Preparação Manual de Amostras Utilizando o ABBOTT msample Preparation System DNA para RealTime High Risk HPV

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1 Preparação Manual de Amostras Utilizando o ABBOTT msample Preparation System DNA para RealTime High Risk HPV Nº. de lista 03N92-06 Abbott Max-Planck-Ring Wiesbaden Alemanha Abbott Max-Planck-Ring Wiesbaden Alemanha 2008 Abbott Laboratories

2 NOTAS Preparação Manual de Amostras Utilizando o ABBOTT msample Preparation System DNA para RealTime High Risk HPV

3 Índice Prefácio Declaração de propriedade Declarações de marcas comerciais Descrição Princípios do funcionamento Tipos de Espécime Precauções de Manuseamento Área de Preparação de Reagentes Área de Preparação de Amostras Área de Amplificação Contaminação e Inibição Material e Equipamento Necessários Consumíveis Materiais Adicionais Reagentes ABBOTT msample Preparation System DNA (n de Lista 06K12-24) Instruções de Armazenamento Protocolo de Extracção Configuração mlysis DNA mwash 1 DNA mwash 2 DNA Primeira Lavagem mwash 2 DNA Segunda Lavagem melution DNA Limpeza Resumo do Protocolo Preparação Manual de Amostras Utilizando o ABBOTT msample Preparation System DNA para RealTime High Risk HPV Índice 1

4 Índice 2 Preparação Manual de Amostras Utilizando o ABBOTT msample Preparation System DNA para RealTime High Risk HPV

5 Prefácio A Abbott Laboratories agradece a utilização do ABBOTT msample Preparation System DNA no seu laboratório molecular. Esperamos poder auxiliá-lo de qualquer forma possível. O serviço está disponível através do representante local da Abbott. As seguintes informações estão incluídas neste manual: Declaração de propriedade, página 2 Descrição das condições de utilização das informações, documentos e gráficos neste manual. Declarações de marcas comerciais, página 2 Descrição, página 3 Princípios do funcionamento, página 3 Tipos de Espécime, página 3 Precauções de Manuseamento, página 4 Material e Equipamento Necessários, página 8 Instruções de Armazenamento, página 10 Protocolo de Extracção, página 11 Limpeza, página 16 Resumo do Protocolo, página 17 Preparação Manual de Amostras Utilizando o ABBOTT msample Preparation System DNA para RealTime High Risk HPV 1

6 Declaração de propriedade Declarações de marcas comerciais Copyright 2008 Abbott Laboratories, Abbott Park, Illinois. Todos os direitos reservados. Nenhuma parte deste suporte pode ser reproduzida, armazenada, recolhida ou transmitida de qualquer forma ou meio sem autorização prévia por escrito da Abbott Laboratories. Todos os nomes de produtos e marcas comerciais da Abbott Laboratories são propriedade da ou licenciados à Abbott Laboratories ou respectivas subsidiárias ou filiais. Não é permitida a utilização de qualquer marca comercial, nome de marca, apresentação de marca ou nome de produto da Abbott sem a autorização prévia por escrito da Abbott Laboratories, com excepção da finalidade de identificação de produtos ou serviços da Abbott Laboratories. Todas as outras marcas comerciais, marcas, nomes de produto e nomes comerciais são propriedade das respectivas empresas. Todos os direitos reservados. Com excepção das permissões supracitadas, não é concedida uma licença ou direito, explícita ou implicitamente, a nenhum indivíduo sob qualquer patente, marca comercial ou outro título proprietário da Abbott Laboratories. Abbott é uma marca registada da Abbott Laboratories. 2 Preparação Manual de Amostras Utilizando o ABBOTT msample Preparation System DNA para RealTime High Risk HPV

