Universidade Federal de Goiás Programa de Pós-Graduação Instituto de Química Seminário de Microfluídica HPLC-CHIP-MS aplicado a análise de esteróides Msc. Kelly da Silva Bezerra Goiânia 2013
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3 Esteróides Derivados do anel tetracíclico ciclopentanoperidrofenantreno
São sintetizados a partir do colesterol, na mitocôndria e retículo endoplasmático liso de células do córtex adrenal, gónadas, e pela placenta, através de uma série de reações enzimáticas, principalmente, nas glândulas supra-renais. 4
5 Glicocorticóides mineralocorticóides sexuais (andrógenos e estrógenos) vitamina D Estão envolvidos no regulamento de várias vias metabólicas: funções de reprodução, metabolismo energético, equilíbrio de água e sal funções comportamentais e cognitivas. Seus efeitos positivos sobre a força muscular e ações anabolizantes, servem como agentes dopantes.
6 As concentrações de muitos esteróides pode variar consideravelmente durante as diferentes fases da vida, incluindo a idade, estágio da gravidez, ciclo menstrual, doenças e tratamentos com drogas diversas. A determinação quantitativa desses componentes é um instrumento valioso, por exemplo, em estudos clínicos, diagnóstico de doenças endócrinas e controle de doping. No entanto, a análise de esteróides em amostras biológicas é um desafio devido à complexidade das matrizes biológicas e as concentrações baixas dos mesmos. Uma abordagem que permite a detecção e quantificação de esteróides e seus metabólitos em concentrações biologicamente relevantes aumentará o estudo desses compostos e ajudará a entender melhor as múltiplas funções biológicas em que estão envolvidos.
7 ANÁLISE DE ESTERÓIDES Imunoensaios: são geralmente rápidos e sensíveis, mas a reatividade cruzada com os compostos estruturalmente relacionados, bem como efeitos de matriz muitas vezes compromete a sensibilidade, especificidade e precisão do método.
8 ANÁLISE DE ESTERÓIDES Cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa (GC-MS): muitas vezes requer procedimentos de pré-tratamento de amostras complexas incluindo a hidrólise dos esteróides conjugados e derivatização. Além disso, o processo de ionização conduz a uma fragmentação extensa de esteróides diminuindo a especificidade do método. O processo de derivatização oferece maior termoestabilidade, polaridade mais baixa e pico bem definido. Amostras com grupos funcionais hidroxila, ácido carboxílico, amina, fosfato e tiol, passam pelo processo de derivatização.
9 ANÁLISE DE ESTERÓIDES HPLC-MS tem sido cada vez mais utilizado para a análise quantitativa de esteróides livres e conjugados a partir de fluidos biológicos, com o desenvolvimento de diversos métodos. A ionização por ESI, APCI e APPI têm sido aplicada a análise de esteróides. Embora estas técnicas de ionização possam proporcionar alta eficiência, sua sensibilidade pode ser melhorada através da derivatização dos mesmos.
10 HPLC-Chip/MS A microfluídica combina fluidos, transportes térmicos, mecânicos, eletrônicos e ópticos com química, termodinâmica, biologia e reações cinéticas.
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12 ELETROFORESE E MASSAS Eletroforese é utilizado para separar, quantificar, enriquecer e purificar biomoléculas que diferem na sua carga eléctrica ou polaridade Espectrometria de massas é utilizada para identificar, quantificar e elucidar estruturas de compostos com alta especificidade e confiabilidade
. 13 Em CE-MS, o circuito elétrico envolvido na separação eletroforética, a baixa velocidade do fluxo eletrosmótico e a natureza do eletrólito de separação são parâmetros importantes para o acoplamento dessas técnicas. As três configurações comumente utilizadas para o acoplamento entre CE e MS são: com líquido auxiliar coaxial (coaxial sheath liquid); com junção líquida (liquid junction); sem líquido auxiliar (sheathless ou nanospray).
14 Esta interface é, conceitualmente, a mais simples e a mais adequada porém, experimentalmente, é a mais difícil para o acoplamento CE-ESI-MS. A maior dificuldade experimental é manter simultaneamente os circuitos elétricos de CE e ESI. deposição de um filme fino de material condutor na extremidade do capilar Limitações: tempo curto de vida; a montagem delicada da interface; necessidade de recobrimentos de ótima qualidade para o funcionamento adequado; formação de espécies químicas em decorrência de reações eletroquímicas nesta superfície. Os limites de detecção atingidos com essa técnica são os mais baixos dentre as interfaces disponíveis, porque não ocorre diluição do efluente eletroforético com o líquido auxiliar. A estabilidade do spray é auxiliada
15 HPLC E SISTEMAS NANO Nanofluxo combina alta resolução cromatografia e elevada sensibilidade, devido ao pequeno diâmetro interno da coluna e fluxo baixo na análise. Utilizando uma coluna de enriquecimento antes da nano-coluna serve para concentrar a amostra e permite que o carregamento da amostra.
16 O sistema consiste: bomba de HPLC binária ligado a uma coluna por união T usada para dividir o fluxo entre CE e nanosplitter, respectivamente.
