TECNOLOGIA DO SÊMEN ANÁLISE DO SÊMEN

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1 TECNOLOGIA DO SÊMEN ANÁLISE DO SÊMEN Características físicas c) Motilidade (progressiva) % de sptz viáveis uma gota de sêmen em aumento de 100 a 400x na propriedade: 50% para doação de sêmen: 70% para sêmen congelado: 30% d) Vigor vitalidade do movimento do sptz escala de 0 5 (ideal 3) 1

2 CONCENTRAÇÃO ESPERMÁTICA Contagem de sptz Contar 1,2,3,4,5 ou 1,6,3,7,5 2

3 CONTAGEM ESPERMÁTICA Quadrante 1, sptz contados: 1,2,4,5,6,8,9 Quadrante 2, sptz contados: 10,11,12,13,14 CONCENTRAÇÃO ESPERMÁTICA De preferência, dar a concentração em [ ] x 10 6 / ml Ex.: Em 5 quadrados a concentração é 100 sptz Usando a fórmula (para diluição de 1:200) 100 x 5 x 10 x 200 / mm x 10 x 200 / mm x 200 / mm 3 1ml = 1000 mm x 1000 / ml /ml ou x 10 6 sptz/ ml 3

4 VOLUME ESPERMÁTICO Para congelação: Palheta média = 0,52 ml de sêmen ( 0,5mL) Palheta fina = 0,225 ml de sêmen ( 0,25mL) 4

5 Congelação Fenômenos físicos e cristalização - podem levar a: - danos ultra-estruturais, físicos, bioquímicos e funcionais - alteração da assimetria bilipídica da membrana espermática - alterações na cromatina e na morfologia - perda da motilidade - permeabilização e desestabilização das membranas - geração de espécies reativas de oxigênio (EROs) (WATSON, 2000) EROs X estresse oxidativo (AITKEN, KRAUSZ, 2001; MARQUES ET AL., 2002) Originadas do metabolismo normal da células Degradadas pelos agentes antioxidantes Alteração na produção e degradação Aumento na produção de EROs Induz peroxidação lipídica pois sptz tem [ ác. graxos] na membrana Remoção de Hidrogênio da camada lipídica Formação de RADICAIS LIVRES Perda da fertilidade e fragmentação do DNA do sptz 5

6 DILUIÇÃO DO EJACULADO aumento do volume do ejaculado preservação da integridade da membrana plasmática maior número de fêmeas inseminadas processo mais lucrativo TºC ejaculado = TºC diluidor (37ºC) determinar taxa de diluição - concentração espermática relativa e total - volume do ejaculado - tipo de envasamento (palheta francesa) - concentração espermática por dose (40milhões sptz/ dose) diluição e movimentação lenta e circular evitar formação de bolhas de ar 6

7 PRESERVAÇÃO DO SÊMEN Meios diluidores - funções conservar a fertilidade dos sptz por período prolongado aumentar o volume total do ejaculado fonte de energia nutrição dos sptz ação tampão proteção contra alta oxidação e estabilização do ph, à medida que se forma ác. lático proteção contra choque térmico proteção contra agentes contaminantes regulação da osmolaridade manutenção da isotonicidade MEIOS DILUIDORES fonte de energia: glicose gema de ovo ou leite nutrientes protetores de T o C tampão: várias substâncias (citrato de sódio, tris) inibir crescimento microorganismos: antibióticos glicerol: protege dos efeitos da congelação DMSO, açúcares (lactose): agentes desidratantes ph: 6,5 a 6,9 (isotônico e isosmol) baixo custo não produzir metabólitos nocivos aos sptzs estocados até 7 dias ou congelados 7

8 Substâncias crioprotetoras -peso molecular -capacidade de atravessar ou não a membrana celular -adicionados após o resfriamento PERMEÁVEIS glicerol, etilenoglicol e dimetilsulfóxido (DMSO) previnem formação de cristais de gelo intracelular IMPERMEÁVEIS sacarose, lipoproteínas da gema do ovo e ptns do leite promovem estabilização da membrana plasmática DILUIDORES MAIS USADOS Lactose-gema Citrato-gema Tris-gema - Ovos SPF - Ovos postos no dia Glicina-gema Leite desnatado Botu-Bov HIGIENIZADOS Água de côco Sol. Ringer Simples (resfriamento) 8

