IMUNODETECÇÃO DE PEPTÍDEOS TÓXICOS DE CIANOBACTÉRIAS EM AMOSTRAS AMBIENTAIS Carolina de Castro Bueno Faculdade de Engenharia Ambiental CEATEC carolcastrob@puc-campinas.edu.br Augusto Etchegaray Júnior Química Ambiental, Faculdade de Química CEATEC augusto.etchegaray@puc-campinas.edu.br Resumo: Microcistinas formam um grupo tóxico de peptídeos não ribossômico devem ser detectados em níveis muito baixos devido ao seu efeito tóxico aos animais e seres humanos. Neste estudo foram coletadas quatro amostras reais em corpos d água eutrofizados com a finalidade de detectar e confirmar a presença de microcistina-lr (MLR)por análises espectroscópica UV, cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) e calorimetria exploratória diferencial (DSC). O objetivo principal deste trabalho é aperfeiçoar esses métodos de forma se seja possível deixar análises de detecção de MLR mais sensíveis, rápidas e de fácil interpretação. Os resultados mostram que a análise espectroscópica UV é o melhor modo para detectar MLR em amostras reais. Palavras-chave: Microcistina-LR, imunodetecção, análise espectroscópica UV. Área do Conhecimento: Ciências Exatas e da Terra Análise de Traços e Química Ambiental. 1. INTRODUÇÃO Relatos de intoxicação animal e de doenças em seres humanos ligados a toxinas de cianobactérias ocorrem no mundo todo, como a morte de 50 pacientes de hemodiálise em Caruaru (Pernambuco) [3, 4, 1]. Estes exemplos demonstram a necessidade de um aumento na sensibilidade e rapidez de resposta dos métodos utilizados para detectar essas toxinas para proteção da saúde pública e na gestão dos recursos hídricos, onde há grande propensão de desenvolvimento de florações tóxica [1]. Vários métodos de detecção são utilizados atualmente como a cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à espectrometria de massas, bioensaios em animais de laboratórios, testes de inibição enzimática e testes imunológicos [2]. As microcistinas são peptídeos não ribossômicos cíclicos que apresentam diversas isoformas como microcistina-lr (MLR), microcistina-rr, microcistina- YR e nodularina, sendo MLR considerada a mais tóxica. MLR apresenta toxicidade considerável sobre mamíferos, podendo levar a lesão total do fígado. Para a detecção rápida e com alta sensibilidade tem sido utilizado o método imunológico com anticorpos específicos para MLR. A imunodetecção baseia-se em interações moleculares específicas de curto alcance envolvendo o reconhecimento Ag-Ac [9]. A interação entre proteínas e receptores específicos também envolve forças semelhantes [6]. Atualmente já se conhece mais de 80 variantes de microcistinas que não estão disponíveis em padrões para estudos [5]. Dessa forma, surge a necessidade de desenvolver métodos sensíveis que consigam identificar essas variantes de um modo eficiente e barato. Monitorar corpos d'água é uma tarefa difícil visto que florações de cianobactérias podem conter uma complexa mistura de cianobactérias e, consequentemente, suas toxinas. Mas a cromatografia líquida de alta eficiência juntamente com detecção UV tem sido um método bastante utilizado para encontrar cianotoxinas em diversas matrizes. Justamente por causa disso, esse método tem a desvantagem de detectar também interferências de outros analitos presentes nas matrizes. É esperado que a análise UV baseada na detecção de cromóforos possa ser uma boa técnica para quantificação preliminar de espécies desconhecidas de microcistinas [8]. Dentre as técnicas termoanalíticas mais utilizadas encontram-se a Análise Térmica Diferencial (DTA - Differential Thermal Analysis), na qual se acompanha a variação de temperatura da amostra em relação a um material inerte de referência, e a Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC - Differential Scanning Calorimetry), na qual se acompanha a variação da energia entre a amostra e a referência. A análise de DSC, técnica utilizada neste trabalho, permite, entre outras informações, determinar temperaturas de fusão, de decomposição, além de fornecer dados sobre a estabilidade térmica de compostos.