7 Descrição O objectivo da preparação de amostras é extrair e concentrar as moléculas de ADN alvo para tornar o alvo acessível para amplificação e para remover potenciais inibidores de amplificação do extracto. O msample Preparation System é um conjunto de reagentes para a extracção dos ácidos nucleicos. Estes reagentes são utilizados no sistema automatizado m2000sp mas também podem ser utilizados num formato manual como é descrito abaixo. Princípios do funcionamento Durante a preparação da amostra, são adicionados mmicroparticles DNA e mlysis DNA ao número requerido de tubos de reacção. Cada espécime é adicionado a um dos tubos de reacção e, em seguida, incubado. Durante a incubação a 56 C, a lise ocorre e os ácidos nucleicos são adsorvidos às micropartículas na solução mlysis DNA. Após a incubação, é aplicado um íman ao tubo de reacção para capturar as micropartículas e o sobrenadante de lise é eliminado. Numa série de passos, as soluções de lavagem mwash 1 DNA e mwash 2 DNA são adicionadas para limpar as micropartículas das impurezas e cada lavagem é eliminada. Em seguida, o melution Buffer DNA é adicionado aos tubos de reacção que são depois incubados a 75 C para permitir que os ácidos nucleicos sejam separados das micropartículas. Um íman é aplicado, e a amostra extraída é transferida para um tubo ou uma placa de 96 poços para ulterior processamento. Tipos de Espécime O protocolo descrito é baseado em métodos automatizados desenvolvidos para o ensaio Abbott RealTime High Risk HPV. Consulte o folheto informativo do Abbott RealTime High Risk HPV para conhecer os tipos de amostra adequados. Preparação Manual de Amostras Utilizando o ABBOTT msample Preparation System DNA para RealTime High Risk HPV 3

8 Precauções de Manuseamento Durante a preparação de espécimes, é essencial a conformidade com boas práticas laboratoriais para minimizar o risco de contaminação cruzada entre espécimes e de introdução inadvertida de nucleases (RNases, DNases) nos espécimes antes, durante e depois do procedimento de extracção. Deve sempre ser utilizada uma técnica asséptica adequada quando trabalhar com ácidos nucleicos. As reacções de amplificação como, por exemplo, PCR são sensíveis à introdução acidental de produto de reacções de amplificação anteriores. As medidas para reduzir o risco de contaminação no laboratório incluem a separação física das actividades envolvidas na execução de PCR em conformidade com boas práticas laboratoriais. Recomendamos a utilização de áreas dedicadas no laboratório para execução de ensaios baseados em PCR como é descrito abaixo. Área de Preparação de Reagentes A Área de Preparação de Reagentes é dedicada à preparação de componentes de reagentes de PCR para criar a mistura principal de amplificação e transferir alíquotas da mistura principal para a placa de 96 poços. As batas laboratoriais, pipetas, pontas de pipetas e misturadoras de centrifugação utilizadas na Área de Preparação de Reagentes devem permanecer nesta área e não ser movidas da Área de Preparação de Amostras ou da Área de Amplificação. 4 Preparação Manual de Amostras Utilizando o ABBOTT msample Preparation System DNA para RealTime High Risk HPV

9 Área de Preparação de Amostras A Área de Preparação de Amostras é dedicada ao processamento de espécimes e/ou controlos e à adição de espécimes e controlos processados à placa de 96 poços. Todos os reagentes utilizados na Área de Preparação de Amostras devem permanecer sempre nesta área dedicada. As batas laboratoriais, pipetas, pontas de pipetas e misturadoras de centrifugação utilizadas na Área de Preparação de Amostras devem permanecer nesta área e não ser movidas para a Área de Preparação de Reagentes ou para a Área de Amplificação. Não coloque o produto de amplificação na Área de Preparação de Amostras. ATENÇÃO: Perigo biológico potencial. Este procedimento requer o manuseamento de espécimes humanos. Recomendamos que todos os materiais de origem humana sejam considerados potencialmente infecciosos e sejam manuseados com práticas de biosegurança adequadas. Elimine todos os espécimes e outros materiais potencialmente infecciosos em conformidade com os regulamentos locais. Todos os materiais devem ser manuseados de forma a minimizar a possibilidade de contaminação da área de trabalho. Limpe e desinfecte derrames de espécimes incluindo a utilização de um desinfectante tuberculocida como, por exemplo, 1,0% de hipocloreto de sódio ou outro desinfectante adequado. De uma forma geral, tenha em conta as seguintes precauções durante o manuseamento de químicos: Consulte as MSDS para obter instruções e precauções para uma utilização segura. Evite o contacto com a pele e os olhos. Se o contacto com o material for previsto, utilize luvas impermeáveis, vestuário de protecção e protecção ocular. Mantenha a área arrumada. Não coma, beba, nem armazene alimentos ou bebidas na área de utilização de químicos. Se detectar sinais de irritação ou toxicidade após a exposição, procure auxílio médico. Preparação Manual de Amostras Utilizando o ABBOTT msample Preparation System DNA para RealTime High Risk HPV 5

