Bases e aplicações da tecnologia do DNA recombinante
Por quê entender a Tecnologia do DNA recombinante? y y Doenças: diagnóstico, prognóstico e tratamento Compreensão dos mecanismos biológicos y y y organismos sadios desenvolvimento doenças O que é a tecnologia do DNA recombinante? y y imitação da vida compreensão da organização e dos mecanismos naturais
Microarray AND human disease
Application of microarray technology in pulmonary diseases Argyris Tzouvelekis, George Patlakas and Demosthenes Bouros Department of Pneumonology, Medical School, Democritus University of Thrace, Greece Respiratory Research 2004, 5:26 doi:10.1186/1465-9921-5-26
Análise comparativa da expressão gênica em larga escala Identificação de genes associados com causa ou predisposição a doenças
Hibridização de ácidos nucléicos
A estrutura do DNA segundo Watson e Crick
A estrutura do DNA e a replicação semiconservativa
Replicação do DNA e sua maquinaria enzimática
Transcrição e sua maquinaria enzimática
Transcriptase Reversa: DNA polimerase dependente de RNA conversão do mrna em cdna AAAAA RT TTTTT Iniciador Oligo dt RT AAAAA TTTTT pol AAAAA TTTTT Transcriptase Reversa (RT) sintetiza a primeira fita do cdna cdna dupla fita
1. Bactérias podem sentir o ambiente, distinguir entre tipos celulares e entregar proteínas a células eucarióticas. 2. Invasinas de uma bactéria patogênica transferidas para Escherichia coli para invadir células tumorais
As bases da tecnologia do DNA recombinante
Descoberta do sistema restrição-modificação Luria e Human, 1952, Arber e Dussoix, 1962 (restrição) Endonucleases sítio específicas (1970/71, Smith e Nathans)
Genética de bactérias fagos e plasmídeos DNA da E. coli Transformação de E. coli Plasmídeos Seleção de células transformadas
Dupla fita de DNA + Maquinaria de replicação Separação das fitas - Helicases Ajuste topológico - Topoisomerases Estabilização da bolha - SSBs Adição de iniciadores - Primase Polimerização - DNA Pol III Retirada dos iniciadores (oligo-rna) - DNA Pol I Correção das quebras na cadeia - DNA ligase
Clonagem Isolamento e propagação de moléculas idênticas E mais... A expressão de proteínas heterólogas
Seqüenciamento enciamento do DNA 5 -CCTCTGAATGTCCTTTCTCTAAGTCCTAAGTCCTCCGGATGGTACTTCTAGTTC-3 Iniciadores sintéticos 5 -CCTCTGAATGTCCTTTCTCTAAGTCCTAAGTCCTCCGGATGGTACTTCTAGTTC-3 5 -CCTCTGAATGTCCTTTCTCTAAG-3 POLIMERASE + G C G T T G A T T A C G T G T A A T A A C C G A T G C G T A C G G 5 -CCTCTGAATGTCCTTTCTCTAAGTCCTAAGTCCTCCGGATG
Seqüenciamento enciamento do DNA
Diagnóstico Molecular
As bibliotecas genômicas e os projetos genoma
Projetos Genoma: The end of the beginning Genética Clássica Watson e Crick Maxam & Gilbert +Sanger & Coulson Biologia Molecular + Genética Reversa Abordagem gene a gene Biologia Molecular em Escala Genômica (90s )
Projeto Genoma Humano http://genomics.energy.gov/gallery/
Projetos Genoma de procariotos Procariotos: genoma circular alta densidade gênica colinearidade ~1 gene/1000 pares de bases
Projetos genoma: uma nova visão Treponema: 1,138kb 1041 genes (1 gene/1kb) virulência diferenças metabólicas alvos de drogas
Buscando genes ou identificando diferenças: amplificação por PCR
PCR - Reação em cadeia da polimerase
Maquinaria da Replicação Separação das fitas - Helicases Ajuste topológico - Topoisomerases Estabilização da bolha - SSBs Adição de inicadores - Primase Polimerização - DNA Pol III Retirada dos iniciadores (oligo-rna) - DNA Pol I Correção das quebras na cadeia - DNA ligase
PCR Separação das fitas - CALOR Ajuste topológico - Topoisomerases Estabilização da bolha - SSBs Adição de iniciadores - Oligonucleotídeos sintéticos Polimerização - Taq DNA Polimerase Retirada dos iniciadores (oligo-rna) - DNA Pol I Correção das quebras na cadeia - DNA ligase
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/genetics-medicine/