Biotecnologias Reprodutivas em Felinos. Profa.Dra. Maria Denise Lopes.

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1 Biotecnologias Reprodutivas em Felinos Profa.Dra. Maria Denise Lopes.

2 INTRODUÇÃO Cães e gatos além de considerados animais de estimação são também modelos comparativos importantes para estudos visando espécies não domésticas. As TRA são importantes não somente para a preservação da biodiversidade mas também para a pesquisa básica e aumento da performance reprodutiva. O sucesso das técnicas in vitro depende da possibilidade de se imitar condições in vivo.

3 INTRODUÇÃO O gato doméstico é considerado um pequeno felídeo (< 6,5Kg). A fêmea atinge a puberdade com idade entre 4 a 12 meses. Raças de pelagem curta tendem a apresentar o primeiro estro mais cedo do que raças de pelagem longa. Gestação dura de 58 a 65 dias. Fase lútea de fêmeas não prenhes dura de 35 a 40 dias. Gatas domésticas são poliestricas sazonais, ciclando a cada 14/18 dias. Classificadas como espécies de ovulação induzida. Período de estro dura de 3 a 16 dias. Filhotes são desmamados aproximadamente com 8 semanas, permitindo que a fêmea produza 3 ninhadas/ano.

4 INTRODUÇÃO O gato doméstico tem sido tradicionalmente descrito como uma espécie de ovulação induzida. Estimulação neuronal do hipotálamo medial basal, induzida pela cobertura causa liberação reflexa de GnRH, e subsequente onda de LH da adenohipófise.. Baseada na flutuação de E2, o gato doméstico apresenta ciclo estral de 14/15 dias, estro de 3 a 7 dias. No 3º dia do estro os sinais comportamentais são bem evidentes em associação com o pico de E2 coberturas frequentes estimulam LH suficiente para causar maturação oocitária final e ovulação, que ocorre cerca de 24 a 48 horas após a cobertura.

5 OBJETIVO Gatos domésticos Possibilidade de utilização das TRA em felinos domésticos dentro da rotina clínica.

6 1. Sêmen fresco, resfriado e congelado 1. Vagina artificial Coleta de sêmen 2. Eletroejaculação 3. Lavagem vaginal após a cobertura 4. Cauda do epidídimo após a castração Ana Izabel S. B. Villaverde, 2005

7 1. Sêmen fresco, resfriado e congelado Coleta de sêmen Eletroejaculação Tebet,2003 Protocolo de estímulos para coleta de sêmen Séries Estímulos Voltagem (V) HOWARD, J.G., BARONE, M.A., DONOGHUE, A.M., WILDT, D.E., 1992

8 1. Sêmen fresco, resfriado e congelado Análise de sêmen volume (µl) concentração (sptz/ml) motilidade (%) osmolaridade (mosm/kg) ph morfologia espermática (%) PLATZ & SEAGER, 1978; DOOLEY & PINEDA, 1986

9 1. Sêmen fresco, resfriado e congelado Sêmen fresco.diluir 1:1.Não exceder 100µl.Solução Fisiológico, Ringer sem Lactato

10 1. Sêmen fresco, resfriado e congelado Sêmen resfriado: Curva de resfriamento. Meio diluidor. A refrigeração pode ser feita colocando-se o eppendorf com o sêmen dentro de um recipiente com 400 ml de água em temperatura ambiente, e após acondicioná-lo num refrigerador a 5 o C 0,3 C/minuto

11 1. Sêmen fresco, resfriado e congelado Valores médios e desvio padrão de motilidade, vigor, integridade de membrana e morfologia espermática de sêmen obtido da cauda do epidídimo de gato doméstico, analisados nos momentos pós-colheita, pós-refrigeração e pós-descongelação dos dois grupos estudados. Botucatu, Mot (%) Vigor ( 5) Íntegros (%) Normais(%) 0h 24h 0h 24h 0h 24h 0h 24h Pós-refrigeração Média 87,33 77,67 4,60 4,07 81,07 74,73 73,33 68,60 Desvio Padrão 5,63 15,68 0,51 0,80 7,15 8,84 6,99 10,08 Pós-descongelação Média ,90 2,77 42,13 49,40 66,2 61,8 Desvio Padrão 24,55 21,13 0,76 0,73 14,44 16,07 8,74 8,82

12 1. Sêmen resfriado e congelado O processo de congelação reduz a qualidade do sêmen diminui o número de espermatozóides vivos. a congelação produz modificações celulares que alteram a motilidade, a longevidade, a integridade das membranas e a capacidade fertilizante dos espermatozóides.