10 Área de Amplificação A Área de Amplificação é dedicada à amplificação de PCR e à detecção do produto amplificado. Placas de 96 poços são transferidas da Área de Preparação de Amostras e carregadas no termociclador. As batas laboratoriais e o equipamento utilizados na Área de Amplificação devem permanecer nesta área e não ser movidas para a Área de Preparação de Reagentes ou para a Área de Preparação de Amostras. 6 Preparação Manual de Amostras Utilizando o ABBOTT msample Preparation System DNA para RealTime High Risk HPV

11 Contaminação e Inibição As seguintes precauções devem ser observadas para minimizar os riscos de contaminação por nucleases, contaminação cruzada entre amostras, contaminação com produtos amplificados e inibição. Utilize sempre equipamento adequado de protecção pessoal. Utilize luvas isentas de pó-de-talco. Mude de luvas após o contacto com potenciais contaminantes (espécimes, eluídos e/ou produtos amplificados). Pontas de pipeta estéreis com barreira de aerossóis devem ser utilizadas em qualquer pipetagem manual. As pontas de pipeta devem ser utilizadas apenas uma vez. Os reagentes ABBOTT msample Preparation System DNA são de utilização única. No fim de cada protocolo, elimine todos os restantes reagentes. Os mlysis DNA, mwash 1 DNA, mwash 2 DNA, melution Buffer DNA e mmicroparticles DNA restantes podem ser eliminados em conformidade com os procedimentos laboratoriais. NOTA: A autoclavagem do material amplificado de PCR não irá degradar o produto amplificado e poderá contribuir para a libertação do mesmo ao abrir a placa ou tubo selados. A zona do laboratório pode ficar contaminada com produto amplificado se os materiais de resíduos não forem correctamente manuseados e acondicionados antes e após processamento. Preparação Manual de Amostras Utilizando o ABBOTT msample Preparation System DNA para RealTime High Risk HPV 7

12 Material e Equipamento Necessários Consumíveis Pontas de pipeta estéreis com barreira de aerossóis de µl Pontas de pipeta estéreis com barreira de aerossóis de 200 µl Pontas de pipeta repetidora estéril com capacidade para distribuir 25 µl volumes Tubos micrófugos e tampas de enroscar de 1,5 ml (N de Lista 04J71-50 ou equivalente) Placa de polipropileno de 96 poços (opcional) Materiais Adicionais Suportes magnéticos para tubos de 1,5 ml Suportes não-magnéticos para tubos de 1,5 ml Bloco de aquecimento a seco ajustável para tubos de 1,5 ml (capacidade para atingir 56 C e 75 C) Termómetro Temporizador Vórtex Pipeta de precisão ajustável de µl Pipeta de precisão ajustável de 200 µl Pipeta repetidora com capacidade para entregar 25 µl volumes Etanol de prova a Graus USP (95-100% etanol) ADVERTÊNCIA: Não utilize etanol que contenha desnaturantes. 8 Preparação Manual de Amostras Utilizando o ABBOTT msample Preparation System DNA para RealTime High Risk HPV

13 Recipiente de Líquidos para resíduos (não permite o contacto de lixívia com resíduos líquidos). Consulte o capítulo Limpeza, página 16, para obter informações sobre advertências e precauções. Recipiente de resíduos sólidos Bata laboratorial Luvas sem pó-de-talco descartáveis Óculos de protecção Armário de segurança biológica aprovado para trabalho com materiais infecciosos, como requerido Reagentes ABBOTT msample Preparation System DNA (n de Lista 06K12-24) ABBOTT Lysis Buffer DNA (mlysis DNA ) (MD201A) ABBOTT Wash Buffer 1 DNA (mwash 1 DNA ) (MD202A) ABBOTT Wash Buffer 2 DNA (mwash 2 DNA ) (MD203A) ABBOTT Elution Buffer DNA (melution Buffer DNA ) (MD204A) ABBOTT Microparticles DNA (mmicroparticles DNA ) (MD205A) Preparação Manual de Amostras Utilizando o ABBOTT msample Preparation System DNA para RealTime High Risk HPV 9

