CRIOPRESERVAÇÃO DE SÊMEN SUÍNO: ALTERNATIVAS PARA OTIMIZAÇÃO DA TÉCNICA

CRIOPRESERVAÇÃO DE SÊMEN SUÍNO: ALTERNATIVAS PARA OTIMIZAÇÃO DA TÉCNICA (Boar sperm cryopreservation: alternatives for optimization of the technique) Tainã Figueiredo CARDOSO 1 ; Antonio Sergio VARELA JUNIOR 2 ; Estela Fernandes e SILVA 1 ; Stela Mari MeneghelloGHELLER 3 ; Alessandra Cardoso da SILVA 3 ; Carine DahlCORCINI 4* 1. Programa de Pós-Graduação em Ciências Fisiológicas: Fisiologia Animal Comparada. Universidade Federal do Rio Grande. 2. Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Rio Grande. 3. Programa de Pós-Graduação em Veterinária. Faculdade de Veterinária. Universidade Federal de Pelotas. 4. ReproPEL, Faculdade de Veterinária, Departamento de Patologia Animal, Universidade Federal de Pelotas. RESUMO A criopreservação de sêmen suíno enfrenta muitos obstáculos, que compreendem desde a característica do espermatozoide até o conhecimento da metodologia mais adequada. Devido a isso, apenas 1% das inseminações artificiais feitas no mundo utilizam sêmen congelado. Nas últimas décadas muitas adaptações de protocolos utilizados na criopreservação de sêmen de outras espécies de mamíferos vêm sendo empregadas. Contudo sua taxa de sucesso ainda não alcançou os níveis necessários para seu em granjas comerciais. Atualmente, estudos que buscam marcadores genéticos e protéicos de criosensibilidade, bem como estudos voltados para explicar a biologia celular do espermatozoide suíno vêm apontando possíveis caminhos a serem seguidos. Desta forma, espera-se que estes estudos auxiliem na busca da melhor forma de congelamento e de crioprotetores mais adequados trazendo soluções promissoras para o sucesso da técnica. Palavras-chave: Crioprotetores, marcadores de congelabilidade, adaptações. ABSTRACT Cryopreservation of boar semen faces many obstacles, which range from the characteristic of sperm until the knowledge of the most appropriate methodology. Because of this, only 1% of artificial inseminations done in the world using frozen semen. In recent decades many adaptations based in protocols semen cryopreservation in other mammalian species has been used. But their success rate has not yet reached the required levels for your on commercial farms. Currently, studies that seek genetic and protein markers of cryosensibility as well as studies aimed at explaining the boar sperm cell biology are bringing some ways to be followed. Thus, it is expected that these studies will help in finding the best way of freezing and most suitable cryoprotectants bringing promising solutions for the success of the technique. Keywords: Cryoprotectants, freezability markers, adaptations. * Endereçoparacorrespondência: Universidade Federal de Pelotas (UFPel) Campus Capão do Leão s/n, Pelotas/RS. E-mail: corcinicd@gmail.com

INTRODUÇÃO Vêm sendo desenvolvidas muitas pesquisas buscando melhores resultados na taxa de parição e nascidos vivos com a utilização de sêmen suíno congelado. No intuito de aumentar a disponibilidade da técnica, promover disseminação de genes desejáveis, manutenção de bancos de germoplasma, controle da transmissão de patógenos propiciando um estado sanitário adequado do rebanho e aumentando substancial a qualidade na produção, visando atender a demanda crescente e necessária de proteína animal a baixo custo (FAO, 2012). Atualmente o uso da IA com sêmen suíno criopreservado representa apenas 1% do sêmen utilizado mundialmente, isto porque o sêmen suíno congelado requer de duas a três vezes mais espermatozoides por dose, sendo um processamento seminal trabalhoso, cujo resultado é um tamanho de leitegada reduzido em um a três leitões por parto, além da redução das taxas de parição (Romero et al., 2004). Esses fatores juntos inviabilizam economicamente seu uso em sistemas de produção, quando