AMPLIFICAÇÃO CFTR. Instruções de Uso

AMPLIFICAÇÃO CFTR Instruções de Uso USO PRETENDIDO O kit de Amplificação CFTR, para uso in vitro, destina-se à amplificação multiplex dos ácidos nucleicos respectivamente às regiões 8 (éxon/íntron4, íntron5, éxon10, íntron10/éxon11, íntron12, íntron16, éxon20 e éxon21) e 11 (éxon2, íntron1/íntron3, éxon3, éxon7, íntron8/éxon9, éxon13, íntron14b, éxon17a, íntron17a/éxon17b, éxon19 e íntron19) do gene regulador humano da Condutância Transmembrana da Fibrose Cística (CFTR) em duas reações separadas. A reação é baseada na reação em cadeia da polimerase (PCR). PRINCIPÍO DO TESTE A amostra de DNA a ser amplificada por PCR é introduzida em uma mistura de reagentes contendo um excesso de deoxinucleosido 5'-trifosfatos (dntps), iniciadores ("primers") com biotina, e Hot Start Taq DNA polimerase. Os primers fazem uma co-amplificação do éxon/íntron4, íntron5, éxon10, íntron10/éxon11, íntron12, íntron16, éxon20, éxon21 e éxon2, íntron1/íntron3, éxon3, éxon7, íntron8/éxon9, éxon13, íntron14b, éxon17a, íntron17a/éxon17b, éxon19, íntron19, respectivamente, do gene CFTR. Por aquecimento, as duas cadeias da hélice de DNA são separadas (desnaturação) de modo a expor as sequências-alvo aos primers. Esses primers são complementares das regiões que acompanham a sequência-alvo. Por esse motivo, por resfriamento a uma temperatura específica, os primers emparelham-se à sua região alvo (annealing). Em outra temperatura, e utilizando as dntps, a Taq DNA polimerase Hot Start faz uma extensão dos primers ligados ao longo do alvo padrão (extensão). Deste modo, são produzidas duas cópias biotiniladas exatas da sequência padrão após um ciclo de desnaturação, anelamento ("annealing") e extensão. Após 30 ciclos, obtêmse sequências alvo biotiniladas multi-amplificadas. REAGENTES Descrição, modo de preparo e condições de armazenamento - Se conservados entre -15/-25 C nos frascos originais, os reagentes são estáveis até o prazo de validade indicado no kit. Contudo, é recomendado fazer alíquotas dos reagentes após a primeira utilização e conservar, então, entre -15/-25 C. Não usar os reagentes com o prazo de validade expirado. 1

- Todos os reagentes (exceto a Taq Hot Start) devem estar à temperatura ambiente (20-25 C) aproximadamente 60 minutos antes de serem utilizados e devem ser imediatamente congelados depois de usados. - Os reagentes devem ser mantidos isolados de qualquer fonte de contaminação de DNA, especialmente produtos amplificados. - Alterações do aspecto físico dos componentes do kit podem indicar instabilidade ou deterioração. REAGENTES FORNECIDOS COMPONENTES QUANTIDADE DESCRIÇÃO Tampão de Amplificação (tampa de rosca transparente) Solução de Primer parte 1 (tampa de rosca amarela) Solução de Primer parte 2 (tampa de rosca verde) 2 x 0,3 ml 1 x 0,3 ml 1 x 0,3 ml Contém todas as dntps e 0.05% de NaN 3 como conservante. Deixar descongelar completamente antes de usar. Contém primers biotinilados, MgCl 2 e 0.05% de NaN 3 como conservante. Deixar descongelar completamente para permitir dissolver completamente o MgCl 2 antes de usar e atingir os 20-25 C. Contém primers biotinilados, MgCl2 e 0.05% de NaN3 como conservante. Deixar descongelar completamente para permitir dissolver completamente o MgCl2 antes de usar e atingir os 20-25 C. MATERIAIS NECESSÁRIOS, MAS NÃO INCLUSOS - Material para extração de DNA - Luvas descartáveis - Ponteiras de pipeta descartáveis (de preferência com filtro) - Microtubos esterilizados - Suporte para microtubos - Centrífuga para microtubos - Equipamento Termociclador - Pipetas ajustáveis para dispensar 1-10 µl, 1-20 µl, 20-200 µl, e 200-1000 µl - Água destilada autoclavada - Taq DNA polimerase Hot Start 2