14 Instruções de Armazenamento Armazene o ABBOTT msample Preparation System DNA e respectivos componentes de acordo com as instruções no rótulo. 10 Preparação Manual de Amostras Utilizando o ABBOTT msample Preparation System DNA para RealTime High Risk HPV

15 Protocolo de Extracção Um ABBOTT msample Preparation System DNA tem 4 X 48 preparações. Um tabuleiro de reagentes processa 48 amostras. Remova os frascos do tabuleiro e inverta suavemente os frascos do ABBOTT msample Preparation System DNA de modo a garantir uma solução homogénea. Se forem detectados cristais em qualquer um dos frascos de reagentes ao abrir, deixe o reagente à temperatura ambiente até que os cristais se dissolvam. Não utilize os reagentes se ainda existirem cristais. Consulte o capítulo Resumo do Protocolo, página 17, como guia para este protocolo. Conclua cada passo para cada amostra antes de continuar para o passo numérico seguinte. Configuração 1. Ligue o bloco de aquecimento a seco controlado por temperatura para os tubos de 1,5 ml para 56 C. 2. Coloque um rótulo em todos os tubos necessários. a. Um tubo micrófugo com tampa de enroscar de 1,5 ml por amostra para os passos mlysis DNA, mwash 1 DNA, mwash 2 DNA e melution Buffer DNA. b. Um tubo micrófugo com tampa de enroscar de 1,5 ml por amostra ou uma placa de polipropileno de 96 poços para o eluído. 3. Verifique a temperatura do bloco de aquecimento. Não continue até o bloco de aquecimento atingir a temperatura correcta. 4. Adicione 70 ml de etanol de prova (95-100% etanol) ao frasco mwash 2 DNA. Misture invertendo 5 a 10 vezes. ADVERTÊNCIA: Utilize apenas etanol de prova a Graus USP (95-100% etanol). Não utilize etanol que contenha desnaturantes. ADVERTÊNCIA: Para evitar lesões pessoais, siga as instruções do fabricante relativas ao bloco de aquecimento a seco. Para evitar queimaduras, desligue a alimentação e deixe os blocos de aquecimento arrefecer até 35 C ou menos antes do manuseamento. Preparação Manual de Amostras Utilizando o ABBOTT msample Preparation System DNA para RealTime High Risk HPV 11

16 mlysis DNA 1. Volte a suspender mmicroparticlesdna centrifugando ou agitando vigorosamente até as partículas ficarem em suspensão e as partículas sedimentadas deixam de estar visíveis no fundo do frasco. 2. Coloque os tubos micrófugos com tampas de enroscar de 1,5 ml num suporte não-magnético à temperatura ambiente. Quando as partículas estiverem de novo em suspensão, utilizando uma ponta de pipeta repetidora com capacidade de dispensar alíquotas de 25 µl, adicione 25 µl de mmicroparticles DNA em cada tubo micrófugo de 1,5 ml. 3. Utilizando uma ponta de pipeta estéril com barreira de aerossóis de µl, adicione 0,4 ml de mlysis DNA em cada tubo micrófugo com tampa de enroscar de 1,5 ml no suporte não-magnético. 4. Utilizando uma ponta de pipeta estéril com barreira de aerossóis de µl, adicione 0,4 ml de amostras (espécimes e/ou controlos) aos tubos micrófugos com tampa de enroscar de 1,5 ml e misture o preparado de amostra-lise por aspiração e distribua até ser obtida uma suspensão uniforme (pelo menos, 5 ciclos de aspiração e distribuição). NOTA: É crítico que cada espécime seja centrifugado imediatamente antes de ser adicionado. 5. Depois de adicionadas todas as amostras à mlysis DNA e misturadas, feche cada tubo com uma tampa de enroscar, transfira para o bloco de aquecimento a 56 C, inicie o temporizador e deixe incubar todos os tubos durante 10 minutos. 6. Concluída a incubação, remova as tampas de enroscar e elimine-as, e coloque os tubos micrófugos com tampa de enroscar de 1,5 ml num suporte magnético de captura durante 2 minutos para permitir que as partículas sejam capturadas no lado do tubo. 12 Preparação Manual de Amostras Utilizando o ABBOTT msample Preparation System DNA para RealTime High Risk HPV