comparado com sêmen acondicionado na forma refrigerada (Erikssonet al., 2001; Roca et al., 2003; Saravia et al., 2005). A biotécnica de criopreservação compreende todo o processo de manipulação do ejaculado: coleta, diluição, resfriamento, crioproteção, congelamento, armazenamento a - 196 C e descongelamento(hammerstedt et al., 1990). A diminuição da fertilidade é resultado de um conjunto de danos que ocorrem durante cada um destes processos, os quais em conjunto levam a uma redução da capacidade funcional dos espermatozoides ou até mesmo a morte celular (Watson, 1996; Watson, 2000). Desta forma, nos objetivamosfazer uma revisão dos métodos que são utilizados para a criopreservação de sêmen suíno, assim como possíveis substâncias e procedimentos alternativos que podem ser utilizados para otimizar os resultados. QUAIS MOTIVOS LEVAM A RESULTADOS INSATISFATÓRIOS NA CRIOPRESERVAÇAO DE SÊMEN SUÍNO? Para que a criopreservação de sêmen suíno seja bem sucedida se faz necessário a manutenção de uma população viável de espermatozoides que possuam a integridade da membrana plasmática estruturalmente e funcionalmente intactas (Johnson et al., 2000). O dano induzido pelo processo de criopreservação é dependente de muitos fatores: Composição do diluente; Protocolos de congelamento; Variabilidade individual (Fraser et al., 2007; Ringwelski et al., 2013).Assim a criopreservação está associada com as alterações celulares e bioquímicas nos espermatozoides, resultando na diminuição da capacidade de fertilização (Johnson et al., 2000; Rath et al., 2009). Um dos principais fatores que interferem no processo de congelamento são as particularidades da membrana do espermatozoide suíno. A membrana plasmática do gameta masculino de suínos possui uma menor porcentagem de colesterol, distribuídas principalmente na monocamada interna (Watson, 1995), bem como uma grande concentração de ácidos graxos insaturados (Cerolini et al., 2000). Essas características contribuem para uma maior criosensibilidade, levando a redução da motilidade e danos funcionais de membrana e acrossomapós descongelamento (Saraviaet al., 2005), Isto ocorre devido a magnificação do estresse oxidativo durante o congelamento,produzido pelo aumento da produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) e baixa capacidade antioxidante do plasma seminal suíno(brezezinskaet al., 1995). As criolesões celulares, em parte,são causadas pela desi/reidratação celular 4

(circulação de água através das membranas celulares) e/ou pelo contato direto com os cristais de gelo intra e extracelulares (Mazur, 1984; Muldrew& Mc Gann, 1990).Isto pode ser atribuído a diminuição na proporção entre ácidos graxos poliinsaturado se colesterol (Chanapiwat et al., 2009). Além disso, a criopreservação pode ser deletéria para a mobilidade do espermatozoide para a integridade da estrutura do DNA (Yeste et al., 2013). Assim como em outras espécies, o sêmen suíno criopreservado continua sendo bastante estudado, contudo, sua utilização tem sido limitada a protocolos de melhoramento genético e enriquecimento de bancos de germoplasma (Fernandez-Gago et al., 2013), visto que a técnica ainda possui muitas variações de resultados entre raças, indivíduos e até mesmo, entre ejaculados de um mesmo indivíduo (Corcini et al., 2012). Essa divergência pode ser justificada devido a um fundo genético, o qual pode influenciar na expressão de proteínas e lipídeos celulares, ou ainda influir na composição do plasma seminal ou funcionalidade das glândulas acessórias (Holt, 2005). METOLOGIA UTILIZADA PARA CRIOPRESERVAÇÃO E POSSÍVEIS ALTERNATIVAS O processo de criopreservação sofre influência de muitos fatores de manejo e estacionalidade (Barranco et al., 2013; Zasiadczyk et al., 2015), além da criosensibilidade inerentes do próprio macho e ejaculado(saraiva et