SEGURANÇA E MEIO AMBIENTE - As amostras devem ser processadas como potencialmente infecciosas. - É necessário o uso de equipamento de proteção pessoal: luvas e óculos de segurança quando manipular agentes perigosos ou infecciosos. - O material de descarte deve ser manipulado de acordo com as linhas de orientação da instituição. Todas as regulamentações estatais e locais sobre meio ambiente devem ser respeitadas. AMOSTRAS (PREPARO E CONSERVAÇÃO) Reagentes não fornecidos. Extração de DNA: a partir de sangue total Podem ser usados os métodos de extração de DNA por salting-out ou métodos baseados em colunas de centrifugação para preparar o DNA genômico, partindo de amostras de sangue total colhidas com anticoagulante ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA). Conservar as amostras de DNA entre -15/-25 C. O DNA extraído deve ter uma concentração 0,02 ug/µl. A pureza (A260nm/A280nm) deve ser 1,5. Extração de DNA: a partir de lavados bucais Preparo de soluções 1. Solução de NaOH 50 mm: Dissolver 0,2 g de pastilhas de NaOH em 50 ml de H 2 O destilada autoclavada. Ajustar o volume a 100 ml. 2. Tampão Tris-HCl 1 M ph 8.0: Dissolver 12,11 g de Tris-HCl em 50 ml H2O destilada autoclavada. Ajustar a ph 8.0 com HCl 5 M. Ajustar o volume a 100 ml. Protocolo - Colher células bucais com uma escova estéril girando a escova no interior da bochecha durante 30 segundos. - Preparar imediatamente o DNA dessas células ou conservar em temperatura ambiente ou a 4 C. 3

- Imergir a escova em um tubo de microcentrifuga em polipropileno contendo 600 µl de NaOH a 50 mm e agitar no vortex. - Aquecer o tubo contendo a escova a 95 C durante 5 min. - Remover a escova cuidadosamente. - Neutralizar a solução de DNA com 60 µl de Tampão Tris 1 M a ph 8.0 e vortex. - Depois do preparo, conservar o DNA das células bucais entre 2-8 C ou entre -15/-25 C. Extração de DNA: a partir de manchas de sangue seco Preparo das soluções 1. Solução NaCl 10 mm/edta 10 mm: Dissolva 0,058 g de NaCl e 0,38 g EDTA (C10H13N2O8K3.2H2O) em 50 ml de água destilada esterilizada por autoclavagem. Ajuste o volume para 100 ml. 2. Solução NaOH 50 mm: Dissolva 0,2 g de NaOH em 50 ml de água destilada esterilizada por autoclavagem. Ajuste o volume para 100 ml. 3. Tampão Tris-HCl 1M ph 7,5: Dissolva 12,11 g de Tris em 50 ml de água destilada esterilizada por autoclavagem. Ajuste para ph 7,5 com HCI 5M. Ajuste o volume para 100 ml. Protocolo - Faça dois furos de 3 mm no cartão de papel do filtro com um furador da Schleicher & Schüll (S&S) e coloque-os num microtubo de centrifugação de 1,5 ml. - Lave o furador e a pinça com etanol e aqueça-os até ficarem vermelhos após cada utilização para evitar a contaminação cruzada entre amostras. - Adicione 1 ml de NaCl 10 mm/edta 10mM (tampão de lavagem). - Agite durante 20-30 minutos em um agitador de tubos. - Elua o tampão de lavagem. - Repita três vezes este passo de lavagem. - Centrifugue brevemente o tampão de lavagem remanescente em baixa velocidade (2000rpm) e elimine o sobrenadante. - Adicione 150 µl de NaOH 50mM. 4