9 CITRATO-GEMA (duas frações de 500ml cada) Componente Citrato de sódio 2,94% Fração A (sem glicerol) Fração B (com glicerol) % Final da mistura 400ml 330ml 73 Gema de ovo 100ml 100ml 20 OBS Glicerol - 70ml 7 TOTAL 500ml 500ml 100 ph=6,8 a 6,9 (BERBER, 2009) MEIOS À BASE DE LEITE (duas frações de 500ml cada) Componente Fração A (sem glicerol) Fração B (com glicerol) % Final da mistura OBS Leite 500ml 430ml 93 - até 3,5% gordura - aquecido 92 95ºC - desnaturar ptns nocivas - esfriar em TºC ambiente - filtração p/ remover nata Glicerol - 70ml 7 TOTAL 500ml 500ml ph=6,5 a 6,6 - desvantagem: - opacificação do meio - difícil observação sptz (glóbulos de gordura) (BERBER, 2009) 9

10 TRIS-GEMA (duas frações de 500ml cada) Tris: ácido cítrico e água destilada Componente Fração A (sem glicerol) Fração B (com glicerol) % Final da mistura TRIS (0,2M) 400ml 330ml 73 OBS Gema de ovo 100ml 100ml 20 Pode chegar até 28% Glicerol - 70ml 7 TOTAL 500ml 500ml pode acrescentar glicose ou frutose: maior energia p/ sptz - isotônico e isosmol - MUITO USADO! (BERBER, 2009) R$ 56,50 em ml 10

11 Diluição PRESERVAÇÃO DO SÊMEN Única Fracionada feita em temperatura de 33 a 36 o C sem glicerol : 33 o C com glicerol : 4 o C Sendo que o máximo de diluidor que se pode colocar na primeira fração é 60ml 11

12 PRESERVAÇÃO DO SÊMEN Diluição única 1:30h 4:00h Diluição (33 o C) Câmara fria 4 o C congelação -196 o C ½ da dose total do diluidor ½ da dose total do diluidor PRESERVAÇÃO DO SÊMEN Diluição fracionada A: sem glicerol B: com glicerol (crioprotetor) Fração A: 50% do diluidor Fração B: 20% 30% 50% 15min 15min Exemplo: total de diluidor a ser acrescido = 80ml Fração A: 40 ml Fração B: 8ml 12ml 20ml 15min 15min 12

13 Envase PRESERVAÇÃO DO SÊMEN Pellet em pedra de gêlo seco Ampola Palhetas de 0,52 e 0,225ml ( 0,5 e 0,25ml) Vantagens ocupa menos espaço no botijão de N 2 selada por US ou álcool polivinílico curva de congelação mais homogênea: perdas envase pode ser feito antes ou após o resfriamento e equilíbrio facilidade de identificação PRESERVAÇÃO DO SÊMEN Refrigeração e Equilíbrio Lento e gradual p/ evitar choque térmico Tempo de equilíbrio 4h + tempo de resfriamento (6h entre 33 e 4 o C) Sêmen resfriado até 7 dias (4 o C) : suínos e eqüinos 13

14 Identificador de palhetas Envase 14

15 Mesa suspensa para congelação 15

16 Armazenamento do sêmen Nível de N 2 deve estar sempre acima de 18cm PRESERVAÇÃO DO SÊMEN Armazenamento e manipulação Nitrogênio a o C mínimo de 18 cm de N 2 no botijão deve-se retirar o sêmen com pinça de metal 7cm abaixo da boca do botijão proteger ejaculado da luz solar manipulação por pessoas capacitadas 16

17 PRESERVAÇÃO DO SÊMEN Armazenamento e manipulação (Horn, et al. 1997) Tempo de exposição ao ambiente Diferença significativa : -Motilidade -Motilidade TTR -Vigor -Integridade do acrossoma Viabilidade espermática morfologia atividade metabólica membranas normais 17

18 PRESERVAÇÃO DO SÊMEN Descongelação Em água a 35 o C por 30 segundos: palheta média Em água a 35 o C por 20 segundos: palheta fina Temperatura superior destaca acrossoma SISTEMA DE AVALIAÇÃO COMPUTADORIZADA DAS CARACTERÍSTICAS SEMINAIS (CASA) SUBJETIVIDADE X PRECISÃO E REPETIBILIDADE -Uso de sondas fluorescentes (microscopia de epifluorescência) -Citometria de fluxo (sexagem espermática) -Avaliação de proteínas do plasma seminal 18