17 7. Com os tubos no suporte magnético de captura, utilize uma ponta de pipeta estéril limpo de µl para cada amostra para remover cuidadosamente o lisato de cada tubo e eliminar o fluido num recipiente de resíduos líquidos. Remova o máximo de fluido possível. NÃO perturbe ou aspire as partículas magnéticas capturadas. 8. Remova o tubo micrófugo com tampa de enroscar de 1,5 ml do suporte magnético e transfira-o para um suporte não-magnético. NOTA: Aspire e distribua líquido devagar para evitar a formação de espuma. NOTA: Ajuste a temperatura do bloco de aquecimento para 75 C. 1. Utilizando uma ponta de pipeta de µl limpa, adicione 800 µl de mwash 1 DNA às amostras e proceda de novo à suspensão das partículas magnéticas no fluido de lavagem aspirando suavemente e distribuindo com a ponta da pipeta. Lave as partículas do lado do tubo, se necessário. NOTA: Quando adicionar tampões de lavagem, distribua líquido devagar para evitar salpicos. 2. Coloque os tubos micrófugos com tampa de enroscar de 1,5 ml num suporte magnético de captura durante um minuto para permitir que as partículas sejam capturadas no lado dos tubos. 3. Utilizando uma ponta de pipeta de µl limpa para cada amostra, remova o mwash 1 DNA dos tubos micrófugos com tampa de enroscar de 1,5 ml e elimine o fluido num recipiente de resíduos líquidos. Remova o máximo de fluido possível. NÃO perturbe ou aspire as partículas magnéticas capturadas. 4. Remova os tubos micrófugos com tampa de enroscar de 1,5 ml do suporte magnético e transfira-os para um suporte não-magnético. Preparação Manual de Amostras Utilizando o ABBOTT msample Preparation System DNA para RealTime High Risk HPV 13

18 mwash 2 DNA Primeira Lavagem 1. Utilizando uma ponta de pipeta de µl limpa, adicione 800 µl de mwash 2 DNA às amostras e proceda de novo à suspensão das partículas magnéticas no fluido de lavagem aspirando suavemente e distribuindo com a ponta da pipeta. Lave as partículas do lado do tubo, se necessário. 2. Coloque os tubos micrófugos com tampa de enroscar de 1,5 ml num suporte magnético de captura durante um minuto para permitir que as partículas sejam capturadas no lado dos tubos. 3. Utilizando uma ponta de pipeta de µl limpa para cada amostra, remova o mwash 2 DNA dos tubos micrófugos com tampa de enroscar de 1,5 ml e elimine o fluido num recipiente de resíduos líquidos. Remova o máximo de fluido possível. NÃO perturbe ou aspire as partículas magnéticas capturadas. 4. Remova os tubos micrófugos com tampa de enroscar de 1,5 ml do suporte magnético e transfira-os para um suporte não-magnético. mwash 2 DNA Segunda Lavagem 1. Utilizando uma ponta de pipeta de µl limpa para cada amostra, adicione 800 µl de mwash 2 DNA às amostras e proceda de novo à suspensão das partículas magnéticas no fluido de lavagem aspirando suavemente e distribuindo com a ponta da pipeta. Lave as partículas do lado do tubo, se necessário. 2. Coloque os tubos micrófugos com tampa de enroscar de 1,5 ml num suporte magnético de captura durante um minuto para permitir que as partículas sejam capturadas no lado dos tubos. 3. Utilizando uma ponta de pipeta de µl limpa para cada amostra, remova o mwash 2 DNA dos tubos micrófugos com tampa de enroscar de 1,5 ml e elimine o fluido num recipiente de resíduos líquidos. Remova o máximo de fluido possível. NÃO perturbe ou aspire as partículas magnéticas capturadas. 4. Remova os tubos micrófugos com tampa de enroscar de 1,5 ml do suporte magnético e transfira-os para o bloco de aquecimento a 75 C e deixe incubar durante 10 minutos para permitir a evaporação do etanol. 14 Preparação Manual de Amostras Utilizando o ABBOTT msample Preparation System DNA para RealTime High Risk HPV