al., 2009). Até mesmo as distintas porções de um mesmo ejaculado intervêm no sucesso da técnica, a fração rica de um ejaculado (primeiros 10mL) são mais tolerantes a criopreservação (Alkmin et al. 2014). Essa maior tolerância seria atribuída aos efeitos de proteínas do plasma seminal, como a prostaglandina sintase, com peso molecular de 10,56 kda e outras com 18, 19, 44, 65, 80 e 100 kda, como relatado por Siqueira et al (2011) e Corcini et al. (2012). Contudo a pré-incubação com o plasma seminal ainda é bastante controversa, visto que alguns autores relatam efeito prejudicial do plasma seminal, especialmente em espermatozoides armazenados por pelo menos 6h antes da criopreservação (Moore et al., 2005)ou para machos considerados como maus congeladores (Okazakiet al., 2009), já outros autores defendem a incubação por 24 horas (Alkmin et al.,2014). Uma outra alternativa, seria um tratamento de estresse sub-letal à temperatura ambiente, précriopreservação, com uma pressão hidrostática de 40 MPa por 80 min, como descrito por Horváth et al. (2014), a qual aumentou a motilidade dos espermatozoides in vitro e melhorou o desempenho reprodutivo in vivo sem afetar adversamente a saúde dos leitões. A centrifugação é um passo necessário antes do congelamento, o que facilita a remoção do plasma seminal e concentra o esperma para a ressuspensão subsequente, com o meio de congelamento (Carvajal et al., 2004).Os principais problemas causados pela centrifugação são as perdas de espermatozoide após a remoção do sobrenadante (Katkov&Mazur, 1998) e aos danos estruturais causados aos espermatozoides (Alvarez et al., 1993). Estudos têm demonstrado que a força de alta rotação (2400 g) e um curto tempo de centrifugação (3 minutos) promove a recuperação e a alta sobrevivência do espermatozoide, com um efeito positivo na criopreservação. Além disso, este tempo curto de centrifugação com uma força G relativamente alta foi o mais recomendado para minimizar os danos ao espermatozoide suíno e preservar a qualidade espermática pós-descongelamento (Zhang et al., 2012). As injúrias causadas pela centrifugação são atribuídas a perda da funcionalidade das membranas dos espermatozoides (Alvarez et 5

al., 1993) e indiretamente aos danos provocados pela formação excessiva de EROs (Mortimer, 1991). Essas altas concentrações de EROs estão associadas aos danos da membrana plasmática através da peroxidação lipídica, o qual pode alterar a função espermática, induzindo à perda de motilidade e qualidade celular, consequentemente, reduzindo a fertilidade (Shekarriz et al., 1995). Quanto mais intensa e longa for a peletização, maior será a produção de EROs e, desta forma, mais danos aos espermatozoides (Katkov e Mazur, 1998), sendo que a exposição intensa ao EROs tem maior influência nos danos celulares quando em comparação às altas acelerações durante a centrifugação. O uso de centrifugações, usando adjuvantes como Androcoll P, seria capaz de promover um aumento da qualidade e habilidade de criosobrevivência, pois diminui os danos ocasionados de EROs e a indução de danos no DNA (Martinez-Alborcia, et al., 2013). A diálise, a qual remove os componentes com baixo peso molecular (metabólitos e íons livres) que poderiam provocar um efeito negativo em relação a função espermática sem promover a perda de proteínas presentes no plasma seminal que promovem melhor sustentação ao processo de criopreservação, mas atualmente este processo de diálise ainda é pouco realizado (Fraser et al., 2007). Outro fator é a concentração de espermatozoides criopreservados, podem interferir no sucesso do congelamento sendo indicado 2.0 10 9 células/ml para otimização das taxas de prenhes e tamanho da leitegada (Knox et al.,2014) Durante o processo de criopreservação o sêmen deve passar pela etapa de refrigeração, no qual passa