BRUNA DE VITA BIOTECNOLOGIA E INSEMINAÇÃO ARTIFICIAL COM SÊMEN CONGELADO EQÜINO

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1 BRUNA DE VITA BIOTECNOLOGIA E INSEMINAÇÃO ARTIFICIAL COM SÊMEN CONGELADO EQÜINO Monografia apresentada à disciplina seminário em Reprodução Animal I do programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária, Área de Reprodução Animal, Curso de Mestrado, da Faculdade de medicina Veterinária e Zootecnia da UNESP Campus de Botucatu Docentes responsáveis: Prof. Adj. Sony Dimas Bicudo Prof a. Adj. Maria Denise Lopes Botucatu SP 2006

2 Resumo DE VITA, B. Biotecnologia e Inseminação Artificial com Sêmen Congelado Eqüino. Botucatu, Monografia apresentada à disciplina de Seminários em Reprodução Animal I do programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária, Curso de Mestrado, Área de Reprodução Animal, da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da UNESP, Campus de Botucatu. A utilização de biotecnologias de reprodução animal vem gerando diversos benefícios para as diferentes espécies, dentre estas biotecnologias criopreservação de sêmen destaca-se por gerar inúmeras vantagens. Porém a utilização dessa biotecnologia na eqüideocultura defronta-se com alguns entraves. Apesar dos vários estudos realizados, os resultados da criopreservação do sêmen eqüino ainda não atingiram os níveis desejados, ou seja, aumentar a congelabilidade entre garanhões de diferentes raças. As restrições na utilização da técnica se devem, além dos baixos resultados, a problemas ligados à técnica de congelação que requer perfeição e deslocamento do material até as propriedades rurais. O objetivo mais esperado da utilização do sêmen congelado eqüino é a obtenção de altas taxas de fertilidade. Porém, a falta de padronização na metodologia para o processo da criopreservação gera uma enorme variabilidade de resultados devido ao uso de diferentes técnicas de congelação, diluidores, crioprotetores, centrifugação, dispositivos de envase, condições de estocagem e protocolos de inseminação artificial. O presente estudo tem o intuito de apresentar de forma sintética, os procedimentos e técnicas da biotecnologia de criopreservação, além dos protocolos de inseminação artificial apresentados pelos autores e seus respectivos resultados a fim de que o leitor possa ter uma melhor visualização das metodologias com melhores resultados. Palavras-chave: Eqüino; Criopreservação de Sêmen; Inseminação Artificial; Fertilidade Sumário

3 1. Introdução Revisão de Literatura Princípios da Criopreservação Danos Causados ao Espermatozóide Durante a Criopreservação Procedimentos para Criopreservação Crioprotetores Inseminação Artificial com Sêmen Congelado Considerações Finais Referências Bibliográficas...17

4 1 1) Introdução A utilização de biotecnologias de reprodução animal vem gerando diversos benefícios para as diferentes espécies. Dentre estas biotecnologias a criopreservação de sêmen se destaca por gerar inúmeras vantagens, principalmente entre os animais de produção como: diminuição de custos com aquisição de animais geneticamente superiores; armazenamento por tempo indeterminado; utilização do sêmen de animais excepcionais mesmo após a perda da capacidade reprodutiva ou morte; seguro biológico; racionalização do uso do reprodutor com aumento da relação macho/fêmea; controle de doenças venéreas e facilidade no transporte à longas distâncias. Com as inovações técnicas na congelação de sêmen eqüino, os índices de fertilidade têm melhorado muito na última década. A crescente liberação do uso desta técnica por parte das associações de criadores está impulsionando o aprimoramento desta técnica. Os resultados laboratoriais e índices de prenhez ainda são variáveis, demonstrando a necessidade do estabelecimento de uma padronização da metodologia empregada. Para isto muitos estudos têm sido feitos e muito há que se fazer quanto à eficiência de diluentes, crioprotetores, intensidade e tempo de centrifugação, envase, dispositivos de refrigeração, curvas adequadas e metodologias de inseminação artificial. Com o passar do tempo, diversos testes in vitro possibilitaram um melhor entendimento das injúrias sofridas pelos espermatozóides durante a congelação, testes de função e integridade de membrana por exemplo. Este fato somado a retomada da indústria do cavalo nos últimos anos, favorecida pela liberação da utilização das biotécnicas por diversas associações de criadores, vêm aumentando o potencial genético de nosso plantel. O plantel brasileiro é o segundo do mundo com 5,9 milhões de cabeças gerando 500 mil empregos diretos. Com o crescimento e desenvolvimento da eqüideocultura, faz-se necessário o desenvolvimento de novas biotecnologias e