- Em um bloco que aquecimento, aqueça durante 10 minutos a 98 C. - Neutralize com 30 µl de Tris 1M ph 7,5. - Adicione 20 µl de água HPLC. Preparo da mistura para PCR Cada componente deve ser adicionado e medido nas quantidades certas. Faltas ou excessos de reagentes e amostra podem originar amplificações inespecíficas ou mesmo ausência de amplificação. Ciclos de PCR Deve ser selecionado o perfil de temperatura certo para a Amplificação CFTR. OBSERVAÇÕES E PRECAUÇÕES - Para evitar contaminação de DNA, recomenda-se a máxima separação física entre os passos pré e pós-amplificação: salas separadas, pipetas e outros materiais de laboratório separados, separar batas e luvas (e seu estoque) são as precauções mínimas para uma boa prática de laboratório. - Os reagentes devem ser mantidos isolados de qualquer fonte de contaminação de DNA, especialmente produtos amplificados. Evitar também a contaminação microbiana dos reagentes. - Evitar transitar entre a sala de pós-amplificação para a de préamplificação. - Todas as ponteiras de pipetas e tubos utilizados no processo de amplificação devem ser autoclavados. Recomenda-se o uso de ponteiras de pipetas com filtro. Usar uma ponteira esterilizada nova para cada alíquota de amostra. - Os reagentes para processos de amplificação devem ser manipulados em uma sala livre de DNA amplificado. Devem ser usados tubos e ponteiras de pipetas (de preferência com filtro) autoclavados. - Após descongelamento, agitar no vortex o tampão de Amplificação e soluções de Primer e fazer uma centrifugação rápida (short spin) dos reagentes. PROCEDIMENTO DO TESTE - Este protocolo para amplificação multiplex do éxon/íntron4, íntron5, éxon10, íntron10/éxon11, íntron12, íntron16, éxon20 e éxon21 (usando a Solução de Primer parte 1) e do éxon2, íntron1/íntron3, éxon3, éxon7, íntron8/éxon9, éxon13, íntron14b, éxon17a, íntron17a/éxon17b, éxon19 5

e íntron19 (usando a Solução de Primer parte 2) do gene CFTR foi desenvolvido para uma amplificação otimizada usando tubos de PCR MicroAmp (0,2 ml), termocicladores GeneAmp PCR System 9700, Hot Star Taq (Qiagen) e 2% de gel de agarose. - Este protocolo pode ser usado em diferentes tipos de termocicladores comercializados, mas podem ser necessárias algumas modificações indicadas pelo fabricante do termociclador. - Antes de iniciar, certifique-se que este protocolo é compatível com o termociclador em uso no seu laboratório. Verifique se o termociclador foi calibrado antes de usá-lo. - Tome as precauções necessárias para evitar amplificações não específicas e a formação de dímeros de iniciador ("primer-dimer"), os quais podem comprometer os resultados: Pré-aquecer (95 C) o bloco de aquecimento do termociclador antes de colocar as amostras, e iniciar o processo de ciclos. Agitar os reagentes brevemente no vortex e fazer um short spin, antes de abrir os frascos. - A Taq DNA polimerase Hot Start não está incluída. Cada amostra tem que ser amplificada separadamente com a Solução de Primer parte 1 e Solução de Primer parte 2. O protocolo descrito é idêntico para ambas as amplificações multiplex. Protocolo de Amplificação para DNA de sangue total 1. Diluir cada DNA genômico a uma concentração entre 0,02 e 0.3 µg/µl em tampão TE. 2. Determinar o número N de cada reagente a ser utilizado em que: N = número de amostras de DNA + 1 (controle negativo; sem DNA) + 1 Utilizando ponteiras de pipeta com algodão (cotton-plugged) preparar a mistura (mastermix) num tubo estéril de 1,5 ml: (N x 24.15 µl) água destilada autoclavada + (N x 10 µl) Tampão de Amplificação (tampa transparente) + (N x 10 µl) Solução de Primer parte 1 (tampa amarela) ou (N x 10 µl) Solução de Primer parte 2 (tampa verde) + (N x 0.85 µl) Hot Star Taq (N x 4.25 U) Se usar Taq Hot Start alternativa, assegure-se que são adicionados 4.25U por reação e, se necessário, ajuste a quantidade de água 6

