PROTOCOLO PARA DETERMINAÇÃO DE NITRATO+NITRITO (NID) DISSOLVIDOS NA ÁGUA DO MAR

PROTOCOLO PARA DETERMINAÇÃO DE NITRATO+NITRITO (NID) DISSOLVIDOS NA ÁGUA DO MAR Introdução No ciclo do nitrogênio, os íons nitrito representam o estado de oxidação intermediário entre o amônio e o nitrato. Nas águas oceânicas, as concentrações são baixas, podendo ser até menores de 0,1μM N-NO2 -. Nas águas costeiras elas são na ordem de 0,01 a 1μM. Em fracas concentrações de oxigênio, pode haver redução do nitrato (denitrificação), elevando as concentrações de nitrito. Já o nitrato O nitrato é a forma oxidada mais estável do nitrogênio em solução aquosa. É regenerado por via bacteriana (nitrificação) a partir do nitrogênio orgânico. A produção de nitrato resulta da oxidação enzimática do amônio, tendo o NO2 como intermediário. No processo fotossintético, o amônio é a forma diretamente assimilável pelos organismos, enquanto que o nitrato deve passar, obrigatoriamente, à forma de amônio dentro da célula (Carmouze, 1994). A velocidade de regeneração é, em geral, menor do que a de assimilação pelos produtores primários, resultando em fracas concentrações de nitrato, principalmente no meio oceânico. Nas águas costeiras, as concentrações normais são na ordem de 10 a 15μM N-NO3 (Aminot & Chaussepied, 1983). Princípio do método O método fundamenta-se na dosagem dos íons nitritos (reação de Griess) obtidos por redução quantitativa (maior de 90%) dos íons nitratos presentes na amostra. Logo, se mede a soma das concentrações dos íons nitritos e nitratos. O complexo colorido deve ser lido num comprimento de onda de 543 nm. Deduz-se a concentração em nitrato, subtraindo-se o nitrito original da amostra da concentração de nitrito total dosado (somatório destes NO2 com o NO3 reduzido). A redução do nitrato é efetuada pela passagem da amostra por uma coluna redutora preenchida por grãos de cádmio tratados com solução cúprica (cádmio envelopado com cobre). Interferentes e precisão do método Fosfato: quando em altas concentrações, causam decréscimo na coloração final da reação. O efeito do fosfato é gradual e aumenta com o uso da coluna. Concentrações de 2,5 μm P-PO 4-3 reduzem o resultado final de nitrato em 10% e concentrações de 25 μm P-PO 4-3, em 40%. Esta interferência dar-se-ia na superfície do metal, onde se adsorveria o fosfato. Quando as amostras têm muito fosfato e nitrato simultaneamente, dilui-se antes de passá-las pela coluna. OBS: Esta análise precisa ser feita utilizando volume mínimo de 35 ml de amostra, não é possível realizá-la em microvolumes. Devido a estabilidade da coluna, só é possível ler no máximo 30 amostras por dia. Para esta análise, lê-se apenas a curva em triplicata, inserindo o mesmo frasco de reação no aparelho três vezes, entretanto as amostras são inseridas apenas uma vez, ou seja, não são lidas em triplicata. Dicas importantes: - Para as análises os reagentes devem estar em temperatura ambiente, por isso devem ser retirados antecipadamente da geladeira. - Sempre separar em béqueres de 10 ml uma pequena parcela de solução padrão para a análise, e em béqueres de 50 ml os reagentes que serão utilizados, e imediatamente retornar os frascos à geladeira, para melhor conservá-los. - Jamais pipetar nos frasco de estocagem original: 1