5 2 padronização da metodologia de criopreservação de sêmen eqüino que garanta o sucesso da técnica. O presente estudo tem o objetivo de reunir informações, e apresentá-las de forma sintética, sobre as técnicas de criopreservação e suas etapas, além dos protocolos de inseminação com sêmen congelado para uma visualização simplificada dos procedimentos com melhores taxas de fertilidade.

6 3 1) Revisão de Literatura 2.1) Princípios da Criopreservação O processo de congelação de sêmen eqüino envolve inúmeros processos físicos e químicos que são responsáveis pela integridade e viabilidade espermática, assim como a fertilidade do sêmen congelado eqüino (GRAHAM, 1996). Quando uma suspensão celular é resfriada abaixo de 0 C, cristais de gelo extracelulares são formados, resultando em uma concentração de solutos no líquido remanescente. A facilidade de transporte de água depende da permeabilidade da membrana espermática a qualquer temperatura, determinada pela proporção superfície-volume e pelo índice de congelação. Se a célula for suficientemente permeável à água ou o índice de congelação for suficientemente baixo, a pressão permanece pequena, aumentando a concentração de solutos ao redor dos espermatozóides alternando o gradiente osmótico, resultando em desidratação à medida que a água saia da célula para se congelar no meio extracelular. Embora os cristais de gelo deformem a célula, eles não são capazes de romper a membrana plasmática e as modificações causadas são reversíveis (AMANN & PICKET, 1987; JASKO, 1994). Os espermatozóides podem sofrer danos durante a criopreservação e/ou descongelação, seja pela formação de grandes cristais de gelo intracelulares como pela concentração intracelular de solutos e modificações correlacionadas que resultam na desidração das células durante a criopreservação (PICKETT & AMANN, 1993). A perda de água e a desidratação são eventos desejáveis pois reduzem a probabilidade de se formarem grandes cristais de gelo dentro da célula que causariam danos às estruturas internas e/ou da membrana plasmática (SQUIRES et al., 1999).

7 4 A ação de crioprotetores intracelulares possibilita a congelação de espermatozóides à temperaturas mais baixas. Isto provavelmente retarda a desidratação das células e os efeitos deletérios do efeito solução (GRAHAM, 1996). Embora os crioprotetores sejam essenciais para sobrevivência dos espermatozóides no processo da congelação, eles podem também, exercer efeitos tóxicos e diminuir as taxas de fertilidade quando presentes em altas concentrações (ROSSI et al., 2003). Durante o processo de criopreservação o sêmen deve ser resfriado da temperatura corpórea (37 C) à temperatura ambiente (20 C), o que parece não causar danos às células quando estas estiverem diluídas em meio adequado (KEITH, 1998). O estresse inicial ocorre quando o espermatozóide passa da temperatura ambiente para 5 C (SQUIRES et al., 1999). Isto deve-se a fase de transição da membrana plasmática do estado líquido cristalino para a fase de gel (GRAHAM, 1996). Para que este efeito seja minimizado é necessário controlar a taxa de resfriamento entre as temperaturas 19 C e 8 C e pela adição de lipídeos e lipoproteínas ao diluente (GRAHAM, 1996), além do uso de curvas de resfriamento lentas (- 0,05 C/min), já que se esta for feita de forma inadequada os espermatozóides sofrerão alterações nos padrões normais de motilidade, danos em seu metabolismo, da membrana plasmática e do acrossoma (SQUIRES et al., 1999). Entre 5 C a 10 C, começam a se formar cristais de gelo no meio extra celular que permanece super resfriado (não cristalizado), ocorre troca de água para manter o equilíbrio entre o meio extra e intracelular ocasionando a desidratação das células. Neste ponto a curva de congelação deve ser lenta para evitar a congelação da água intracelular e rápida o suficiente para evitar o contato da célula desidratada com o meio hiperosmótico. Uma desidratação severa promove a desnaturação das macromoléculas e encolhimento excessivo da célula até ocorrer um colapso da membrana demonstrando que o uso de curvas de congelação adequadas podem minimizar estes danos (HOLT, 2000). As temperaturas de aquecimento dependem diretamente da velocidade da curva de congelação. Se a congelação foi lenta, a descongelação também deverá ser

