactivação das enzimas ser por acção do calor, do frio, precipitação com ácidos ou solventes orgânicos. 14. Método de acordo com a reivindicação anterior, caracterizado por a referida inactivação das enzimas por calor se efectuar a uma temperatura entre 70-90ºC, de preferência 80ºC. 15. Método de acordo as reivindicações 8-14 caracterizado por a referida remoção dos compostos insolúveis ser efectuada por centrifugação ou filtração. 16. Produtos alimentares caracterizado por serem tratados pelo método descrito nas reivindicações 8-15. 17. Produtos alimentares de acordo com a reivindicação anterior caracterizado por o produto alimentar ser carne, peixe, clara de ovo ou leite. 18. Produto cárneo caracterizado por incluir na sua composição o extracto descrito na reivindicação 7. 19. Detergentes caracterizados por incluir na sua composição o extrato descrito na reivindicação 7. 20. Produtos cosméticos caracterizados por compreenderem o extrato descrito na reivindicação 7.
4 21. Hidrolisados proteicos caracterizados por serem obtidos a partir do extrato descrito na reivindicação 7 e obtidos pelo processo descrito nas reivindicações 8 a 15. 22. Utilização dos extratos enzimáticos descritos na reivindicação 7 caracterizados por serem usados na remoção revestimentos de base proteica presentes nas camadas superficiais de objetos, de preferência objetos de arte. Lisboa, 5 de Setembro de 2013.
1/1 Figuras Figura 1
Relatório de Pesquisa de Portugal Ref. do pedido: 106520 CLASSIFICAÇÃO DA MATÉRIA C12N 9/60 De acordo com a Classificação Internacional de Patentes DOCUMENTAÇÃO E BASES DE DADOS ELETRÓNICAS PESQUISADAS WPI, EPODOC, NPL, MEDLINE, BIOSIS, EMBASE, XPESP DOMÍNIOS TÉCNICOS PESQUISADOS C12N De acordo com a Classificação Internacional de Patentes DOCUMENTOS CONSIDERADOS RELEVANTES Categoria* Citação do documento, com indicação, sempre que apropriado, das passagens relevantes Relevante para a reivindicação X ALMEIDA T, ET AL, Proteolytic activity of surplus yeast extracts, 5th meeting of young researchers of university of porto, página 33, 24.02.2012 [todo o documento] 1-6 A FERREIRA IMPLVO, ET AL, Brewer s Saccharomyces yeast biomass: characteristics and potential applications, Trends in Food Science & Technology, Volume 21, nº2, 77 84, 02.2010 [página 82] 1-6 A A WO2007/073945A1 (DSM IP ASSETS) 05.07.2007 [todo o documento] VIEIRA E, ET AL, Saccharomyces cerevisiae brewing biomass as a promising source of nucleotides for flavor enhancers production, 5th meeting of young researchers of university of porto, página 34, 24.02.2012 [todo o documento] 1-6 1-6 * Categorias dos documentos citados: A Estado da técnica; X Documento de particular relevância quando considerado isoladamente; Y Documento de particular relevância quando combinado com um ou mais deste tipo de documentos; E Pedido de patente anterior publicado na mesma data ou em data posterior à do pedido; L Documento citado por qualquer outra razão; Data do termo da pesquisa 2013.11.19 Data de elaboração do Relatório de Pesquisa 2013.11.19 T & P D O Princípio ou teoria subjacente à invenção; Documento membro da mesma família de documentos de patente; Documento publicado antes da data de pedido mas depois da data de prioridade; Documento citado no pedido; Documento que se refere a uma divulgação oral, uso, exibição ou qualquer outro meio. Técnico examinador: Nuno Pedroso Telefone: +351 21 881 81 11 INPI, Campo das Cebolas, 1149-035 LISBOA Fax: 21 886 98 59 Assinatura Nota: Esta pesquisa refere-se aos elementos apresentados até à data da elaboração deste relatório de pesquisa. Quaisquer elementos que possam ter sido entregues posteriormente a esta data, não foram objeto de apreciação técnica. M0589.02 1/3
Relatório de Pesquisa de Portugal Ref. do pedido: 106520 UNIDADE DE INVENÇÃO O pedido não está de acordo com os requisitos de unidade de invenção (art. 71º) e foram encontradas as seguintes invenções: 1. reivindicações nºs 1-6 2. reivindicações nºs 7, 18-20 3. reivindicações nºs 8-15 4. reivindicações nºs 16, 17, 21 5. reivindicação nº22 M0589.02 2/3
Anexo ao Relatório de Pesquisa de Portugal Informação sobre os membros da família de documentos de patente Ref. do pedido: 106520 Documento de patente citado no relatório Data de publicação Membro(s) da família WO2007073945A1 2007.05.07 CA2631839 AU2006331045 AU2006331045B AR056858 KR20080079288 NO20083300 EP1971219 EA200801605 EA016260 US2008317904 CN101351123 CN101351123B ZA200805030 JP2009521914 NZ568978 BRPI0620656 HK1128202 Data de publicação 2007.07.05 2007.07.05 2011.11.24 2007.10.24 2008.08.29 2008.09.22 2008.09.24 2008.10.30 2012.03.30 2008.12.25 2009.01.21 2013.02.13 2009.03.25 2009.06.11 2011.09.30 2011.11.22 2013.10.11 M0589.02 3/3