Diagnóstico Laboratorial de Infecções Virais Profa. Claudia Vitral
Importância do diagnóstico laboratorial virológico Determinar a etiologia e acompanhar o curso de uma infecção viral Avaliar a eficácia do tratamento antiviral Diferenciar viroses com sintomas semelhantes Triagem de infecções virais em bancos de sangue Diagnosticar doenças congênitas Determinar o prognóstico ou a conduta a ser tomada com o paciente Estudos epidemiológicos
Ameaça da emergência de infecções virais para a saúde pública Vírus Ebola Vírus Zyka Vírus Chikungunya Vírus da febre amarela Vírus MERS - CoV Importância do diagnóstico laboratorial: Etapa fundamental para o controle das epidemias Podem se disseminar rapidamente e estar associadas com complicações graves Particularmente importante para infecções virais emergentes Confirmação laboratorial necessária em virtude da similaridade dos aspectos eventos clínicos e epidemiológicos de muitas doenças infecciosas
Diagnóstico Laboratorial de Viroses MÉTODOS DIRETOS MÉTODOS INDIRETOS Isolamento viral Detecção de antígenos virais Detecção do genoma viral Pesquisa de anticorpos específicos (sorologia) 4
Onde procuramos os vírus ou os anticorpos formados contra eles? 5
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Escolha da amostra biológica: Vias de entrada Trato respiratório Aparelho respiratório Nariz e boca Conjuntiva Conjuntiva Ferida Trato Aparelho digestivo Artrópode Trato urogenital Aparelho urogenital Ânus Pele Pele Capilares
Obtenção da amostra apropriada Etapa mais importante do diagnóstico laboratorial : requer o conhecimento da cinética viral nos vários tipos de espécimes com relação ao tempo desde o início dos sintomas Precisa saber não somente o que coletar como quando coletar.
Escolha da amostra biológica para diagnóstico Infecções entéricas FEZES Infecções respiratórias, urogenitais e oculares SECREÇÕES CORPORAIS Qualquer infecção SANGUE Infecções dérmicas, biópsias TECIDOS Infecções do SNC LIQUOR
Secreções corporais Secreção nasal/orofaringe, esperma, secreção vaginal, secreção uretral Coleta pela raspagem de superfícies mucosas com swabs
Tecidos Obtenção por biópsia ou raspagem de lesões (verrugas, vesículas) Incluídos pela parafina Congelados
Fezes e urina 12
Sangue e líquidos corporais Coleta de sangue por punção venosa Coleta de líquor por punção lombar
Métodos de diagnóstico laboratorial MÉTODOS DIRETOS Isolamento viral
Isolamento viral Sistemas celulares:: Vantagens: alta sensibilidade, método padrão de diagnóstico, permite a detecção de um vírus desconhecido Desvantagens: método lento, alto custo e realização complexa
Isolamento viral em cultivo celular Exemplo: Investigação do vírus da poliomielite em um caso de paralisia flácida aguda Amostra biológica
Isolamento viral: metodologia 1. Tratamento de amostras biológicas 2. Inoculação em cultura celular em fluxo laminar
3. Reconhecimento da replicação viral (efeito citopático) A B (A) Células Vero não infectadas e (B) após infecção por poliovírus, mostrando a perda da monocamada
3. Confirmação do vírus isolado A confirmação da identidade viral pode ser realizada por testes imunológicos (imunofluorescência, ELISA) ou técnicas moleculares Elisa PCR IF
Métodos de diagnóstico laboratorial MÉTODOS DIRETOS Detecção de antígenos virais: IF ELISA
Para pesquisar um antígeno é preciso ter... O anticorpo correspondente E como fazemos pra enxergar a reação Ag/Ac? *Corante fluorescente *Enzima *Marcando esse anticorpo
IMUNOFLUORÊSCENCIA Exemplo: Diagnóstico de raiva
Raiva humana Transmitida principalmente partir de caninos, felinos, macacos (saguis) e quirópteros. O diagnóstico da raiva se baseia na pesquisa do antígeno viral no tecido nervoso de animais com suspeita da raiva, cujo resultado é de fundamental importância para o tratamento profilático humano pós-exposição Método de diagnóstico laboratorial: Imunofluorescência direta
Imunofluorescência (IF) 1. Adição da amostra teste (tecido nervoso) na lâmina de IF 2. Adição do anticorpo específico marcado Observação da fluorescência no microscópio 24
ENSAIO IMUNOENZIMÁTICO Exemplo: Triagem de portadores do vírus da hepatite B (HBV)
Hepatite B A triagem de portadores do HBV em bancos de sangue se baseia na pesquisa do antígeno viral (HBsAg) em amostras de soro Método de diagnóstico laboratorial: ELISA direto
Ensaio imunoenzimático (ELISA): 1. Adição da amostra teste (Ag) em cavidade de placa contendo o anticorpo específico 2. Adição de anticorpo marcado com uma enzima substrato Ac+ enzima 3. Adição do substrato da enzima em solução cromógena com desenvolvimento de cor amostra 27
Métodos de diagnóstico laboratorial MÉTODOS DIRETOS Detecção do genoma viral: Hibridização molecular PCR
Hibridização in situ Exemplo: Diagnóstico da infecção pelo papilomavírus humano (HPV)
Papilomavírus O diagnóstico da infecção pelo HPV se baseia na pesquisa do genoma viral em tecido, p.ex., biópsia cervical (tecido parafinizado) Método de diagnóstico laboratorial: Hibridização in situ
Para pesquisar uma sequência nucleotídica em células de um tecido é preciso ter... A sequência nucleotídica complementar (sonda) E como fazemos pra enxergar a formação do híbrido? 1. Marcando a sonda (p.ex. enzima) 2. Adicionando em seguida o substrato em solução cromógena: desenvolvimento de cor
Reação em cadeia da polimerase (PCR) Exemplo: Diagnóstico da infecção pelo vírus da hepatite C (HCV)
Hepatite C O diagnóstico da infecção pelo HCV se baseia na pesquisa do genoma viral no soro Método de diagnóstico laboratorial: PCR
Para amplificar uma sequência nucleotídica é preciso ter... Todos os componentes necessários para fazer o DNA
Amplificação do genoma viral pela PCR Amplificação exponencial in vitro de uma sequência específica do genoma viral pelo uso de uma polimerase termoestável em uma reação termocíclica Visualização do fragmento de DNA amplificado em gel de agarose 35
Métodos de diagnóstico laboratorial Pesquisa de anticorpos (sorologia) MÉTODOS INDIRETOS
Anticorpos importantes no controle da infecção viral: IgM: marcador de infecção aguda diagnóstico de infecção congênita IgG: imunidade passada resposta vacinal IgA: imunidade de mucosa (trato respiratório, trato gastrointestinal) www.panbio.com.au
Pesquisa de anticorpos para fins de diagnóstico viral Pesquisa de IgM Diagnóstico de infecções agudas recentes: mononucleose infecciosa, hepatite A, hepatite B, rubéola, dengue Pesquisa de IgG Investigação de infecção passada: pré-natal (CMV, EBV, rubéola, hepatite B, HIV), resposta vacinal (HBV), ou infecção crônica (HIV, HCV)