2. METODOLOGIA 2.1. Coleta e Tratamento da Amostra Real Foram coletadas quatro amostras reais dentro do estado de São Paulo, sendo a primeira em um lago eutrofizado de uma propriedade particular em Piracicaba, o segundo em um corpo d água lêntico de uma propriedade particular em São Lourenço da Serra e, o terceiro, no Riacho Grande, pertencente à represa Billings (São Paulo, capital). Duas coletas foram feitas em fevereiro de 2008, maio de 2008 e novembro de 2008 no período de seca. As primeiras coletas foram feitas em garrafas PET estéreis, com um volume total de um litro, na sub-superfície a vinte centímetros da margem. A segunda coleta obedeceu aos mesmos princípios, porém foi feita em um frasco âmbar estéril de um litro, hermeticamente fechado. A terceira coleta foi elaborada em condições semelhantes à primeira na represa Billings São Paulo, sendo gentilmente cedida pela Profa. Dra Marli Fiore (CENA-USP/Piracicaba). Todas as amostras foram armazenadas em geladeira a 4 C. A última amostra foi coletada em frasco de vidro esterilizado, na superfície de um lago particular situado no bairro Colinas do Piracicaba, distrito de Artemis, Piracicaba/SP, no dia 03 de agosto. Esta foi armazenada em temperatura ambiente e sob luz natural. 2.2.Desenvolvimento de testes imunocromatográficos e ELISA Os testes imunocromatográficos (Microcystins Strip Test Abraxis LLC - Warminster, PA) e o teste imunoenzimático - ELISA (Microcystins-DM ELISA Abraxis LLC - Warminster, PA) foram realizados sem os passos de purificação e concentração da amostra e de acordo com os procedimentos padrões indicados pelos fabricantes dos kits. Ambos os testes apresentam boa correlação nos resultados obtidos para uma mesma amostra. forma, o branco para a análise foi feito com a solução tampão mencionada anteriormente. 2.4. Condições experimentais da Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC) As curvas de DSC foram obtidas em um módulo calorimétrico exploratório diferencial DSC 200 (Netzsch Instruments). Para os ensaios, utilizou-se padrões de anticorpo anti-microcistina e conjugado da mesma toxina do teste de ELISA (Microcystins- DM ELISA Abraxis LLC - Warminster, PA), suporte de amostra de alumínio, atmosfera de ar e nitrogênio. O equipamento foi previamente calibrado para temperatura utilizando como padrões os pontos de fusão do tampão fosfato (PBS - ph 7,4). O fluxo de nitrogênio utilizado foi de 30 ml/min, a faixa de varredura foi de 20 C a 60 C, com uma taxa de aquecimento de 1 C/min. 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO 3.1. Testes com Sistemas de Detecção Imunológica de MLR Ambos os sistemas imunológicos utilizados apresentaram resultados positivos para microcistina- LR na amostra ambiental, sendo que o teste de ELISA ainda indicou a possibilidade da presença de outras isoformas da cianotoxina (dados não apresentados). Para os resultados do teste de ELISA, foram aplicados modelos de regressão linear simples relacionando os valores de absorbância e concentração dos padrões e controles da microcistina do sistema de imunodetecção (Kit). Pela Figura 1, nota-se que houve boa correlação entre os parâmetros estudados. 2.3. Condições experimentais da análise espectroscópica UV-Vis Para análise em ultravioleta foi utilizado um espectrofotômetro UV-VIS Hewlett-Packard 8351 em temperatura ambiente (24 C). A detecção UV foi realizada em 238 nm (valor base para a absorção do cromóforo da microcistina-lr - ADDA) e o espectro de absorção de cada amostra foi monitorado em uma faixa de comprimento de onda de 190 a 800 nm com a finalidade de encontrar variáveis de microcistina e sinal do anticorpo específico. Foi utilizada para as análises, uma cubeta de quartzo. As amostras foram diluídas quatro vezes em tampão PBS (phosphate buffer solution) com ph ajustado para 7.4 e, desta Figura 1. Curva padrão do teste de ELISA