8 5 lenta para permitir a fusão dos cristais de gelo extracelulares. A descongelação destes cristais provoca diluição dos solutos e lentamente ocorre a reidratação das células. Se o sêmen for descongelado rapidamente os cristais extracelulares descongelam-se muito rapidamente e a água invade bruscamente as células, causando ingurgitamento e danos à membrana plasmática (HOLT, 2000). Se o sêmen tiver sido congelado rapidamente, os espermatozóides não terão sofrido desidratação e, portanto conforme o gelo extracelular derreter, não haverá grande influxo de água, devendo então ser descongelado rapidamente de modo que o gelo intracelular que se formou durante a congelação não tenha tempo para recristalizar (AMANN & PICKETT, 1987).

9 6 2.2) Danos Causados aos Espermatozóides Durante a Criopreservação Embora a maior parte da literatura enfoque a congelação como a fase em que os danos ocorrem na célula espermática, os espermatozóide são passíveis de lesões físicas e estruturais durante todo o processo de criopreservação desde a colheita até o momento da inseminação artificial (GRAHAM, 1996). Os momentos e os efeitos críticos são: a adição de proteínas seminais que estimulam a motilidade no momento da colheita e diluição do sêmen; as condições de centrifugação das quais dependem a viabilidade espermática; o estresse osmótico passageiro que ocorre quando da adição de substâncias como leite, gema de ovo e o glicerol; as mudanças na membrana que ocorrem durante a refrigeração a 5 C; as mudanças osmóticas intensas que ocorrem durante a congelação, as condições da estocagem em nitrogênio líquido e as mudanças osmóticas que acontecem no processo de descongelação e da remoção ou não do glicerol antes da inseminação artificial (GRAHAM, 1996). Os danos na célula espermática podem resultar na redução da proporção de espermatozóides viáveis, assim como na capacidade funcional destes (WATSON, 2000). As lesões ocasionadas pelo processo de criopreservação têm sido atribuídas as mudanças de temperatura, formação de cristais de gelo, danos oxidativos, alterações na membrana plasmática e em seu DNA, toxicidade dos crioprotetores, assim como as alterações na concentração de soluto durante a congelação ( WATSON, 2000). Os efeitos deletérios dos crioprotetores estão relacionados a diversos fatores dentre os quais aumento da permeabilidade da membrana plasmática, indução da função da mesma além da inibição da atividade enzimática (FAHY, 1986). Os espermatozóides dos mamíferos comportam-se como um osmômero linear, ocorrendo morte celular caso haja entumecimento ou encolhimento do mesmo