a. Retirar uma alíquota de 5 ml da solução padrão mãe e acondicionar em Becker de 10 ml específico de NO 2 e NO 3. Cobrir com papel toalha ou alumínio para evitar poeira e contaminação durante a aclimatação; (Reserve o volume que utilizou para ambientar o frasco para utilizar posteriormente no teste de reagente). d. Retirar o volume de R1 e R2 necessário para as análises que fará no dia, considere o volume necessário para ambientar as pipetas e frascos, fazer o teste de reagente e fixação das amostras (curvas e leituras); - Jamais devolver o reagente ou a solução mãe que sobrou nas vidrarias de trabalho para os frascos de estocagem. Por isto economize e organize o volume que irá usar no dia. 1. Materiais necessários 1.1. Equipamentos a serem utilizados Espectrofotômetro HITACHI 2900 Balança analítica Estufa Capela exaustora Dessecador com sílica gel Bomba peristáltica com mangueiras de silicone 2 colunas de vidro em U (OBS: o protocolo para preparação das colunas consta no ANEXO 1 deste protocolo) 1.2. Vidraria e materiais diversos a serem utilizados (previamente lavados em ácido) 11 balões volumétricos de 100 ml (com tampa esmerilhada) 1 balão de 200 ml 2 balões de 500 ml 2 balões de 1 L 4 béqueres de 10 ml 16 béqueres de 100 ml (4 béqueres serão utilizados passar as amostras pelas colunas, e devem ter a graduação exatamente igual, mesma marca, para facilitar a visualização dos volumes passados pela coluna) 2 béqueres de 250 ml 3 béqueres de 500 ml 2 provetas de 50 ml 1 proveta de 500 ml 1 proveta de 1 L Pipeta automática volumétrica de 10 ml e ponteiras descartáveis Frascos de reação âmbar de 50 ml 1 bastão de vidro 1 seringa de 15 ml 1 seringa de 1 ml Espátula de inox com colher 2 Tubos de reação graduados de 15 ml OBS: Esta quantidade de vidraria foi listada considerando a preparação dos reagentes, dos padrões e análises feitas no mesmo dia. Devido à análise ser bastante demorada, recomendase preparar todos os reagentes no dia anterior. A solução tampão pode ser feita no dia anterior e usada apenas por um dia, se sobrar solução após trabalho esta deve ser descartada. Neste caso as vidrarias podem ser lavadas e secas, e usadas também para as análises, o que despende menor número de material. 2

2. Preparo dos reagentes necessários: a. Solução de Sulfanilamida-0,06 M (R1) Realizar esta etapa dentro da capela, devido ao uso de ácido. Utilizar luvas e avental. - Utilizando uma proveta de 50 ml, medir este volume de HCL, tomando muito cuidado; Diluir este ácido em 300 ml de água destilada, usando proveta de 500 ml; Jamais colocar a água no ácido, explode!! É sempre o ácido na água. - Pesar com auxílio de béquer de 100 ml, na balança analítica, 5 g de sulfanilamida cristalina, com espátula de inox; - Dissolver o sal com um pouco da solução anterior; - Transferir sal dissolvido e resto da mistura ácida para balão de 500 ml, não se esquecendo de lavar o bastão e o béquer com água destilada dentro do balão, evitando desperdício do sal; - Completar com água destilada e ajustar menisco com seringa de 1 ml; - Homogeneizar a solução por 10X, invertendo e agitando o balão. Este reagente é estável por no máximo dois (2) meses. b. NED 0,003 M (R2) -Pesar em béquer de 100 ml na balança analítica 0,5 g de dihidrocloreto de N (1 Naftil) etilenodiamida (NED), usando uma espátula de inox; - Dissolver o sal com auxílio de bastão de vidro em pequena quantidade de água destilada; - Tranferir solução para balão de 500 ml, não se esquecendo de lavar bastão de vidro e béquer com água destilada e passar para balão para não desperdiçar o sal; - Completar a 500 ml com água destilada, ajustando o menisco com seringa de 1 ml. - Homogeneizar a solução por 10X, invertendo e agitando o balão. Este reagente é estável por um (1) mês. c. Solução tampão de cloreto de amônio (0,2 M) Realizar especialmente este procedimento dentro da capela, devido à toxicidade e volatilidade do reagente. - pesar 10g de NH 4Cl e diluir para 1L de água destilada (aferir em balão volumétrico). Se for fazer entre 20-25 amostras em um dia, preparar 3 L desta solução. - Armazenar em garrafa de plástico com tampa. - Para cada litro de solução, inserir 1,5 ml de hidróxido de amônia PA, para ajustar o ph da solução, a qual deve ser de ~8.5. - Homogeneizar. OBS: Deve ser feito no dia da análise, ou no dia anterior. Deve ser armazenada em garrafa de plástico fechada, pois é volátil. Colocar uma pequena quantidade da solução em um béquer e medir o ph com auxílio de phmetro. Seringa identificada (amônia), não utilizar pipeta automática. 3