19 TESTES PARA AVALIAÇÃO DO SÊMEN - provas metabólicas A amostra é incubada a certa T o C por tempo determinado TESTES PARA AVALIAÇÃO DO SÊMEN - Teste de termorresistência Convencional: incubação da amostra a 38 o C / 5h Rápido: 46 o C / 30 min Estressado: 38 o C / 5h e 5 o C / 24h Após estes períodos avaliação motilidade progressiva ideal: 15% de motilidade 19

20 AVALIAÇÃO DO SÊMEN DESCONGELADO TT (teste de termorresistência convencional) 5h a 38ºC TTR (teste de termorresistência rápido) 30min a 46ºC TTS (teste de termoresistência estressado) 5h a 38ºC mais 24h a 5ºC Interpretação: Aprovar quando Motilidade mínima de 15% após o teste TESTES PARA AVALIAÇÃO DO SÊMEN CONGELADO - Teste de degradação da motilidade Amostra incubada em banho maria a 37oC / 2h Avaliação aos 5 min e 120 min de incubação TDM = motilidade 5 motilidade 120 x 100 motilidade 5 Resultado : entre 30 e 50% 20

21 TESTES PARA AVALIAÇÃO DO SÊMEN DESCONGELADO -Teste de redução de azul de metileno Indica capacidade desidrogenante de uma amostra de sêmen Relaciona-se ao grau de vitalidade e concentração Boa amostra: descora o meio entre alguns segundos e três min Teste hiposmótico (HO) - transporte de fluidos pela membrana plasmática intacta - até atingir equilíbrio LIC e LEC - sptz em solução hiposmótica - entrada de fluidos na membrana - edema da cauda - cauda dobra e enrola - sptz inchado ou HO positivo - membrana plasmática intacta 21

22 Avaliação da integridade do acrossoma - criopreservação eleva níveis de cálcio intracelular (= capacitação) - reação acrossomal pode ocorrer antes do previsto no sêmen congelado TESTES PARA AVALIAÇÃO DO SÊMEN DESCONGELADO - Teste de deterioração do acrossoma Aceitável 30% para maioria das espécies 50% para suínos 22

23 CONSIDERAR FORA DOS PADRÕES a) Volume da dose inferior a 0,25ml b) Motilidade retilínea progressiva (mrp) inferior a 30% c) Vigor inferior a 3 (0 a 5) d) Morfologia (Portaria Sec. Desenvolv. Rural 05/09/96) Concentração sptz com mrp Total de defeitos Defeitos maiores (superior a) (superior a) 10x10 6 ou mais 30% 20% 6x10 6 a 10x % 10% e) Lesão de acrossoma - contraste de fase: superior a 20% - interferência diferencial de fase: superior a 30% (CBRA, Fonseca et al., 1992) Exercícios de interpretação para congelação Ex.: Dados do ejaculado de um bovino: Volume = 5 ml [ ] calculada = 1000 x 10 6 sptz/ ml Vigor = 5 Motilidade = 70% Usar palhetas médias: volume útil = 0,52 ml usar dose de 10 x 10 6 sptz em cada palheta Pergunta-se: quantas doses podem ser congeladas? qual a quantidade de diluidor? 1ml x 10 6 sptz 5 ml ---- x sptz 5000 x 10 6 sptz temos no total com 70% motilidade, ou seja, 3500 x 10 6 sptz viáveis 1 dose x 10 6 sptz x doses x 10 6 sptz 350 doses podem ser feitas 1 dose ,52 ml 350 doses ---- x ml Precisa de 182 ml p/ fazer as 350 doses Como já temos 5ml do volume do ejaculado, devemos acrescentar 177 ml de diluente 23

24 EXERCÍCIOS... 1) Ex.: Dados do ejaculado de um bovino: Volume =10ml [ ] calculada = 800 x 10 6 sptz/ ml Vigor = 5 Motilidade = 70% Usar palhetas finas: volume útil = 0,225 ml usar dose de 20 x 10 6 sptz em cada palheta Pergunta-se: quantas doses podem ser congeladas? qual a quantidade de diluidor? 2) Ex.: Dados do ejaculado de um bovino: Volume =8ml [ ] calculada = 900 x 10 6 sptz/ ml Vigor = 5 Motilidade = 70% Usar palhetas médias: volume útil = 0,52 ml usar dose de 10 x 10 6 sptz em cada palheta Pergunta-se: quantas doses podem ser congeladas? qual a quantidade de diluidor? 24

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