13 1. Sêmen fresco, resfriado e congelado 8 MAE 1 MAE MP N MP MAI MAI a b 2 MAE MAE VES e MP MAI MAI c MP d MP

14 1. Sêmen fresco, resfriado e congelado Valores médios e desvio padrão de motilidade, vigor, integridade de membrana e morfologia espermática de sêmen obtido da cauda do epidídimo de gato doméstico, analisados nos momentos pós-colheita, pós-refrigeração e pós-descongelação dos dois grupos estudados. Botucatu, Mot (%) Vigor ( 5) Íntegros (%) Normais(%) 0h 24h 0h 24h 0h 24h 0h 24h Pós-refrigeração Média 87,33 77,67 4,60 4,07 81,07 74,73 73,33 68,60 Desvio Padrão 5,63 15,68 0,51 0,80 7,15 8,84 6,99 10,08 Pós-descongelação Média 42,00 2,90 42,13 66,2 Desvio Padrão 24,55 0,76 14,44 8,74

15 2. Inseminação Artificial Intrauterina Intra-vaginal X Indicações: Problemas comportamentais// físicos que impossibilitem a cópula; distância entre os reprodutores; evitar a transmissão de doenças infecciosas.

16 2. Inseminação Artificial Villaverde & Lopes, Intra-vaginal 2. Intrauterina

17 3. Indução de Estro e Ovulação Estimulação ovariana Indução das ovulacões 150 UI de ecg 82h 100 UI de hcg. Estimulo vaginal / hcg. Protocolo de IA hcg + IA hcg + 1 IA / horas após, 2 IA Wildt et al., 1978

18 2. Inseminação Artificial Sêmen fresco (13 x 106) IVI hcg x 28 após hcg 33% (5/15). Sêmen congelado (20 x 106; 70% motilidade pós descongelação) IVI X IUI 0% X 41.7% Chatdarong et al, 2007

19 2. Inseminação Artificial Nasceu no dia 24 de julho do ano de 2006, no Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, UNESP, Campus de Botucatu, dois filhotes de gato doméstico, resultado de uma inseminação artificial com sêmen congelado. A fêmea foi submetida a um protocolo hormonal para indução do estro e ovulação e inseminada, por via intrauterina, utilizando sêmen congelado. O sêmen foi coletado através de vagina artificial e congelado nas dependências do laboratório do REPAS (Reprodução de Pequenos Animais e Silvestres). Esse evento faz parte do trabalho de mestrado em Reprodução Animal do programa de Pós- Graduação da FMVZ, Unesp, Botucatu da aluna Ana Izabel Silva Balbin Villaverde, Bolsa FAPESP, processo número 04/ ,

20 4. Produção de embriões in vitro - PIV 1. Recuperação de oócitos. 2. Maturação oocitária - MIV 3. Fertilização in vitro - FIV 4. Cultura embrionária CIV 5. Criopreservação/T.E.

21 4. Produção de embriões in vitro - PIV Recuperação oocitária Martins, 2003 Lopes, 2000

22 4. Produção de embriões in vitro - PIV Martins, 2004 Maturação oocitária - é definida como a sequência de eventos que ocorrem desde o estágio de vesícula germinativa até o término da segunda divisão meiótica, com formação do segundo corpúsculo polar.

