UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO PÓLO AVANÇADO DE XERÉM GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA CURSO MELH. GEN. E OGMs (XBT353) TURMA 2015/2 Seleção de clones e screening de bibliotecas genômicas Prof. Dr. Silas Pessini Rodrigues Rio de Janeiro, 24 de novembro de 2015
Seleção: um tipo de pressão (ex.: presença de anti-biótico) é aplicada sob as células hospedeiras pré-expostas à DNA recombinante à as células contendo o DNA de interesse sobrevivem e são selecionandas. Screening: Uma população de células viáveis é submetida a testes específicos que permitem a identificação de indivíduos da população que contêm o DNA de interesse.
Seleção genética e métodos de screening Baseiam-se na expressão ou não de uma determinada característica à codificada pelo vetor ou pelo DNA inserto Principais métodos de screening: 1. Uso de substratos cromogênicos 2. Inativação por inserção 3. Complementação de mutações 4. Hibridização de ácidos nucléicos 5. Reação em cadeia da Polimerase (PCR) 6. Teste imunológico
1. Uso de substratos cromogênicos na seleção genética Sistema X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl--Dgalactopyranoside) Subtrato incolor da β-galactosidase (β-gal) β-gal à sintetizada em E. coli na presença de galactose ou indutores (ex.: IPTG, iso-propyl-thiogalactoside) β-gal à codificada pelo gene LacZ Estão associadas também à selecão por antibióticos à o antibiótico seleciona células que receberam o plasmídeo à e o subtrato cromogênico seleciona as que receberam o inserto
A clivagem do substrato x-gal gera um produto de cor azul Oxidação no ar
Alguns vetores podem trazer o gene LacZ completo (LacZ) ou parcial (LacZ ) Vetor lambda Charon 16A A célula hospedeira que não codifica o gene LacZ (fenótipo LacZ-) à só vai expressar o fenótipo se a célula possuir o vetor
LacZ+ Tem o vetor, sem o inserto de DNA! LacZ- Tem o vetor, contendo o inserto de DNA!
Alguns vetores podem trazer o gene LacZ completo (LacZ) ou parcial (LacZ ) Plasmídeo puc18 Sistema de α-complementação: N-terminal, tetrâmero à sítio ativo α-peptide à interface entre as duas sub. dos tetrâmeros à resíduos 22-31 estabilizam as 4 hélices e os resíduos 13 e 15 contribuem para o sítio ativo E. coli β- gal
Sistema LacZ de complementação com α-peptídeo
Inativação por inserção: o inserto de DNA inativa um gene no vetor Tem o vetor intacto! Tem o vetor + inserto!
2. Inativação por inserção: sistema de resistência à antibióticos Inserto aqui Células = Ap Suceptíveis Tc Resistentes
2. Inativação por inserção: sistema de resistência à antibióticos Inserto aqui Ap R Células = Ap Suceptíveis Tc Resistentes Células de interesse!
3. Complementação de mutações Complementação: o DNA clonado codifica uma função auxente na célula hospedeira Requerimentos: 3.1 Uma cepa de hospedeiro mutato em um gene particular (auxotrófico) 3.2 Um meio de cultura específico para seleção da cepa mutada 3.3 A forma funcional do gene, para ser inserida junto com o vetor de expressão Hospedeiro auxotrófico: incapaz de sintetizar um composto particular requerido para o seu crescimento
Microalga Chlamydomonas reinhardtii auxotrófica para o Arginina Células em meio sem arg ou não transformadas Células em meio com arg ou transformadas C. reinhardtii Cc1618- falta um gene de síntese de arginina (arg)
Outros métodos de seleção genética ci intacto à forma lisógenos ci + inserto de DNA à célula sofrem lise à formam placas bacterianas Sistema repressor ci de fago lambda Genes que controlam a mudança entre os ciclos lisogênico e lítico: ci repressor do ciclo lítico Cro controla o repressor e outros genes à induz ciclo lítico Ex.: vetor λgt10
Apenas células infectadas por vetor+inserto formarão placas bacterianas (regiões de ciclo lítico), quando suspensões diluídas de fagos forem aplicadas sobre bactérias Placa bacteriana, de onde bacteriófagos são isolados e podem ser re-cultivados em bactérias crescendo em meio líquido
4. Screening por hibridização de ácidos nucléicos Baseadas na complementaridade de ácidos núcleis em dupla fita Envolve o uso de sondas à a sonda apresenta um determinado grau de homologia em relação à sequência alvo As sondas podem ser marcadas com 32 P ou por fluorescência Sonda heterólogas à baseada na sequência de DNA de um organismo, quando aplicada em uma espécie diferente. As sondas são de três tipos: 1) DNA genômico 2) cdna à pode ser utilizada diretamente à partir de uma população de mrna sem a necessidade de clonagem prévia 3) Oligonucleotídeos à sintetizados à partir da sequência da proteína
De que forma as sondas podem ser marcadas? - Polimerase incorpora nucleoedeos marcados - Pode uflizar: NucleoEdeos radioafvos NucleoEdeos marcados quimicamente Timina modificada Dioxigenina à pode ser detectada por anticorpo
De que forma as sondas podem ser marcadas? - O DNA pode ser tratado com uma 5 kinase
4. Screening por hibridização de ácidos nucléicos Estringência: O quanto acurada uma sonda vai ser
Placas em alta e baixa densidade são utilizadas para screening O screening é feito em placas com populações densas de células, que são recultivadas para permitirem o isolamento de células individuais
Screening imunológico é utilizado na detecção do produto do gene Anticorpo à antígeno Anticorpo polyclonal: reconhecem todos os determinantes atntigênicos de um antígeno Anticorpo monoclonal: reconhecem um único determinante antigênico (muito mais específico e difícil de se obter) Utilizados para a detecção do produto do gene à são aplicados a bibliotecas de expressão
Análise da expressão gênica por imunologia
O nível de expressão e o número de vezes que o gene foi inserido no genoma do hospedeiro pode ser determinado por um conjunto de técnicas RT-PCR Blotting Southern-blot alvo são moléculas de DNA Northen-blot alvo são moléculas de RNA Western-blot alvo são proteínas