Utilizando o phmetro (Alfa Kit): 1. Ligar 2. Passar água destilada no sensor 3. Colocar o sensor na solução do phgâmetro que fica na porta da geladeira, específico da Alfa Kit 4. Deixar estabilizar em ph 7 5. Lavar novamente com água destilada 6. Ler a amostra (tampão) Soluções padrão: I. NITRATO a. Solução estoque (10 M) - Pesar aproximadamente 1,5 g de nitrato de potássio (KNO 3) anidro em um béquer de 100 ml, na balança analítica, com ajuda de espátula de inox; - Secar em estufa a 100 C por uma hora; - Deixar esfriar em dessecador com sílica; - Pesar exatamente 1,0011g do sal seco na balança analítica; - Diluir o sal em um pouco de água destilada usando bastão de vidro; - Transferir solução para balão de vidro de 1 L, não se esquecendo de lavar bastão de vidro e béquer com água destilada e passar para balão para não desperdiçar o sal; - Completar o volume com água destilada, ajustando o menisco com auxílio de seringa de 1 ml. Esta solução é bastante estável. b. Solução intermediária (100 um) - Ambientar a ponteira da pipeta automática 3X com solução padrão, descartando; - Pipetar 2 ml da solução padrão de NO 3 (10.000 µm) no balão volumétrico e diluir para 200 ml com água destilada, ajustando o menisco com auxílio de seringa. - Homogeneizar a solução por 10X, invertendo e agitando o balão. II. Uma alíquota da amostra irá ser usada para ativar as colunas redutoras. NITRITO a. Solução estoque (10 M) - Pesar aproximadamente 1 g de nitrito de sódio anidro (NaNO 2) em um béquer de 100 ml, na balança analítica, com ajuda de espátula de inox; - Secar em estufa a 100 C por uma hora; - Deixar esfriar em dessecador com sílica; - Pesar exatamente 0,690 do sal seco na balança analítica; - Diluir o sal em um pouco de água destilada usando bastão de vidro; - Transferir solução para balão de vidro de 1 L, não se esquecendo de lavar bastão de vidro e béquer com água destilada e passar para balão para não desperdiçar o sal; - Completar o volume com água destilada, ajustando o menisco com auxílio de seringa de 1 ml. Esta solução é bastante estável. 4

b. Solução intermediária (100 um) - Ambientar a ponteira da pipeta automática 3X com solução padrão, descartando; - Pipetar 1 ml da solução padrão de NO 2 (10.000 µm) no balão volumétrico e diluir para 100 ml com água destilada, ajustando o menisco com auxílio de seringa. - Homogeneizar a solução por 10X, invertendo e agitando o balão. Teste: Fazer o teste de reagentes para certificar que está funcionando. Este teste é grosseiro, somente a calibração irá indicar se está no padrão de qualidade exigido. Em um béquer de 10 ml, adicionar R1 (Sulfanilamida) e R2 (solução de NED) numa alíquota de padrão para nitrato (NO 3) e em outro béquer adicionar uma para nitrito (NO 2). Ao adicionar os reagentes, deve ser produzida solução de cor rosa forte para nitrito e transparente para nitrato. 3. Preparando soluções diluídas para a curva - Preparar 11 balões volumétricos de 100 ml, ambientando- os com água destilada e completando-os até a metade do volume com auxílio de béquer de 100 ml; - Cada balão deve estar identificado com a concentração final das soluções que serão preparadas para a curva, a partir das soluções intermediárias, no momento do uso: Tabela 1: Exemplos das diluições da curva, para nitrito e nitrato. NITRITO NITRATO 100 µm NO3 100 µm NO2 BRANCO A BRANCO B BRANCO A BRANCO B 1,0 µm A 1,0 µm B 1,0 µm A 1,0 µm B 2,0 µm A 2,0 µm B 2,0 µm A 2,0 µm B 4,0 µm A 4,0 µm B 4,0 µm A 4,0 µm B IMPORTANTE: NO MOMENTO DE PASSAR AS AMOSTRAS DA CURVA, A ORDEM A SER SEGUIDA É A MESMA DO QUADRO, COMEÇANDO COM AS AMOSTRAS DE NITRITO E DEPOIS NITRATO, E DA MENOS CONCENTRADA PARA AS MAIS CONCENTRADAS. - Trocar a ponteira da pipeta sempre que trocar de solução e ambientar 3X com as soluções intermediárias. - Reservar os balões, que serão utilizados assim que a bomba e coluna estiverem prontos. 4. Preparação da bomba peristáltica 5