19 melution DNA 1. Utilizando uma ponta de pipeta de 200 µl limpa para cada amostra, adicione 100 µl de melution Buffer DNA às amostras e proceda de novo à suspensão das partículas magnéticas no fluido de lavagem aspirando suavemente e distribuindo com a ponta da pipeta. Lave as partículas do lado do tubo, se necessário. 2. Mantenha os tubos individuais no bloco de aquecimento a 75 C e deixe incubar durante 10 minutos. 3. Remova os tubos micrófugos com tampa de enroscar de 1,5 ml do bloco de aquecimento a 75 C coloque-os num suporte magnético de captura durante um minuto para permitir que as partículas sejam capturadas no lado dos tubos. 4. Utilizando uma ponta de pipeta de 200 µl limpa para cada amostra, remova a Amostra Eluída do tubo micrófugo com tampa de enroscar de 1,5 ml. NÃO perturbe ou aspire as micropartículas capturadas. 5. A(s) Amostra(s) Eluída(s) podem ser colocadas num tubo micrófugo com tampa de enroscar de 1,5 ml limpo ou numa placa de polipropileno de 96 poços. Preparação Manual de Amostras Utilizando o ABBOTT msample Preparation System DNA para RealTime High Risk HPV 15

20 Limpeza 1. Elimine os tubos de introdução de amostras e os frascos de controlo em conformidade com os procedimentos laboratoriais. 2. Os reagentes ABBOTT msample Preparation System DNA são de utilização única. Os restantes reagentes e resíduos líquidos deverão ser eliminados em conformidade com os procedimentos laboratoriais. ADVERTÊNCIA: Não misture agentes oxidantes como, por exemplo, o hipocloreto de sódio com mlysis DNA, mmicroparticles DNA e mwash 1 DNA nos reagentes do msample Preparation System DNA. Não misture agentes oxidantes como, por exemplo, hipocloreto de sódio, com os resíduos líquidos. Podem ser criados gases tóxicos a partir destas misturas. Pode ocorrer uma acumulação de pressão no recipiente fechado com as misturas. É da responsabilidade de cada instituição a caracterização dos resíduos produzidos e a garantia de que os mesmos são manuseados em conformidade com os regulamentos locais. 3. Remova e elimine todos os consumíveis e resíduos sólidos em conformidade com os procedimentos laboratoriais. 4. Limpe os suportes de amostra, os blocos de temperatura e os suportes magnéticos mergulhando-os numa solução de hipocloreto de sódio a 0,5% durante aproximadamente 10 minutos e, em seguida, lavando totalmente com água e secando totalmente ao ar. 5. Descontamine e limpe a área de trabalho em conformidade com os procedimentos laboratoriais. 16 Preparação Manual de Amostras Utilizando o ABBOTT msample Preparation System DNA para RealTime High Risk HPV

21 Resumo do Protocolo mmicroparticles DNA, 25 μl mlysis DNA, 0,4 ml Tubo de Reacção Poço de Mistura Espécime, 0,4 ml (volume processado) 56 o C, 10 min RT Mag Sep mwash 1 DNA, 0,8 ml Tubo de Reacção RT Mag Sep Mistura mwash 2 DNA, 0,8 ml Tubo de Reacção RT Mag Sep Mistura Repetir num total de duas lavagens de mwash 2 DNA melution DNA, 100 μl Tubo de Reacção 75 o C, 10 min Evaporação Tubo de Reacção 75 o C, 10 min Chaves para Elementos do Processo: RT = temperatura ambiente Mag Sep = separação magnética de micropartículas da maioria de sobrenadante Mistura = conduzir aspiração e distribuição contínuas Eluído RT Mag Sep Figura 1.0: Resumo do Protocolo Preparação Manual de Amostras Utilizando o ABBOTT msample Preparation System DNA para RealTime High Risk HPV 17

22 Abbott Molecular Inc E. Touhy Ave. Des Plaines, IL EUA 18 Preparação Manual de Amostras Utilizando o ABBOTT msample Preparation System DNA para RealTime High Risk HPV