da temperatura corpórea para temperatura de 5 0 C (Keith, 1998), nessa etapa se iniciam as alterações na membrana plasmática passando do estado de fluidez para o estado de gel (Medeiros, 2002).O choque térmico induz danos irreversíveis no espermatozoide, caracterizado por um padrão de movimento anormal (movimento circular ou retrógrado), rápida perda de motilidade, lesões ao acrossoma, danos à membrana plasmática, redução da atividade metabólica e perda dos componentes intracelulares (Graham, 1996). A curva de congelamento ideal deve ser lenta o suficiente para evitar o congelamento da água intracelular, promovendo a desidratação das células e rápida para evitar o contato demasiado da célula com o meio hiperosmótico (Medeiros, 2002). A desidratação celular é um evento desejável, pois reduz a probabilidade de formar grandes cristais de gelo dentro da célula, o que ocasionaria danos às estruturas internas e/ou à membrana plasmática (Squires,1999). No espaço extracelular também há formação de microcristais de gelo criando um gradiente osmótico entre a solução intracelular e extracelular que se encontra hipertônica. Quando o processo de desidratação não é adequado ocorre a formação de cristais de gelo intracelular tornando a célula osmoticamente inativas, devido à perda da integridade da membrana (Devireddy et al., 2002). Diversas modificações já foram realizadas na curva de congelamento, o arrefecimento de - 30ºC/min reduz os danos tóxicos dos crioprotetores penetrantes(ex. Glicerol, Dimetilacetamida, Metilformamida entre outros). Segundo estudo realizado por Baishyaet al. (2014) demonstrou que os métodos de criopreservação que adotam taxa de arrefecimento controladas a partir de 5ºC resultam em melhoras nas características espermáticas. A curva de descongelação esta diretamente ligada a curva de congelamento, pois o gelo extracelular descongela lentamente, diluirá lentamente o soluto das frações de água não congeladas, o que permite que a água se difunda lentamente para dentro da célula, diluindo o soluto intracelular até atingir a 6

concentração inicial. Se o espermatozoide é descongelado rapidamente, o gelo derrete rapidamente, diluindo o soluto do meio e a água entrará muito rapidamente na célula, o qual se encontra altamente concentrada, danificando o espermatozoide (Graham, 1996).Para o descongelamento das amostras, uma velocidade de 70 C durante 8 s foi capaz de promover uma melhor viabilidade e cinética espermática quando comparada com as amostras que foram descongeladas a 37 C durante 20 s (Tomás et al., 2014; Knox et al., 2015) Desta forma fica evidente que modificações em protocolos de congelamento/descongelamento são necessárias para trazer novas perspectivas, bem como o uso de curvas controladas, podendo estas serem mais adequados para minimizar lesões espermáticas (Shiomi et al., 2015) USO DE DILUENTES PARA RESFRIAMENTO E CONGELAMENTO Os crioprotetores devem ser adicionados ao diluente para que haja proteção ao espermatozoide durante o congelamento/descongelamento (Squires et al., 1999). Estas substâncias são importantes para evitar a formação de gelo intracelular, reduzir o estresse osmótico através da reposição de água necessária para manutenção do volume celular, interagir com íons e macromoléculas, reduzir o ponto de congelação da água, assim como servir como tampão ajustando as alterações do ph (Medeiros, 2002). O diluente base do resfriamento e congelamento de sêmen suíno é composto por: 80 ml de uma solução de lactose a 11% e 20 ml de gema de ovo. Logo após a coleta o ejaculado suíno é diluído e resfriado até a temperatura de 5 C, e posteriormente redilui-se com um diluente base acrescido de crioprotetor penetrante (Medeiroset al., 2002). Os crioprotetores não penetrantes devem ser eficientes na proteção da célula espermática durante o