Figura 1: Bomba peristáltica. 1. Colocar a bomba peristáltica na bancada na qual se irá trabalhar, e montá-la, passando as mangueiras de silicone pelos canais de condução das mesmas e apertando os parafusos; 2. Ligar a bomba na tomada; 3. Encher dois béqueres de 100 ml com água recém destilada e colocar as mangueiras de entrada nestes (uma em cada béquer A e B); 4. Colocar as mangueiras de saída da bomba (A e B) em dois béqueres de 100 ml vazios (descartes); 5. Ligar a bomba (botão de metal na lateral) e deixar passar a água destilada dos béqueres cheios para os vazios; 6. Descartar soluções passadas em béquer para descarte (500 ml); 7. Passar aproximadamente 100 ml de tampão nas mangueiras (idem); 8. Encher novamente dos béqueres de entrada de amostra com tampão e descartar os de saída; 9. Com auxílio de dois béqueres de 250 ml, acomodar as duas colunas retiradas da caixa de armazenamento, com muito cuidado, pois são frágeis; 10. Solta-se um lado da mangueira da coluna, e tapa-se imediatamente a coluna com o dedo, no local onde a mangueira foi retirada; 11. O lado solto da mangueira deve ser acomodado dentro do béquer com tampão; 12. Verificar se há bolha dentro da coluna, caso haja, proceder da seguinte forma: - Colocar o béquer com tampão em cima da bomba, com a mangueira dentro; - Soltar a outra mangueira; - Esperar soltar uma gota de tampão na superfície da abertura, que irá ocorrer pela gravidade; - Encher uma seringa de 15 ml com tampão e injetar na coluna, acompanhando o andamento da bolha até a sua saída no béquer com tampão; - Inserir a mangueira novamente na coluna, fechando-a; - Colocar o béquer com tampão novamente na bancada e seguir com a análise. 6

13. Passar aproximadamente 200 ml de tampão nas colunas, a fim de tirar possíveis bolhas formadas na sua montagem e renovar o tampão das colunas; ATENÇÃO: Sempre cuidar o volume de tampão disponível nos béqueres de entrada de amostra, em caso de proximidade de esgotamento, desligar rapidamente a bomba peristáltica, pois caso o béquer seque, entrará bolha na coluna, e o ar oxida o cádmio, e o nitrato não é mais reduzido a nitrito, prejudicando a análise. 14. Ao término da passagem de solução tampão pelas colunas, deve-se verificar o fluxo de passagem da amostra pelas mesmas. O fluxo deverá estar entre 5 e 8 ml/min: - Na saída das mangueiras, colocar dois tubos de ensaio de 15 ml; - Com auxílio de cronômetro, ligar a bomba e deixar o tampão passar durante exatos 1 minuto; - Durante este tempo, os tubos de ensaio devem conter preferencialmente 7 ml de volume, em ambos os tubos; - Para conseguir esta medida, deve-se regular tanto o botão de fluxo na frente da bomba, que deve ficar aproximadamente entre 10 e 12 e também pode-se apertar ou soltar os parafusos da cerâmica branca onde passam as mangueiras. - Só se roda as amostras com os fluxos em aproximadamente 7 ml/min, e estando iguais as duas colunas. 15. Ativar as colunas com uma mistura de 50% solução padrão de 100 um de NO 3 + 50 de solução tampão, passando aproximadamente 100 ml de cada; 16. Passar bastante tampão para limpar as colunas. Figura 2: Conjunto de materiais utilizados para a análise de nitrito+nitrato sobre a bancada. 5. Analisando Geral: - Separar os frascos em ordem crescente de numeração; 7