17 Em cromatografia de nanofluxo pode ocorrer dispersão de picos originados da ligação dos capilares e acessórios. Em um sistema convencional de nanospray a contribuição relativa de todos os volumes conectados ao capilar podem atingir até 45% do volume do pico, causando grande dispersão e alargamento. Nanospray também pode gerar o entupimento ou vazamento de colunas e agulhas, sendo um agravante para a técnica.
A pequena quantidade de amostra efetivamente consumida por estes estudos sugerem que nano-lc/ms, em conjunto com nano-esi, pode aumentar ainda mais a sensibilidade e eliminar efeitos de matriz 18
19 Os dispositivos microfluídicos são circuitos de minúsculos canais fechados e poços, gravados em um corpo de plástico ou microchip. Forças de pressão ou eletrocinéticas empurram pequenos volumes de fluidos através de caminhos selecionados de forma controlada. Estes podem incluir elementos, tais como bombas, válvulas, câmaras de mistura e de reação e canais de separação. A tecnologia elimina 50% dos acessórios e ligações tradicionais tipicamente requeridas num sistema nanofluxo, reduzindo drasticamente a possibilidade de vazamentos no sistema.
O HPLC-Chip integra a preparação e separação de analitos através de um único chip o qual contém uma ponta de eletrospray. Ele também inclui um pulverizador que interage de forma eficiente com o espectrômetro de massas, permitindo que compostos separados, tais como esteróides, possam ser identificados e quantificados. 20
A peça central é um micro chip de polímero reutilizável. Integra o enriquecimento das amostras e de colunas de separação com as conexões e ponta de pulverização utilizada em espectrometria de massa diretamente sobre o chip de polímero. 21
22 O HPLC-chip cube com interface MS contém: mecanismo de carregamento para posicionamento do chip; microválvula para nano-lc; conexões hidráulicas e comutação de fluxo; fonte de nanospray com câmera para visualização do spray. Posiciona automaticamente e precisamente o chip com a ponta de pulverização ortogonal à entrada MS para assegurar o máximo de sensibilidade e robustez, e faz todas as conexões elétricas e hidráulicas necessárias com o chip. É possível especificar um chip para cada tipo de aplicação, devido a facilidade de manuseio do sistema, reduzindo o risco de contaminação cruzada.
Configurando a bomba de carregamento e de análise e especificando o volume entre o auto-amostrador e a coluna de enriquecimento (volume de descarga de injeção) é possível calcular automaticamente o tempo necessário para eficazmente carregar a amostra. No tempo finalizado a microválvula muda automaticamente do modo de enriquecimento para modo de análise e o gradiente de bomba começa a funcionar. 23
24 Processo de fabricação HPLC-Chip: A ablação a laser do filme de poliimida é usado para criar estruturas de superfície necessária para o layout do HPLC-Chip. 1) O laser cria as microestruturas diretamente sobre a superfície de poliimida. 2) A superfície é limpa. 3) Uma ou várias camadas de poliimida contendo características diferentes, tais como colunas analíticas, filtros e orifícios de acesso de fluidos, são laminadas em conjunto. 4) O chip é recortado e a ponta do eletrospray é inserida diretamente no chip por ablação a laser. 5) No passo final a superfície é metalizada para alta tensão de eletrospray.
25 Estruturas de superfície necessária para HPLC-Chip: 1) Ablação a laser da ponta de pulverização 2) Coluna enriquecimento 3) Coluna analítica com material de embalagem 4) Canais integrados 5) Microfiltros. A laminação de várias camadas de poliimida em conjunto permite a criação de multi-funções nos chips. A integração de componentes reduz a complexidade e melhora a robustez.
Um chip é inserido na interface, o qual é montado sobre o espectrômetro de massas, e sua posição assegura que a ponta de eletropulverização está na posição ideal para análise de massa, quando a ficha é inserida. 26
27 A segunda geração de tecnologia de HPLC-Chip incorpora um filtro de carbono para melhorar as características de superfície, com contato ótimo e selagem, bem como a redução de fricção entre o rotor e o chip. Estas melhorias aumentam a vida útil do chip diminuindo o custo por análise, assim como melhora a reprodutibilidade do método.
A microválvula utiliza um stator fixo com rotores concêntricos para carregar os solventes e amostra para as diferentes camadas do HPLC-Chip. Cada rotor pode operar independentemente um do outro e podem girar 360. 28
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ANÁLISE EXPERIMENTAL: 30
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33 "Os cientistas devem gastar seu tempo no laboratório fazendo experimentos significativos para descoberta e análise de novos compostos importantes para o conhecimento cientifico e não em busca de vazamentos, controle de sistemas dentre outros ajustes experimentais Dr. Manfred Raida, Centro Terapêutico Experimental, Cingapura. "A introdução da tecnologia de chip de HPLC representa um salto quântico no desenvolvimento de nano-hplc. O principal benefício para o nosso laboratório tem sido o aumento significativo da produtividade já que as pessoas que não têm experiência em técnicas de separações HPLC, facilmente possam executar a técnica de análise em rotina Dr. Tasso Miliotis, Astra Zeneca, Suécia.