destilada autoclavada. O volume total desta mistura de amplificação é de (N x 45 µl). Agitar brevemente no vortex e distribuir alíquotas de 45 µl desta mastermix em (N- 1) tubos de amplificação autoclavados. 3. Pipetar 5 µl (0.1 a 1.5 µg) de DNA genômico. Adicionar 5 µl de água destilada (sem DNA) ao tubo de controle negativo. Não aplicar vortex, nem agitar! Verificar que a mistura de amplificação está no fundo do tubo! Seguir para a etapa 4. Protocolo de amplificação com DNA proveniente de amostras de swabs bucais ou manchas de sangue seco 1. Determinar o número N de cada reagente a ser utilizado em que: N = numero de amostras de DNA + 1 (controle negativo; sem DNA) + 1 Utilizando ponteiras de pipeta com filtro (cotton-plugged) preparar a mistura (mastermix) em um tubo estéril de 1.5ml: (N x 19.15 µl) água destilada autoclavada + (N x 10 µl) Tampão de Amplificação (tampa transparente) + (N x 10 µl) Solução de Primer parte 1 (tampa amarela) ou (N x 10 µl) Solução de Primer parte 2 (tampa verde) + (N x 0.85 µl) Taq Hot Star (N x 4.25 U) Se usar uma Taq alternativa, assegure-se que são adicionados 4.25U por reação e, se necessário, ajuste a quantidade de água destilada autoclavada. O volume total desta mistura de amplificação é de (N x 40 µl). Agitar brevemente no vortex e distribuir alíquotas de 40 µl desta mastermix em (N- 1) tubos de amplificação autoclavados. 2. Pipetar 10 µl de DNA preparado. Adicionar 10 µl de água destilada (sem DNA) ao tubo de controle negativo. Não fazer vortex nem agitar! 7

Verificar que a mistura de amplificação está no fundo do tubo! Seguir para a etapa 4. 4. Colocar as amostras no bloco pré-aquecido e calibrado do termociclador (ver as instruções indicadas pelo fabricante do termociclador). Iniciar o programa de amplificação designado para a amplificação CFTR. Perfil de Amplificação CFTR (termociclador tipo: GeneAmp PCR System 9700): ETAPA TEMPERATURA TEMPO OBSERVAÇÕES 1- Desnaturação 95 C 15 min. Ver as instruções indicadas pelo fabricante da Taq DNA Polimerase Hot Start 2 - Desnaturação 95 C 1 min. 3 - Anelamento primers (annealing) 57 C 1 min. 4 - Extensão dos primers 68 C 1 min. 5 - Elongação 68 C 10 min. Repetir o ciclo dos passos 2 a 4 30 vezes - O mesmo perfil de amplificação é usado para todos os produtos INNO- LiPA CFTR. 5. Após o processo de amplificação, usar imediatamente as amostras amplificadas com as tiras teste do INNO-LiPA CFTR ou conserve as amostras entre -15/-25 C. Não conserve produtos com DNA amplificado em conjunto com reagentes de amplificação não utilizados. RESULTADOS Visualização A presença de produto amplificado pode ser verificada para o efeito em gel de agarose a 2%. Adicionar 10 µl de cada produto amplificado por ranhura. Após amplificação multiplex especifica com a Solução de Primer parte 1, oito amplicons devem ser amplificados com o comprimento de 491bp (éxon10), 473bp (éxon20), 460bp (íntron16), 425bp (íntron10/éxon11), 341bp (éxon21), 8