processo de congelação, sem que para isso necessitem penetrar no seu interior protegendo a membrana celular por restituir os fosfolipídios perdidos pelos espermatozoides durante o choque térmico (Watson, 1995). As lipoproteínas de baixa densidade (LDL) aderem à membrana celular durante o processo de criopreservação, preservando a membrana espermática (Moussa et al., 2002), atuando na superfície da membrana plasmática, restaurando a perda de fosfolipídeos e, aparentemente, induzindo alteração transitória de sua composição, o que previne a ruptura da membrana plasmática (Farstard, 1996). Os fosfolipídeos que compõe a fração LDL da gema de ovo protegem os espermatozoides durante o processo de refrigeração (5ºC). No entanto, por ser a gema de ovo produto de origem animal, é propensa a uma variação em sua composição dependente do animal, origem e nutrição(houpalathi et al., 2007). Muitos estudos buscam o preparo de meios quimicamente definidos para sua substituição, a exemplo das lecitinas de soja (Hiwasa et al., 2009), trealose e glicina (Valente et al., 2010) ou ainda da própria lipoproteína de baixa densidade purificada (Jiang et al., 2007), contudo nenhum dos materiais testados demonstrou melhores resultados do que o obtido com a gema de ovo. A lactose é o açúcar mais utilizado para criopreservação de sêmen suíno, devido aos bons resultados relatados (Eriksson et al., 2000; Sancho et al., 2007). No entanto, outros estudos mostram que dissacarídeos de forma geral, que incorporam glicose na sua composição (lactose, sacarose, trealose e melobiose) têm melhor ação crioprotetora do que monossacarídeos (glucose e frutose) (Eriksson et al., 2000; Malo et al., 2010), evidenciando que esses tipos de açucares 7

adaptam-se melhor com a célula espermática suína, mantendo a integridade estrutural e propriedades de permeabilidade das bicamadas lipídicas. Os crioprotetor espermeantes atuam através de suas propriedades coligativas, reduzindo o ponto de congelamento intracelular. Desta forma, maior quantidade de líquido intracelular, quando submetida à baixa temperatura, vai permanecer no estado liquido ou gel, proporcionando um ambiente menos deletério à célula espermática durante a congelação (Watson, 1995). Deste grupo o glicerol é o mais utilizado, desidratando e reduzindo o ponto crioscópio do interior das células, dificultando a formação de cristais de gelo intracelular (Watson, 1995). O glicerol é utilizado em concentrações baixas (inferiores a 4%), pois apresenta toxicidade ao ser metabolizado como fonte de açúcar pela célula, sendo responsável pela produção de metilglioxal, por exemplo - mediador da ativação de fosfolipases e proteases provocando danos irreversíveis na célula (Ar et al., 1992), desnaturação das proteínas, alteração nas interações de actina, nos eventos citoplasmáticos devido ao aumento da viscosidade pelo glicerol intracelular, na polimerização da tubulina, na associação de microtúbulos atuando diretamente na membrana plasmática, além de alterações no glicocálix e nas proteínas da superfície celular (Alvarenga et al., 2000). Em estudos realizados por Bianchi et al. 2008 testou a substituição de glicerol em uma concentração de 3%, por dimetilacetamida e dimetilformamida a 5%, que estes ao descongelamento apresentaram taxas de motilidade espermática e integridade de membrana superiores as amostras adicionadas de glicerol. Além disso, Bilodeau et al. (2000) sugeriram que um fator importante para a sobrevivência e funcionalidade da célula espermática seria uma baixa produção de EROs. Desta forma, muitas pesquisas têm se voltado a investigar a ação de antioxidantes sintéticos como a glutationa, ácido ascórbicoe L-cisteína e ação de antioxidantes naturais como ácido rosmaínico, flavonóides e polifenóis, extrato de Rhodiola, dentro outros, objetivando o balanço entre a quantidade deeros e quantidade de antioxidantes da própria célula ou do plasma (Quadro1). Quadro 1. Incremento de diferentes crioprotetores na criopreservação de sêmen suíno. Composto Incremento Referência Glicerol 2% e 3% Melhora nos efeitos anti- apoptóticos Zeng et al., 2014 105 µmde Ácido Incremento na função espermática e na capacidade Luño et al., Rosmarínico fertilizante α-tocopherol Melhora na motilidade espermática, função e integridade de membrana, e diminuição da indução da capacitação. 