23 3. Maturação oocitária e fertilização in vitro A eficiência da MIV e FIV em oócitos de gatos domésticos é inferior a de outras espécies. Somente 50 a 60% dos oócitos cultivados atingem a maturação - MII e geralmente menos de 50% dos oócitos maturados são fertilizados. Mesmo sob condições ideais transforma em blastocistos. < de 30% dos oócitos fertilizados se Karja et al., 2002.

24 3. Maturação oocitária e fertilização in vitro Pope et al., 2006 relataram que a sazonalidade reprodutiva das gatas influencia PIV. OÓCITOS de ovários funcionais x OÓCITOS de ovários quiescentes.

25 Influência da sazonalidade e da condição ovariana sobre a PIV em gatos domésticos. o número médio de COCs obtido em ovário de fêmeas nos meses de janeiro, fevereiro e março fotoperíodo I - foi de 23,65. fotoperíodo II (agosto, setembro e outubro) este valor foi de 48,2 COCs/gata. Gatas que apresentavam ovários na condição folicular forneceram um número menor de oócito/ovário,entretanto, a maioria dos oócitos foi classificado em Grau I. a taxa de maturação oocitária nesse estudo foi de 75% em ambos os períodos. a taxa de clivagem foi de 64,26%. de mórula foi de 40, Maturação oocitária e fertilização in vitro de blastocisto 23,89%, independente da condição ovariana. Martins (2008)

26 3. Maturação oocitária e fertilização in vitro * Embrião com 28 células corado com Hoechst Blastocisto após 192 horas de cultivo in vitro (D8). Embrioblasto (asterisco) Embrião de 8 células corado com acridina orange e iodeto de propídeo. Células VN (viáveis e normais, com núcleos corados em verde e morfologia normal) e células NVF (não viáveis com núcleo alaranjado e cromatina fragmentada). Martins et al. (2009)

27 4. Criopreservação de oócitos, embriões e tecidos ovarianos. Estocar material genético de espécies em extinsão ou de animais geneticamente superiores.

28 4. Criopreservação de oócitos e embriões felino. Impacto do Tempo de Refrigeração Sobre o Tecido Ovariano de Gatas Domésticas Refrigeração (5ºC) sobre o tecido ovariano em períodos de 0 (controle), 12, 24, 96 e 120 horas por meio de avaliações histopatológicas e imunoistoquímicas. A refrigeração não mostrou resultados satisfatórios ao longo do tempo, o que foi demonstrado tanto pela degeneração do tecido ovariano quanto pelo aumento da apoptose observada, contudo, para períodos mais curtos (até 24 horas) o tecido mostrou conservação adequada.

29 4. Criopreservação de oócitos, embriões e tecido ovariano felino. A criopreservação de oócitos apresenta resultados inferiores aos embriões. A FIV de oócitos maturos criopreservados tem taxa de clivagem de 38,7% e FIV de oócitos criopreservados imaturos tem taxa de 6.8%.

30 4. Considerações Finais. Ainda existe muito a ser pesquisado. Barreira para a aplicação destas biotécnicas na clínica veterinária. Lembrar que a prática desses métodos permitirá adaptações para cada local e profissional, e que a disseminação das técnicas existentes incentivará os proprietários, uma vez que, muitos destes desconhecem estas possibilidades.

31 2. Inseminação Artificial Estratégias na prevenção de doenças antes do acasalamento. Recomendação Apenas cruzar gatos negativos Apenas cruzar gatos com mesmo status sorológico (+/-) Vacinação geralmente recomendada Agente infeccioso FeLV FIV Vírus da panleucopenia felina Herpesvírus felino Calicivirose felina Coronavírus felino (PIV) Clamidiose

32 2. Inseminação Artificial Histórico reprodutivo completo. Preparo dos reprodutores: Exame físico geral e específico de aparelho genital. Sorologia para doenças infecciosas. Vacinação e vermifugação.

33 2. Inseminação Artificial Coleta de sêmen Protocolo anestésicos: associações de tiletamina-zolazepan ou quetamina- xilazina. Não utilizar: fenotiazínicos, diazepan e os utilizados em anestesias inalatórias.