- Organizar as amostras em ordem crescente de numeração, manter sempre a ordem para facilitar no planilhamento dos dados; - Descongelar as amostras até temperatura ambiente e homogeneizá-las calmamente por 10 X (pode-se utilizar ventilador para acelerar o processo de descongelamento); - Lembrar-se de rodar uma amostra da solução de concentração conhecida Merk, que servirá também para se ter certeza de que o método está bem calibrado; - Anotar em caderno o número do frasco em que a amostra foi acondicionada; - Lembrar-se de sempre passar água destilada na proveta 3 x entre uma amostra e outra, além da ambientação com a amostra! Análise: - Medir, com auxílio da proveta de 50 ml, 35 ml de água destilada, para o branco A e para o branco B; - Transferir volume para o béquer de entrada, sendo uma entrada A e outro na entrada B; - Novamente, com auxílio da proveta, aferir 35 ml de tampão e adicionar nos béqueres, ficando, então, 50% de água destilada + 50% de solução tampão; - Anotar sempre em qual coluna se está passando cada amostra: A ou B, assim como número da amostra, frasco em que a mesma está reagindo, e número de leitura da amostra no espectro. IMPORTANTE: No espectrofotômetro será gerada uma curva para as coluna A e outra curva para a coluna B, uma para nitrito e outra para nitrato. Deve ser salva apenas a curva de nitrato (A e B), a de nitrito serve apenas para verificar a eficácia de redução da coluna. Deve-se rodar as amostras A a partir da curva a e B, idem. - Nas mangueiras de saída, colocar os frascos âmbar já identificados, que receberão as amostras; - Deixar passar as amostras do volume de 80 ml até 60 ml; - Fechar os frascos âmbar, ambientar e descartar; - Ambientar pela segunda vez, do 60 ml até o 50 ml; - Recolher a próxima fração de 50 ml até 20 ml, fechando os frascos âmbar e reservando para posteriormente adicionar os reagentes; - Realizar então o mesmo procedimento para as amostras da curva, sempre passando 50% de tampão + 50% de amostra (35 ml de cada), passando primeiramente as amostras de nitrito menos concentradas, e depois as de nitrato e anotando em qual curva passa cada uma; - Após todas as amostras terem passado pela curva e armazenadas nos frascos de reação: - Ambientar a pipeta com os reagentes, lembrando-se de usar ponteiras diferentes para cada reagente; - Adicionar 1 ml de R1 e agitar; - Adicionar 1 ml de R2 e agitar; - Anotar a hora em que terminar de adicionar os reagentes; - Após 20 a 30 minutos de reação, ler a absorbância à 540 nm em espectrofotômetro; - As amostras passadas na coluna A devem ser lidas na curva de nitrato A, e as amostras passadas na coluna B devem ser lidas na curva de nitrato B. - Em caso de a curva apresentar uma boa calibração, rodam-se as amostras, seguindo-se os mesmos procedimentos descritos anteriormente; - Salvar os dados. - Jogar os dados na planilha de Excel (ANEXO 2) para corrigir o erro do branco e solução tampão. Guardando as colunas, ao final da análise: 8

- Passar aproximadamente 200 ml de solução tampão pelas colunas; - Desconectar a mangueira da coluna da bomba; - Conectar a mangueira de entrada da amostra no outro lado da coluna, a fim de fechá-la. Lembrando que o procedimento deve ser feito pressionando-se o final da mangueira, para evitar entrada de ar na mesma e na coluna; - Repetir procedimento para a outra coluna; - Guardar ambas as colunas dentro da caixa específica para as mesmas. No caso de sobra de solução tampão utilizada no dia, deve-se retirar um pouco da solução antiga da caixa e repor com o restante da nova, a fim de melhor conservar as colunas; - Ainda deve-se passar aproximadamente 200 ml de água destilada pelas mangueiras da bomba peristáltica, antes de guardá-la. Referências Bibliográficas (Metodologia) Methods of seawater analysis / ed. by Klaus Grasshoff... With contributions by Leif Anderson; Constant van den Berg. - 3., completely rev. and extended ed. - Weinheim; New York; Chiester; Brisbane; Singapore; Toronto: Wiley-VCH, 1999. Avaliação ambiental de estuários brasileiros: diretrizes metodológicas/organizadores. Paulo da Cunha Lana... [et al.]. Rio de Janeiro : Museu Nacional, 2006. 156p., 28 cm (Série Livros, 22). Projeto RECOS Uso e Apropriação de Recursos Costeiros, Grupo Temático Biodiversidade e Qualidade Ambiental. ANEXO 1 PREPARAÇÃO DAS COLUNAS DE CÁDMIO 1) Solução de sulfato de cobre (0,2 M) 2) Cádmio Dissolver 10g de CuSO4.5H2O em 1L de água destilada. Peneirar o cádmio granulado em peneira de 2 mm e separar a fração retida na peneira de 0,5 mm para o enchimento da coluna de redução. 3) Solução de ácido clorídrico (2 M) Diluir 165,5 ml de HCl concentrado P.A. (d = 1,19) em 500 ml de água deionizada e completar para 1L. 4) Preparação das colunas de redução a. O cádmio granulado deve ser lavado com a solução de HCl 2M para a liberação dos óxidos e enxaguado com água destilada na seringa de 60 ml por 3 vezes. 9