10 7 submetidos a níveis superiores da tolerância osmótica espécie/especifica (BALL & VO, 2001). 2.3) Procedimentos da Criopreservação Os eventos ocorridos no processo de criopreservação envolvem a redução da temperatura, desidratação celular, congelação e descongelação. O processamento do sêmen após a colheita é similar ao processo de resfriamento a 5 C. O sêmen deve ser colhido em vagina artificial e então avaliado através dos padrões de movimento espermático para determinar a performance do ejaculado (PICKETT & AMANN, 1993). A centrifugação é uma etapa indispensável para o procedimento de congelação e tem as funções de eliminação do plasma seminal e de promover um sedimento altamente concentrado em espermatozóides. A centrifugação não é prejudicial ao sêmen e seus efeitos deletérios podem ser minimizados com a utilização de diluidores específicos para este fim e utilização de baixas forças de centrifugação (JASKO, 1994). Longos períodos de centrifugação, acima de 12 minutos, resultam em uma alta recuperação espermática, contudo predispõe as células a possíveis injúrias (DELL AQUA JR., 2000). A Centrifugação feita a 600xg por dez minutos apresentou recuperação espermática de 87% sem alterações significativas nos parâmetros espermáticos, tratando-se então, de intensidade e tempo recomendáveis (DELL AQUA JR., 2000). Após a centrifugação, o pellet de espermatozóides no fundo do tubo é ressuspendido com um diluidor de congelação em volume apropriado para a concentração e forma de acondicionamento do sêmen previamente definidos (JASKO, 1994). Quanto ao acondicionamento, bainhas de diâmetro menor proporcionam uma congelação mais uniforme e com melhores resultados, ou seja, palhetas de 0,5 e 0,25 ml mostram resultados superiores aos macrotubos (DELL AQUA JR., 2000).

11 8 A interação entre agentes crioprotetores e diluentes é um fator importante na capacidade de preservar o sêmen eqüino dos danos causados no processo de criopreservação (NEVES NETO, 2004). Segundo Melo (2005), a associação de glicerol 1% e metilformamida 4% ao diluente Botucrio, foi eficaz na manutenção da viabilidade espermática na metodologia de congelação usual e na metodologia em que o sêmen é refrigerado por 24 horas antes da congelação. Zanh (2002), comparando diferentes diluidores, observaram resultados melhores e significativos de prenhez (75/25%) quando utilizaram o meio para congelação de sêmen eqüino MP50 (PAPA et al., 2002), com a proporção de crioprotetor contendo 3% de glicerol e 2% de dimetilformamida comparado com o diluidor M9 (PAPA et al., 1998), o qual continha apenas o glicerol a 5%. Neves Neto (2004) também obteve resultados positivos na manutenção da viabilidade e fertilidade ao utilizar o MP50, bem como os diluentes BME-adaptado e FR4. Após o envase, alguns protocolos incluem um período de resfriamento do sêmen antes da congelação para que ocorra a desidratação das células espermáticas e estabilização das mesmas do efeito da centrifugação e diminuindo a ocorrência das injúrias que o choque frio pode causar (PAPA et al., 2002). Segundo Melo (2005), a metodologia de congelação de sêmen eqüino com prévia refrigeração no sistema de transporte Equitainer por 24 horas é tão eficiente quanto a convencional na manutenção dos parâmetros espermáticos. As bainhas então refrigeradas são posicionadas horizontalmente entre 3 a 6 cm do nível do nitrogênio líquido por um período de 10 a 20 minutos, antes de serem mergulhadas no mesmo (PAPA et al., 2002). O Método mais utilizado na descongelação é de 45 segundos a 50 C para bainhas de 0,5ml e 30 segundos a 37 C-40 C para bainhas de 0,5 e 0,25ml (DELL AQUA JR., et al., 2001).

12 9 2.4) Crioprotetores Segundo Squires et al. (1999) e Arruda (2000) os crioprotetores devem ser adicionados ao meio para que haja uma proteção do espermatozóide durante a criopreservação e descongelamento. Ao longo de vários anos uma gama de substâncias tem sido utilizada para fornecer proteção adequada as células espermáticas durante a criopreservação. Keith (1998), relata a existência de uma divisão básica que agrega os crioprotetores em penetrantes e não penetrantes. Os crioprotetores não penetrantes são algumas substâncias, dentre as quais lipídeos, lipoproteínas e macromoléculas eficientes na proteção dos espermatozóides durante a congelação sem que para isto necessitem penetrar nas células, incluindo-se a gema de ovo, leite, alguns açúcares e a albumina sérica bovina (Keith, 1998). Estes crioprotetores extracelulares protegem as células através de mecanismos osmóticos, promovendo um meio hipertônico que induz a saída de água das células, levando a desidratação do espermatozóide, reduzindo a probabilidade de formação de cristais de gelo no interior da célula (AMANN & PICKETT, 1987). Os crioprotetores penetrantes são substâncias que atuam tanto no meio intra como extracelular, sendo mais comumente utilizado o glicerol, etilienoglicol, dimetilsulfóxido (DMSO) e amidas (KEITH, 1998). Acredita-se que os crioprotetores intracelulares atuem através de propriedades de ligação com a água ou por propriedades coligativas (WATSON, 1979). O uso do glicerol na criopreservação do sêmen eqüino pode estar relacionado à baixa motilidade pós descongelação e redução da fertilidade. O efeito tóxico do glicerol têm sido relatado por muitos autores. Sua toxicidade parece causar desnaturação das proteínas, alterações nas interações da actina, além de ocasionar mudanças nos eventos citoplasmáticos devido ao aumento da viscosidade pelo glicerol intracelular, modificações na polimerização da tubulina, na associação de microtúbulos, atuação

