REVISTA PORTUGUESA DE CIÊNCIAS VETERINÁRIAS Avaliação da viabilidade do sémen de varrascos por citometria de fluxo Evaluation of boar semen viability by flow cytometry F. Moreira da Silva*, R. Metelo, P. Santos e A. Chaveiro Universidade dos Açores - Departamento de Ciências Agrárias, Reprodução Animal - 9701-851 Angra do Heroísmo,Terceira - Portugal Resumo: Ao longo dos tempos diversas têm sido as análises rotineiras do sémen, avaliando o número de células no ejaculado, a sua motilidade e morfologia. A motilidade espermática é vulgarmente usada como indicador da viabilidade celular. É necessária uma boa motilidade tanto para o transporte de um número suficiente de SPZ (SPZ) até ao local da fecundação, como para o processo de penetração da zona pelúcida do ovócito. Também o estado do acrossoma tem um significado especial no estudo morfológico do SPZ, uma vez que este interfere directamente no sucesso do processo de penetração do SPZ. Este trabalho teve como objectivo a análise de dois métodos de avaliação espermática, a citometria de fluxo e a microscopia óptica e de contraste de fase. A técnica de citometria de fluxo envolveu a coloração dos SPZ para a determinação da viabilidade e integridade dos acrossomas. Paralelamente, foi efectuada a observação ao microscópio óptico, para a determinação da viabilidade e motilidade, e a observação ao microscópio de contraste de fase, para a determinação da integridade dos acrossomas dos SPZ. Com base nos resultados obtidos pela análise ao citómetro de fluxo, foi possível a observação do decréscimo da viabilidade em cerca de 15% dos SPZ ao longo do tempo sendo este resultado confirmado por observação de duzentos SPZ ao microscópio óptico. Relativamente à integridade dos acrossomas e mobilidade espermática, observou-se um decréscimo da integridade dos SPZ analisados ao longo tempo. A principal vantagem da citometria de fluxo é a avaliação de diversos parâmetros em milhares de células individuais num curto espaço de tempo, o que permite inclusive, avaliar sub-populações diferentes. Os resultados do presente trabalho indicam claramente que a citometria de fluxo é uma técnica objectiva, rápida e exacta na avaliação dos SPZ de varrasco previamente corados com propidio iodado e PSA/FITC, permitindo uma previsão a nível da viabilidade do sémen suíno. Summary: During the past years several routine methods have been used for semen analysis, evaluating the elements present in the ejaculate such has motility and sperm morphology. The spermatic motility is commonly used as an indicator of cellular viability. A good motility is necessary for the transport of a high number of spermatozoa (SPZ) to the site of fertilization and for the process of penetration in the oocyte zone pellucida. The acrosome condition is also an important parameter in the SPZ morphologic study, because it intervenes directly with the success of the SPZ penetration. The objective of this study was to compare two methods of SPZ evaluation, by flow cytometry and optic microscopy. The flow cytometry technique involved the staining of the SPZ to determine the viability and integrity of the acrosome. *Correspondência: jsilva@mail.angra.uac.pt Tel. (+351) 295402224; Fax. (+351) 295402205 In parallel, was performed the evaluation by optic microscope, to assess SPZ viability and motility. On the basis of the results obtained, it was observed a viability decrease of 15 % over time by flow cytometry method, latter confirmed by observation of 200 SPZ through optic microscopy. Acrosome integrity and sperm motility also decreased over time in both methods. The flow cytometry method main advantage is the analysis of several parameters in thousand of individual sperm cells in a short time, allowing the evaluation of different subpopulations. Results of the present work clearly demonstrate that flow citometry is an objective, fast and accurate technique for evaluating boar semen previously stained with propidium iodide and PSA/FITC, allowing a sperm viability prediction. Introdução A motilidade espermática é vulgarmente usada como indicador da viabilidade celular, a qual pode ser reflexo, entre outros factores da integridade da membrana bem como do metabolismo intracelular (Chan et al., 1985). É necessária uma boa motilidade tanto para o transporte de um número suficiente de SPZ até ao local da fecundação, como para o processo de penetração da zona pelúcida do ovócito (Hamamah et al., 1995). Também o estado do acrossoma tem um significado especial no estudo morfológico do SPZ, uma vez que este interfere directamente no sucesso do processo de penetração do SPZ (Berger et al., 1996). A avaliação das populações espermáticas pode ser realizada mediante microscopia óptica, tendo como maior inconveniente o facto das contagens serem limitadas a um número reduzido de SPZ, bem como ser necessária uma maior manipulação do sémen sendo assim mais propícia a ocorrência de variações devidas ao meio exterior. Como forma de colmatar esta desvantagem, uma metodologia recentemente implementada com bons resultados foi o recurso à citometria de fluxo, não só pela sua objectividade e possibilidade de analisar um elevado número de SPZ, como também pela rapidez e versatilidade analítica do estudo dos SPZ (Bento dos Santos e Druart, 2000) Além da viabilidade espermática, a citometria de fluxo está a ser usada para estudar outras características, tanto extra-celulares como funcionais, num período curto de tempo e com um número elevado de células. Desde o seu aparecimento a 77