0.4 mg/ml de Miltiorrhiza Salvia Diminuição do dano peroxidativo, aumento da motilidade e tamanho da leitegada 2014 Satorreet 2012 al., Shen et al., 2015 100 mmtrealose não penetrante Aumento na motilidade e viabilidade espermática, integridade de acrossoma e penetraçãoin vitro Athurupana al., 2015 et Estudo com diferentes Aumento da estabilidade da cromatina, e da taxa de García et al., dissacarídeos fertilização por ICSI 2014 Glutationa reduzida e ácido ascórbico Melhoria na viabilidade e motilidade espermática Giaretta et al., 2015 Butil-hidroxitolueno Aumenta da habilidade fertilizante in vivo Trzcińskaet al., 2015 8

Neste contexto, se faz necessário a continuação de estudos que visem à melhora na qualidade seminal de ejaculados suínos criopreservados bem como uniformizar protocolos e curvas de resfriamento, congelamento e descongelamento, para que assim não se tenha mais perdas de índices de fertilidade e taxas de parição, e que desta forma possa se tornar uma técnica competitiva e viável como o que se tem hoje com as IA utilizando sêmen resfriado. AVANÇOS NOS CONHECIMENTOS GENÔMICOS Os conhecimentos zootécnicos e da fisiologia reprodutiva trouxeram grandes avanços nos últimos anos. Contudo a inseminação artificial com sêmen congelado ainda não é uma realidade no âmbito da produção. Devido à grande divergência entre os resultados obtidos no campo da criopreservação de sêmen suíno, estudos de base genética para fomentar a qualidade do espermatozoide e da fertilidade de suínos, envolvem técnicas de genômica e proteômica. Muitas das características preconizadas, incluindo a eficiência reprodutiva, são complexas e influenciadas por inúmeros fatores, sejam eles genéticos e/ou ambientais (Becker et al., 2013). Contudo muitas delas, como a qualidade do espermatozoide possuem um componente genético claro com herdabilidade entre 0,17 e 0,19 (Strathe et al., 2013). Montjean et al. (2012) e Feugang et al. (2010), já demonstraram diferenças no transcriptoma de espermatozoides de mamíferos, associando à fertilidade e a qualidade de sêmen. Em suínos, o processo de criopreservação pode levar a uma expressão diferencial de micro RNAs (mirna) e RNA mensageiros. Zang et al. (2015) identificou que seria possível utilizar a expressão dos mirnassc-mir-186, sscmir-23a, e ssc-mir-27a, enquanto Zeng (2014) identificou os genes GAPDH, RPL4 e PPIA, como prováveis genes estáveis a serem utilizados como referência em estudos de RT-PCR, facilitando a exploração dos mecanismos anticongelantes ou de criolesão que ocorrem durante a criopreservação. Além disso, mudanças na expressão de genes relacionados a processos epigênicos foram observados em espermatozoides suínos submetidos a criopreservação. Os genes Dnmt3a, Dnmt3b, Kat8, Prm1, Prm2 tiveram sua expressão diminuída pelo processo de criopreservação. Sendo também, a expressão de Dnmt3aestá correlacionada de forma negativa com a motilidade pósdescongelamento. No estudo realizado por Zeng et al., (2014) ficou evidente que a expressão de Prm1, Prm2 e KAT8 é diminuída com a utilização de crioprotetores como 3% de glicerol, trealose e glutationa. Outra abordagem é encontrar marcadores de congelabilidade em sêmen suíno, a qual consiste em identificar proteínas relevantes que podem prever o criotolerância de ejaculados antes de