13 10 direta na membrana plasmática, alterações no glicocálix e nas proteínas de superfície celular (HAMMERSTEDT & GRAHAM, 1992). Em um estudo comparativo entre o etilenoglicol e o glicerol demonstrou-se atuação semelhante dos mesmos, sendo que quando combinados possibilitam a redução do teor de glicerol, diminuindo seu efeito tóxico (ALVARENGA et al., 2000a). Outro estudo comparativo do glicerol e outros crioprotetores, dentre eles etilienoglicol, dimetilformamida e dimetilsulfóxido utilizando dez ejaculados de dez garanhões, constatou-se a equivalência no uso dos crioprotetores com excessão do dimetilsulfóxido, o qual apresentou resultado inferior (ALVARENGA et al., 2000b). A estrutura molecular é um parâmetro importante para determinar a eficiência dos crioprotetores, uma vez que possuem afinidade pela água devido a presença de grupamentos amina e hidroxila em sua composição, os quais favorecem a formação de pontes de hidrogênio com as moléculas de água (BAUDOT et al., 2002). Segundo Dalimata e Graham (1997), estas ligações alteram a orientação das moléculas de água dos cristais de gelo criando um ambiente menos prejudicial às células.

14 11 2.5) Inseminação Artificial com Sêmen Congelado O objetivo mais esperado da utilização de sêmen congelado eqüino é a obtenção de altas taxas de fertilidade. Entretanto, muitas variáveis ainda necessitam de aperfeiçoamento para que isto se torne uma realidade. A dose inseminante, o momento mais adequado para inseminação, um controle maior do comportamento do sêmen congelado no genital da fêmea, são alguns dos fatores que quando esclarecidos contribuirão a melhores resultados de prenhez com a criopreservação do sêmen eqüino (DELL AQUA JR., 2000). O cio da égua tem duração de 5 a 7 dias e a ovulação ocorre no final deste período (MIES FILHO, 1987). A viabilidade da célula espermática após o processo de congelação e descongelação é reduzida, diminuindo sua longevidade e capacidade de fecundação, o que justifica os baixos índices de prenhez. Por este motivo a inseminação artificial com sêmen congelado eqüino deve ser realizada imediatamente a descongelação e próximo ao momento da ovulação. O ideal é que se faça controle folicular com acompanhamento ultra-sonográfico em programas de inseminação com eqüinos, a fim de prever a ovulação e decidir o melhor momento para a inseminação, limitando assim, o número destas (BRISKO & VARNER, 1992). A Indução farmacológica da ovulação é um procedimento fundamental na maximização e sucesso de diferentes protocolos de utilização de sêmen eqüino. Esta ferramenta tem sido amplamente utilizada nas inseminações com sêmen refrigerado, congelado e na sincronização para transferência de embriões (MELO et al., 2005). O hormônio mais comumente utilizado é o hcg (gonadotrofina coriônica humana), que provoca a ovulação em até 48 horas (MEDEIROS, 2005). O hcg é uma grande molécula glicoproteica, que quando utilizada em repetidas aplicações promove o desenvolvimento de anticorpos tornando-a ineficiente como promotora da ovulação (MELO et al., 2005). Segundo Melo et al. (2005), o GnRH sintético (Deslorelina) e o extrato de pituitária equina (EPE) estão apresentando-se como alternativas eficazes para o desencadeamento da ovulação em tempo pré-determinado sem a ocorrência da