3.2. Identificação das células das cianobactéria Para obter a confirmação de que as toxinas presentes nas amostras e detectadas pelos testes foram de fato a variante microcistina-lr, análises microscópicas foram realizadas para identificar as células das cianobactérias (Figura 2). Através da análise visual fica clara semelhança entre as células e seu modo de agrupamento. Pode-se concluir que as células presentes em nossas amostras são de Microcystis aeruginosa e, portanto, as toxinas são predominantes nos substratos são as microcistinas- LR. ppb) e presença de possíveis variantes de cianotoxinas. Já na Figura 3 onde se compara as modificações nas ligações com a enzima conjugada de MLR, percebe-se claramente que há picos para os mesmo comprimentos de onda. Apenas a solução contendo amostra real apresentou uma diferença de aproximadamente 0,045 AU em comparação com o espectro da solução contendo o padrão de MLR. Na Figura 4, o cenário de discussão é o mesmo que se apresentou na Figura 13: picos de absorção semelhantes, sugerindo um padrão, para uma pequena diferença na absorção. Esse resultado consequentemente dá a entender que há, portanto, uma diferenciação nas soluções analisadas. 0,5 0,4 Ac específico Ac específico + MLR 2 ppb Ac específico + Amostra Real Figura 2. Identificação Microscópica de células. Células da amostra real utilizada nas análises. Células de Microcystis aeruginosa (crédito Microscope Project- http://starcentral.mbl.edu/microscope/portal.php 0,3 0,2 0,1 0,0-0,1 3.3. Análise espectroscópica UV A análise em questão foi feita através de quatro diluições de padrões do kit ELISA (Microcystins-DM ELISA Abraxis LLC - Warminster, PA) e da amostra real 2 (São Lourenço da Serra, SP); sendo eles: 1:1; 1:10; 1:100; 1:1000. Todas foram feitas em solução tampão PBS (ph 7.4), motivo pelo qual suspeitamos que o cromóforo da microcistina-lr (ADDA), não absorveu em 238 nm. Para a análise, todas as amostras foram diluídas na mesma proporção acrescentando-se as quantidades indicadas de anticorpo, antígeno e tampão fosfato (20 mmol L-1), ph 7,4. Observando a Figura 3, nota-se que o espectro de absorção do anticorpo específico da microcistina- LR sofreu uma modificação semelhante quando foi acoplado com o padrão de microcistina-lr e com a amostra real 2. Esse fato sugere que na amostra real há presença de microcistina-lr, confirmando uma boa correlação com os métodos de ELISA e Strip Test. A absorbância, em 203 nm, caiu de 0,489 AU para 0,090 AU (padrão de MLR) e para 0,083 AU (amostra real).essa diferença de 7 AU entre o padrão de MLR e a amostra real, confirma, mais uma vez, o resultado de ELISA, onde foi observado uma maior concentração de MLR (aproximadamente 2,5 0,12 0,08 0,06 0,04 0,02-0,02-0,04 Ac específico + Toxina MLR 2ppb Ac específico + Amostra Real -0,06 Figura 3. Espectros Compostos para Comparação Anticorpo. Espectros Compostos para Comparação Enz. Conjugada 3.4. Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC) Investigou-se, através da técnica DSC, a possibilidade de ocorrência de interações energéticas entre o anticorpo anti-mlr e o conjugado da toxina. Também, investigou-se a eficiência e reprodutibilidade da análise para detecção de microcistina-lr. Alguns resultados são mostrados na Figura 5.
0,12 0,08 0,06 0,04 0,02-0,02-0,04-0,06 0,25 0,20 0,15 0,05-0,05 Toxina MLR 2 ppb Amostra Real Ac + Enzima Conjugada + Toxina 2 ppb Ac + Enzima Conjugada + Amostra Real Figura 4. Espectros Compostos para Comparação Cianotoxinas e Anticorpo. Espectros Compostos para Comparação Cianotoxinas -1,2-1,4-1,6-0,2-0,3-0,5-0,7-0,9-1,1 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 Conjugado + Tampão PBS 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 Anticorpo MLR + Conjugado -0,2-1,2-1,4 25 30 35 40 45 50 55 60 65 Anticorpo MLR + Tampão PSB Figura 5. Curva DSC do conjugado da toxina MLR misturado na razão de 1:1 com o tampão fosfato (PBS). Curva DSC do anticorpo anti- MLR misturado na razão de 1:1 com o tampão fosfato (PBS). (C) Curva DSC do conjugado da toxina MLR misturado na razão de 1:1 com o anticorpo anti-mlr. Razão de aquecimento: 1 C/min. As Figuras 5 e apresentam dois picos endotérmicos em 55 C, sugerindo a temperatura de fusão do tampão PBS. Nessas mesmas figuras aparecem pequenos eventos exotérmicos, sugerindo a ocorrência de alguns fenômenos químicos e / ou físicos nas amostras. Os fenômenos físicos que podem ter ocorrido com o conjugado da toxina e com o anticorpo anti-mlr são: transição cristalina e adsorção. Já os químicos mais prováveis são: decomposição e degradação oxidativa. Na Figura 5 (C) é possível observar um processo endotérmico na mistura conjugado-anticorpo nos mesmos 35 C que provocaram