331bp (íntron12), 304bp (éxon/íntron4) e 144bp (íntron5). Em gel de agarose a 2% é de esperar o perfil seguinte: As três bandas mais largas (éxon10, 20 e íntron16) não são diferenciadas como bandas separadas. Também as bandas para o éxon 21 e íntron12 não são diferenciadas como bandas separadas, isto significa que são visíveis cinco bandas distintas. Após amplificação com a Solução de Primer parte 2, dez amplicons devem ser sempre amplificados com um comprimento de 495bp (íntron8/éxon9), 473bp (éxon17a), 425bp (íntron19), 411bp (éxon19), 395bp (íntron17a/éxon17b), 341bp (éxon7), 328bp (éxon2), 320bp (íntron14b), 311bp (éxon3) e 181bp (éxon13) e um amplicon extra deve ser amplificado com um comprimento de 224bp (íntron1/íntron3) só na presença da grande deleção CFTRdele2,3 (21 kb). Em gel de agarose a 2% é de esperar o perfil seguinte: As duas bandas mais largas (íntron8/éxon9 e éxon17a) não são diferenciadas como bandas separadas. Também as bandas para o íntron19, éxon19 e íntron17a/éxon17b e as bandas para o éxon7, éxon2, íntron14b e éxon3 e as 2 bandas mais pequenas (íntron1/íntron3 e éxon13) não são diferenciadas como bandas separadas. Isto significa que são visíveis quatro bandas distintas. Validação - Incluir pelo menos um controle positivo e um negativo cada vez que efetuar uma amplificação. Tal como qualquer procedimento de uma técnica nova, a inclusão adicional de controles positivos e negativos deve ser considerada até que se adquira um elevado grau de confiança na execução correta do teste. Se desejar incluir um controle positivo adicional, usar uma amostra positiva conhecida. - Se obtiver uma banda positiva no gel com o controle negativo, toda a série efetuada deve ser rejeitada e o procedimento completo deve ser repetido. LIMITES DO PROCEDIMENTO - O uso deste produto deve ser limitado a pessoal bem treinado em técnicas de amplificação. - A presença de inibição da polimerase (ex. pela heparina, hemoglobina) pode causar falha na amplificação. - O pó das luvas descartáveis e o hipoclorito de sódio têm um efeito inibidor na amplificação. - Repetidos congelamentos e descongelamentos de amostras de DNA e dos reagentes podem originar uma amplificação menos eficiente. - Uma boa prática de laboratório e uma cuidadosa execução dos procedimentos previamente especificados permitem uma amplificação específica. 9

DESEMPENHO DO TESTE O desempenho da Amplificação CFTR foi avaliado externamente em dois laboratórios belgas de genética humana. Foram analisadas, ao todo, 101 amostras anônimas. O DNA foi previamente extraído de sangue fresco (anticoagulante EDTA em 51 amostras, desconhecido em 50 amostras) usando um método caseiro de "salting-out", e conservado a - 20 C ou inferior. Pureza de DNA (A260/A280) em um intervalo entre 1,5 e 2,2. Concentração após extração no intervalo de 0.102 µg/µl a 0.889 µg/µl. O DNA foi diluído a uma concentração de 0,1 µg/µl a 0,3 µg/µl antes da amplificação. O Termociclador utilizado foi o PE 9700 (Applied Biosystems) e Biometra T3 (Whatman Biometra) instruments. Foi usada para amplificação a Taq polimerase Hot Start AmpliTaq Gold (Applied Biosystems) ou Hot Star Taq (Qiagen). Todas as amplificações foram bem sucedidas na primeira tentativa. Intervalo de Aplicação A avaliação externa apresentou sucesso de amplificação a partir de DNA num intervalo de 0,1 µg/µl a 0,3 µg/µl. O DNA a concentrações entre 0,025 µg/µl e 0,1 µg/µl foi testado internamente com 35 amostras para assegurar o desempenho do teste a concentrações baixas de DNA. A Amplificação teve sucesso em todos estes casos. O total de resultados internos em mais de 100 amostras (DNA usado na amplificação no intervalo de 0,025 µg/µl a 0,3 µg/µl), apresentou uma falha em uma amplificação, possivelmente devido às más condições de transporte durante o envio da amostra para a Innogenetics. Adicionalmente, foi extraído DNA de 13 amostras colhidas com swabs bucais e de 20 amostras de manchas de sangue seco de acordo com o protocolo de extração descrito no folheto informativo. A amplificação com 10 µl de DNA extraído foi bem sucedida em todos os casos. Precisão A variação intraensaio foi avaliada internamente por amplificação de duas amostras em triplicado na mesma série. Além disso, duas amostras foram amplificadas usando três lotes diferentes de primers, em três séries diferentes de PCR. Não se observou variação significativa. Um painel de proficiência, constituído por cinco amostras com reatividades conhecidas, foi fornecido aos dois centros externos e analisado também internamente. Os resultados dos três laboratórios apresentaram uma completa concordância. 10

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