15 12 formação de anticorpos, desta forma podendo se utilizados em vários ciclos consecutivos. Tanto o GnRH sintético, quanto o EPE sincronizaram com grande eficiência o tempo de ovulação de éguas induzidas com folículos de 35mm, sendo que o EPE adianta em aproximadamente 4 horas o momento da ovulação em relação à deslorelina, sendo que o tempo médio para ovulação com a utilização de 10mg de EPE foi de 34,75 +/- 6,72 horas, enquanto que o tempo médio de 1mg de deslorelina foi de 38,49 +/- 7,38 horas (MELO et al., 2005). Segundo Medeiros et al. (2005), tanto a dose de 10mg, quanto a dose de 5mg de EPE foram eficazes em induzir a ovulação no período de 48 horas, utilizando uma dose bem inferior a preconizada na literatura, tornando-se uma alternativa como agente de indução de ovulação em programas onde se requer grande precisão do momento da ovulação, como a inseminação artificial com sêmen congelado. O mesmo autor relatou que não houve diminuição da eficiência após 4 aplicações em cada animal, demonstrando que, por ser de origem homóloga, a droga não estimula a formação de anticorpos. Já que o sêmen congelado eqüino tem menor habilidade em interagir com as células oviduto da fêmea, mantendo sua viabilidade por menos tempo, indica-se que a inseminação seja feita de 0 a 24 horas antes da ovulação ou até 6 horas após a ovulação (SQUIRES et al., 1999). A inseminação convencional em éguas é feita por via vaginal, na qual a mão enluvada do inseminador guia uma pipeta até a passagem da cérvix e o sêmen é depositado no corpo do útero (MIES FILHO, 1987). Para conseguir melhorar os resultados com a utilização do sêmen congelado, alguns autores têm desenvolvido técnicas como o desvio da pipeta para deposição do sêmen na ponta do corno e a possibilidade de inseminação histeroscópica, na qual faz-se a deposição do sêmen sobre a junção útero tubárica com auxílio de um endoscópio (LEÃO, 2002). Segundo Melo (2005), a variação dos índices de fertilidade com a utilização de sêmen congelado devido a variabilidade entre as técnicas de inseminação, extensores, dose inseminante, número de inseminações e crioprotetores, dificulta a comparação entre

16 13 os resultados dos diferentes autores. Para melhorar a visualização, os dados foram dispostos nas tabelas A e B a seguir:

17 14 Tabela A: Resultados de Fertilidade com Sêmen Congelado (Dados Nacionais)* Autor(es) Metodologia N de sptz IA Fertilidade Arruda et al.(1986) apud Neves Neto( a 500x10 6 Intracornual 66,7% Papa (1987) macrotubo 400x % Neves Neto (1999) 800x ,0% BME Palheta 0,5ml 800x ,3% M9 Dell aqua Jr. (2000) 150x % pré e pós 150x10 6 Ápice corno 50% pré e pós 800x % pós 400/400x % pré e pós Palheta 0,25ml 50x % pós Palheta 0,25ml 50x10 6 Ápice cornual 0% pós Palheta 0,25ml 50x % pós Gomes (2002) 40x % 40x10 6 Endoscopia 66,6% Leão (2002) 400x10 6 0% 10x10 6 Endoscopia 33,3% Zahn (2002) 400x % s/ colesterol 400x % c/ colesterol Medeiros (2003) 800x10 6 0% glicerol 800x % DF Neves neto (2004) 400/400x10 6 Ápice cornual 45,0% BME 400/400x10 6 Ápice cornual 60,0 % MP50 400/400x10 6 Ápice cornual 40,0% FR4 * Adaptado de Melo (2005)