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35 Parte experimental Foi realizada a análise de 9 esteróides derivatizados e 8 esteróides não derivatizados no plasma de rato. Solução de Ringer foi utilizada como matriz do plasma artificial.
Amostras para as experiências com esteróides derivatizados: foram preparadas por dissolução da analitos em metanol. A curva de calibração com níveis de concentração de 0,075-75.0 nm variando em 0,75 nm, 180 nm e 40 µl com adição de 10 nm de padrão interno, foi construída. As amostras foram então derivatizadas 36
Amostras com os esteróides não derivatizados: foram preparadas por dissolução dos analitos em acetonitrila. Diluições posteriores foram realizadas com uma mistura de eluentes. Solução de Ringer com 4% (w/v) de BSA foi a matriz de plasma artificial para a preparação da curva de calibração. A curva foi construída com concentrações de 0,075 a 100,0 nm variando em 0,75 nm. 37
38 Sistema de HPLC convencional e as condições cromatográficas: - micro desgaseificador, - bomba binária em uma configuração de baixo - atraso de volume - amortecedor - misturador de bypass - amostrador automático de alto desempenho - termostato de coluna (operado a 48 C) Uma coluna Zorbax SB-C18 foi usada e ligada à fonte de ESI do espectrômetro de massas (triplo quadrupolo). A taxa de fluxo foi de 0,2 ml min -1 e o volume de injeção foi de 40 µl.
39 HPLC-Chip/MS e condições cromatográficas: - cromatógrafo líquido com bomba capilar - desgaseificador - instrumento Nanopump com desgaseificador - termostato - amostrador automático com micropoços (mantido a 4 C) - interface HPLC-Chip/MS integrado com coluna de 40 nl de enriquecimento de ZORBAX SB-C18 e coluna analítica de separação ZORBAX SB-C18 e um emissor de nanospray.
40 Na análise SRM, os íons dos produtos monitorados foram escolhidos a fim de conseguir sensibilidade e seletividade máximas. Collision energy (ev) Fragmentor voltage (ev) Compound Precursor ion (m/z) Product ion (m/z) Chip/MS LC-ESI/MS HPLC- HPLC- Chip/MS LC-ESI/MS 17-OH-PROG 361 112 35 35 190 110 17-OH-PREG 348 330 2 2 115 80 PREG 332 86 30 30 190 160 AN 317 112 30 30 190 170 d 3 -T 307 124 30 30 170 150 AND 306 255 15 20 165 160 DHT 306 81 40 35 200 200 DHEA 304 253 15 17 165 140 T 304 124 30 35 210 190 ES 286 253 10 12 160 130
O tamanho das partículas na coluna convencional foi muito menor (1,8 µm) do que na coluna analítica no HPLC-chip-MS. 41
LOD foram ligeiramente mais elevados para o sistema HPLC-Chip/MS em comparação com HPLC-MS/MS. Com ambos os sistemas, os RSDs para os tempos de retenção foram inferiores a 1,0% e inferior a 11% para as áreas de pico, indicando assim a repetibilidade cromatográfica e quantitativa. 42
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LODs foram cerca de cinco a sete vezes maior do que as determinadas para os esteróides derivatizados. Os RSDs foram inferiores a 0,5% para os tempos de retenção, e abaixo de 10% para as áreas de pico, indicando assim boa repetibilidade, comparáveis com os obtidos para os esteróides derivatizados. 44
45 8 amostras de plasma de rato do sexo feminino e 7 masculino. As concentrações de CORT foram seis vezes maior em mulheres do que em homens. Dos outros esteróides, A, T, e AN foram detectados em alguns dos indivíduos do sexo masculino, mas não nas amostras do sexo feminino. Nenhum dos compostos restantes foi detectado em todas as amostras.
46 Conclusões A sensibilidade do sistema HPLC-Chip/MS foi cerca de 50 vezes melhor do que com o sistema HPLC-MS/MS quando os limites de detecção são apresentados como valores de volume de amostra injetado, mas ligeiramente pior quando são apresentados como concentrações na amostra. A utilização do sistema de HPLC-Chip/MS é vantajosa quando o volume de amostra é limitado, o que é frequentemente o caso na análise de amostras biológicas. O sistema integrado HPLC-Chip/MS é muito mais fácil de usar que o sistema HPLC-MS/MS. Ambos os métodos mostraram boa linearidade e repetibilidade quantitativa. A resolução dos picos no sistema HPLC-Chip/MS foi pior do que o HPLC-MS/MS, no entanto, esta comparação não pode ser generalizada, devido às diferenças nos tamanhos de partículas das colunas. Ao comparar a análise de esteroides derivatizados e esteróides não derivatizados usando o sistema HPLC-Chip/MS, os resultados mostraram que a sensibilidade com derivatizados é de aproximadamente uma ordem de magnitude maior do que com os não derivatizados.
REFERÊNCIAS 47
48 OBRIGADA PELA ATENÇÃO?