iniciar procedimentos de criopreservação. Vilagran et al. (2014), identificou que a proteína VDAC2 (Voltage- Dependent Anion Channel 2), pode ser utilizada para prever a congelabilidade de um determinado ejaculado. Outras proteínas do plasma seminal, como os níveis de FN1 (Vilagran et al., 2015) e a presença das proteínas AQN-3, AQN-1 e AWN (Vadnais et al., 2010), as quais fazem parte de famílias de espermadesinas, também podem ser capazes de inibir alguns efeitos prejudiciais da criopreservação. Assim, análises da expressão gênica, pode permitir uma abordagem mais profunda sobre fatores que estão influenciando sobre a célula espermática durante a criopreservação e descongelamento, e quais compostos, atuam de forma efetiva sobre isto. 9

CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS Comparado com outras espécies de mamíferos, a criopreservação do espermatozoide suíno, apresenta uma baixa taxa de sucesso quando comparada com a estocagem das amostras seminais a 15-18 ºC, isso é justificado pela alta sensibilidade ao choque térmico, devido a características da própria célula. Estudos da fisiologia básica da célula, integrando conhecimentos da biologia celular e biologia molecular, bem como estudos dirigidos, buscando otimizar a técnica, podem apontar quais crioprotetores, diluentes e adaptações nas metodologias podem ser utilizadas de forma promissora. AGRADECIMENTO Alessandra Cardoso e Stela Gheller são bolsista Capes. C.D. Corcini é bolsista de produtividade do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) processo número 306356/2014-7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ALKMIN, D.V.; PEREZ-PATIÑO, C.; BARRANCO, I.; PARRILLA, I.; VAZQUEZ, J.M.; MARTINEZ, E.A.; RODRIGUEZ-MARTINEZ, H.; ROCA, J. Boarspermcryosurvivalisbetterafterexposuret o seminal plasma fromselectedfractionsthantothosefromentireej aculate, Cryobiology, v. 69, n.2, p:203-210. 2014. ALVARENGA, M.A.; GRAHAM, J.K.; KEITH, S. L.; LANDIM-ALVARENGA, F.C. Squires, S.L. Alternative cryoprotectors for freezing stallion spermatozoa. International Congress on Animal Reproduction and Artificial Insemination, v. 14, p.157, 2000. ALVAREZ, J.G.; LASSO, J.L.; BLASCO, L.; NUNEZ, R.C.; HEYNER, S.; CABALLERO, P.; STOREY, B.T. Centrifugation of human spermatozoa induces sublethal damage; separation of human spermatozoa from seminal plasma by a dextran swim-up procedure without centrifugation extends their motile life. Human Reproduction, v.8, p.1087-1092, 1993. ATHURUPANA, R.; TAKAHASH,I D.; IOKI, S.; FUNAHASHI, H. Trehalose in glycerol-free freezing extender enhances post-thaw survival of boar spermatozoa. Journal of Reproduction and Development, 2015. BAISHYA, S.K.; BISWAS, R.K.; KADIRVEL, G.; DEKA, B.C.; KUMAR, SINHA, S.; DUTTA, D.J.; SAIKIA, G.K. Effect of conventional and controlled freezing method on the post thaw characteristics of boar spermatozoa, Animal Reproduction Science, v. 149, n. 3 4, p:231-237, 2014. BARRANCO, I.; ORTEGA, M.D.; MARTINEZ-ALBORCIA, M.J.; VAZQUEZ, J.M.; MARTINEZ, E.A.; ROCA, J. Season of ejaculate collection influences the freezability of boar spermatozoa, Cryobiology, v. 67, n. 3, p:299-304. 2013. BECKER, D.; WIMMERS, K.; LUTHER, H.; HOFER, A.; LEEB, T. A genome-wide association study to detect QTL for commercially important traits in Swiss Large White boars. PLoS One. v. 8, n. 2, 2013. BIANCHI, I.; CALDERAM, K.; MASCHIO, É.F.; MADEIRA, E.M.; DA ROSA ULGUIM, R.; CORCINI, C.D.; BONGALHARDO, D.C.; CORRÊA, E.K.; LUCIA, T JR.; DESCHAMPS, J.C.; CORRÊA, M.N. Evaluation of amides and centrifugation temperature in boar semen cryopreservation. Theriogenology; v. 69, n.5, p: 632-638. 2008. BILODEAU, J.F.; SUVRO-CHATTERJEE, SIRARD M.A. Levels of antioxidant defenses are decrease in bovine spermatozoa 10

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