18 15 Tabela B: Resultados de fertilidade com sêmen congelado (Dados Internacionais)* Autores Metodologia N sptz/palheta IA Fertilidade Nagase (1967) 0,3 ml Não relatado pellets 33% Bader (1968) Pellet Não relatado Não relatado 39% Ellery (1971) Sachê plástico Não relatado 1 sachê 41% Baczynski (1973) Ampola Não relatado Não relatado 4% Klug (1975) Pellet Não relatado pellets 27% Merkt (1975) Pellet Não relatado 30 pellets 60% Tischner(1975) 2,5 ml x ampolas 26% Nishikawa (1975) Palheta 1ml x palhetas 56% Naumenkov (1979) 0.2 ml Não relatad o 1 Pellet 53% Martin (1979) Palheta 4 ml x palheta 63% Tischner (1979) ml 300x tubo alum. 32% Naumenkov (1979) 25 ml Não relatado 1 tubo alum. 62% Muller (1982) 15ml Não relatado 1 tubo alum. 52% Loomis (1983) 250x palheta 29% Cochran (1983) Palheta 1ml 250x palheta 28% Cristanelli (1984) 385x palheta 56% Volkmann (1987) 325x palheta 44% Volkmann (1987) 325x palhetas 73% Kloppe (1988) Palheta 4ml 600x palheta 60% Love (1989) ml x tubo alum. 55% Love (1989) Palheta 4ml 400x palheta 46% Braun (1990) Pellet Não relatado 1 Pellet 0% Haard (1991) 500x106 1 palheta 60% Samper (1991) Palheta 2,5 ml 200x palheta 51% Jasko (1992) 800x palheta 56% Thomassen (1993) 150x palhetas 43% Samper (1994) Palheta 2,5 ml 200x palheta 38% Heitland(1995) 200x palhetas 17% e 50% * Adaptado de Melo (2005)

19 16 3) Considerações Finais Os estudos realizados sobre a metodologia de congelação, diluentes, crioprotetores, centrifugação, envase e protocolos de inseminação artificial com sêmen congelado, somados as taxas de fertilidade obtidas, estão apresentando resultados melhores e menos variáveis, aproximando-se cada vez mais de uma metodologia padronizada e de sucesso, possibilitando um aumento na congelabilidade entre as diversas raças de garanhões, que vêm apresentando porcentagens de fertilidade cada vez melhores. Baseado nestes fatos, é de extrema importância que haja continuidade nas linhas de pesquisa citadas neste trabalho para obtenção de resultados satisfatórios e constantes nos índices de prenhez com a utilização da biotecnologia de criopreservação do sêmen eqüino.

20 17 4) Referências Bibliográficas ALVARENGA, M.A.; GRAHAM J.K.; LANDIM-ALVARENGA, F.C; SQUIRES, E.L.. Alternative cryoprotectors for freezing stallion semen. In: 11 TH INTERNATIONAL CONFERENCE OF ANIMAL REPRODUCTION, Proceedings 2000b, p.73 ALVARENGA, M.A.; LANDIM-ALVARENGA, F.C.; MOREIRA, R.M.; CESARINO, M.M. Acrossomal ultrastructure of stallion spermatozoa cryopreserved with ethylene glycol using two packaging systems. Equine Veterinary Journal, v. 32(6), p , 2000a. AMANN, R.P., PICKETT, B.W. Principals of cryopreservation and a review of cryopreservation of stallion spermatozoa. Journal of Equine Veterinary Science. V.7, p , ARRUDA, R.P. Avaliação dos efeitos dos diluentes e crioprotetores para o espermatozóide eqüino pelo uso da microscopia de epifluorescência, citometria de fluxo, análise computadorizada da motilidade (CASA) e da morfometria (ASMA). São Paulo, 2000, Tese (Livre Docência) Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade São Paulo. BALL, B.A., VO, A.. Osmotic tolerance of equine spermatozoa and the effects of soluble cryoprotectant on equine sperm motility, viability and mitochondrial membrane potential. Journal of Andrology, v.22, p , 2001 BAUDOT, A.; CAULA, C.; DUARTE, M.L.; FAUSTO, R Thermal study of simple amino-alcohol solution, Cryobiology, v.44, p , BRINSKO, S.P.; VARNER, D.D. Artificial insemination. In: McKINNON, A.O.; VOSS, J.L. (ed.) Equine Reproduction. Philadelphia: Williams & Wilkins, p

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