efeitos exotérmicos nessas substâncias quando estavam sozinhas no cadinho de alumínio. Este fenômeno sugere que ocorreu a reação antígeno-anticorpo da amostra, já que esta apresentou características térmicas de um processo novo. 4. CONCLUSÕES Conclui-se, pois, que o método de análise UV é bastante útil para ver se há formação do antígenoanticorpo e, conseqüentemente, detecção de variantes diversas de microcistina em uma matriz complexa. Já os imunoensaios diretos (Strip Test e ELISA) aplicados à detecção desses peptídeos tóxicos mostraram boa correlação entre si e entre os ensaios cromatográficos e UV. As análises de cianotoxinas em diversos ambientes ainda não são eficientes no que se diz respeito ao tempo de resposta e, portanto, acabam se tornando ineficientes. O método aqui descrito prova a proficuidade do estudo para aplicações em diversas análises ambientais, já que o método cromatográfico é rápido e se mostrou sensível para variantes de microcistina. Já a cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) (dados não mostrados) apresentou dificuldades iniciais para achar uma fase móvel (eluição isocrática) para eluir todo material presente em uma amostra real com e sem prévia purificação e concentração. Desse modo, conclui-se que após a etapa para acertar o tipo e quantidade de solventes, a CLAE é um ótimo caminho para extração de microcistinas. Também se tentou fase móvel com acetonitrila, mas os resultados finais não foram conclusivos (dados não mostrados). Quanto aos experimentos de calorimetria, procurouse fixar as condições experimentais dos ensaios térmicos para se obter melhores resultados. Estes foram apresentados neste trabalho e mostram de forma sutil a variação endotérmica da reação antígeno-anticorpo de microcistina aos 35 C. Isto pode sugerir que a detecção desse peptídeo tóxico
pode ser feita através de ensaios térmicos, observando sempre eventos de entalpia em 35 C. AGRADECIMENTOS Pelas bolsas de IC concedidas pela FAPIC/Reitoria (Puc-Campinas) e CNPq. Este projeto foi financiado com fundos provenientes do PROPESQ (Puc- Campinas) e FAPESP (2003/12529-4). Ao acadêmico Adriano H. Braga pelo auxílio nas análises por DSC. REFERÊNCIAS [1] Bell S G, Codd G A (1996) Detection, analysis and risk assessment of cyanobacterial toxins, p. 109 122. In R. E. Hester and R. M. Harrison (ed.), Agricultural chemicals and the environment. Issues in Environmental Science and Technology no. 5. Royal Society of Chemistry, Cambridge, United Kingdom. [2] Campbell, D.L., et al. (1994) Comparative assessment of the specificity of the brine shrimp and Microtox assays to hepatotoxic (microcystin- LR containing) cyanobacteria. Environ. Toxicol. Water Qual., vol. 9, n. 1, p. 71 77. [3] Carmichael, W. W., et al. (1996) Analysis for microcystins involved in an outbreak of liver failure and death of humans at a haemodialysis center in Caruaru, Pernambuco, Brazil, p. 85 86. In Programa e Resumos, IV Simposio da Sociedade Brasileira de Toxinologia. Universidade federal de Pernambuco, Recife, Brazil. [4] Jochimsen, E. M., et al. (1998) Liver failure and death after exposure to microcystins at a hemodialysis center in Brazil. N. Engl. J. Med., vol. 338, p. 873 878. [5] Khreich, N., et al. (2009) A highly sensitive competitive enzyme immunoassay of broad specificity quantifying microcystins and nodularins in water samples. Toxicon, vol. 53, n. 7, p. 551-559. [6] Ludwig, M., et al. (1999) AFM, a tool for singlemolecule experiments. Appl. Phys. A, vol. 68, p. 173 176. [7] Metcalf, J.S., et al. (2001) Colorimetric Immuno- Protein Phosphatase Inhibition Assay for Specific Detection of Microcystins and Nodularins of Cyanobacteria. Apllied and Environmen. Microbiol., vol. 67, p. 904-909. [8] Spoof, L., et al. (2003) Screening for cyanobacterial hepatotoxins, microcystins and nodularin in environmental water samples by reversed-phase liquid chromatography-electrospray ionisation mass spectrometry. Journal of Chromatography A, vol. 1020, n. 1, p. 105-119. [9] Williams D E, Craig M, Dawe, S C, Kent M L, Andersen R J, Holmes C F B (1997) 14C-labeled microcystin-lr administered to Atlantic salmon via intraperitoneal injection provides in vivo evidence for covalent binding of microcystin-lr in salmon livers. Toxicon, vol. 35, n. 6, p.985 989.