b. Adicionar a solução de sulfato de cobre em quantidade suficiente (~ 5 vezes o peso do cádmio) e agitar vagarosamente por 3 minutos, ou até que a coloração azul desapareça e não haja cobre disperso. c. Enxaguar o cádmio com água destilada, evitando contato com o ar. d. Colocar lã de vidro na coluna e encher a mesma com tampão (NH4Cl). Colocar o cádmio cuperizado no interior da mesma. e. O empacotamento dos grãos deve ser feito com suaves batidas na coluna de vidro. f. Quando estiver toda preenchida com cádmio, colocar lã de vidro na outra extremidade da coluna. ANEXO 2 10

PLANILHA DE EXCEL PARA CORREÇÃO DOS DADOS DE NITRITO+NITRATO, DESCONTANDO VALORES DE BRANCO E TAMPÃO Data análise Br. Cubeta Abs Reta Calibração Absorbância Concentração fator Coluna A x y xy x² y² 7/5/2014 1 0 coluna A 0,130 1,000 7,7 0,130 1,000 0,13 0,0169 1 para BR1 A 0,11 1 0,110 0,03666667 0,1369 9 m 9,0909 Fator e deve ser entre 8 e 12 calibração BR2 B 0,11 2 0,110 0,055 b -0,182 Abs - 50% BrH20 [ ] µm [ ] µm 0,1225 9 m 9,0909 Fator e deve ser entre 8 e 12-0,03666667-0,152 b -0,091 21/jan 0,120 0,12 0,07 0,682 r 1 0,100 0,1 0,06333333 0,758 0,110 0,11 0,06 0,591 0,100 0,1 0,06333333 0,758 NO2 1,00 0,13 100 96 0,110 0,11 0,06 0,591 NO3 1,00 0,130 0,100 0,1 0,06333333 0,758 NO2 2,00 0,260 92 0,110 0,11 0,06 0,591 NO3 2,00 0,240 0,100 0,1 0,06333333 0,758 0,120 0,12 0,07 0,682 NO2 1,00 0,130 92 92 0,100 0,1 0,06333333 0,758 NO3 1,00 0,120 0,110 0,11 0,06 0,591 NO2 2,00 0,250 92 0,100 0,1 0,06333333 0,758 NO3 2,00 0,230 Padrões Frasco Coluna 2 0 0,240 2,000 8,3 0,240 2,000 0,48 0,0576 4 3 0 coluna B 0,120 1,000 8,3 0,230 2,000 8,7 n SUM x SUM y SUM xy SUM x² SUM y² 2 0,370 3,000 0,610 0,075 5,000 A B A B Abs lida cub Abs - Br cub Abs - 50% BrH20 Abs - 50% BrH20 Abs - Br H20 Abs - Br H20 1,0 NO2 A 0,24 3 0,240 0,130 r 1 1,0 NO2 B 0,24 1 0,240 0,130 Coluna B x y xy x² y² 1,0 NO3 A 0,24 2 0,240 0,130 0,120 1,000 0,12 0,0144 1 1,0 NO3 B 0,23 3 0,230 0,120 0,230 2,000 0,46 0,0529 4 2,0 NO2 A 0,37 1 0,370 0,260 2,0 NO2 B 0,36 2 0,360 0,250 n SUM x SUM y SUM xy SUM x² SUM y² 2,0 NO3 A 0,35 3 0,350 0,240 2 0,350 3,000 0,580 0,067 5,000 2,0 NO3 B 0,34 1 0,340 0,230 Amostra Frasco coluna Abs Cubeta Abs - Br cub Abs - 50% BrH20 (SUM x)² (SUM x)² coluna A coluna 2 (SUM y)² (SUM y)² Eficiência das colunas redutoras y=mx+b y=mx+b [ ] P Abs % média [ ] P Abs % média 11