citometria de fluxo tem experimentado um importante desenvolvimento devido, em grande parte, ao facto do seu carácter multidisciplinar ter sido beneficiado pelos avanços ocorridos em campos tão diversos como a imunologia, a biologia molecular, etc. Recentemente, o desenvolvimento dos marcadores fluorescentes, indicadores de uma determinada função espermática, têm facilitado este tipo de estudos. Com diferentes fluorescências podem-se identificar sub-populações concretas e deste modo podem analisarem-se grupos homogéneos. A principal vantagem que apresenta a utilização da citometria de fluxo é a possibilidade de analisar células espermáticas vivas em suspensão, num período de tempo de análise muito curto, fixando-se as lectinas ás células em relativamente pouco tempo (Orfao e Buitrago, 1995). Desta forma, as lectinas ou os anticorpos podem ser utilizados para detectar determinadas modificações na população de SPZ vivos. No entanto, há que ter em conta que no estudo das modificações com lectinas em suspensões de SPZ vivos, pode ocorrer um problema de toxicidade destas sobre o gâmeta masculino (Berger, 1990; Vazquez et al., 1993 e 1996). A PSA (Pisium Sativum Agglutinin), é uma glicoproteína vegetal (retirada da ervilha) a qual se liga ao acrossoma dos SPZ, tendo a capacidade de se ligar somente aos SPZ com acrossomas danificados. A PSA foi usada em conjunto com o FITC (isotiocianato de fluoresceína) para que esta fixação fosse visível permitindo a identificação dos SPZ pelo citómetro de fluxo. A adição de Propidio Iodado (PI) à FITC-PSA permite a determinação simultânea da viabilidade e integridade do acrossoma dos SPZ, uma vez que o Propidio Iodado emite fluorescência vermelha e a FITC-PSA emite fluorescência verde (Harrison et al., 1993). Contudo, para a validação do método de avaliação da integridade dos SPZ por citometria de fluxo é necessário a sua comparação com resultados obtidos por microscopia óptica. Assim sendo, este trabalho tem por objectivo a avaliação da viabilidade do espermatozóides e sua integridade acrossómica ao longo do tempo de diferentes varrascos utilizando o método de citometria de fluxo, comparando simultaneamente com os resultados obtidos por microscopia óptica. por um copo coberto por um filtro, com 100 ml de diluidor (MR-A), a 37 0 C. No laboratório procedeu-se à avaliação do sémen a qual consistiu na observação do ejaculado para determinação da motilidade bem como da morfologia das células espermáticas e a sua concentração usando uma câmara de Bürker. Após a determinação da concentração e observação de formas anormais, efectuam-se os cálculos para a realização da diluição do sémen. Por fim, foi retirada uma amostra de sémen diluído de cada varrasco colectado, para avaliação ao citómetro de fluxo. Para isso, a um total de 475 µl de PBS a 37 0 C foram adicionados 25 µl de sémen diluído a 3,0x10 7 /ml. Posteriormente, foi adicionado 5 µl de Propídio Iodado e 2,5 µl de "Pisium Sativum Agglutinin"/"isothiocianato de fluoresceína" (PSA/FITC) de acordo com Bento dos Santos e Druart (2000). Após 30 minutos de repouso, as amostras foram analisadas por um citómetro de fluxo. FACSCalibur equipado com uma fonte luminosa laser de árgon, o qual estava ligado a um computador equipado com o programa Cell-Quest. Para cada SPZ, num total de 2000, foi determinado o seu tamanho expresso como "Forward scatter" (FSC) e a sua estrutura interna pelo "Side scatter" (SSC). Relativamente ao PI, este fluorocromo tem a capacidade de se ligar à membrana citoplasmática quando esta apresenta danificações, intercalando-se com o DNA, sendo excitado por um feixe luminoso com um comprimento de onda de 488 nm, emitindo uma fluorescência vermelha de intensidade na ordem dos 620 nm. Desta forma, quanto maior for a intensidade da fluorescência vermelha, maior é a quantidade de SPZ mortos. Relativamente ao PSA/FITC, este fluorocromo emite uma fluorescência verde com um comprimento de onda de 525 nm, determinando a integridade acrossómica. Pela conjugação dos fluorocromos usados na citometria de fluxo, podemos distinguir quatro populações de SPZ: vivos com o acrossoma intacto, marcados negativamente pelo propídio Iodado e FITC-PSA; vivos com o acrossoma danificado, marcados negativamente com o propídio Iodado e positivamente com a FITC-PSA; mortos com o acrossoma intacto, marcados positivamente Materiais e métodos Para a elaboração do presente trabalho, um total de nove varrascos de raça Large White; Pietrain; Large Whyte x Pietrain e Large Whyte x Pietrain x Durock alimentados e com água ad libitum, com idades compreendidas entre dois e cinco anos, foram usados como dadores de sémen. Os animais estavam estabulados em jaulas individuais 4 x 4 metros. O sémen foi recolhido pelo método manual, uma vez por semana, numa sala equipada com um tronco impregnado de urina de porca em cio para a excitação prévia do varrasco. Após a recolha, o sémen foi armazenado num termos constituído Figura 1 - Resultados típicos após avaliação de SPZ de varrasco por citometria de fluxo: em função do tamanho (FSC) e estrutura interna (SSC) (ao cimo); em função da fluorescência vermelha (à esquerda) e em função da fluorescência verde (à direita). 78
com o Propidio Iodado e negativamente com a FITC- -PSA; mortos com o acrossoma danificado, marcados positivamente com o Propidio Iodado e com a FITC-PSA (Figura 2). Figura 2 - Combinação da fluorescência verde com a fluorescência vermelha onde são identificadas quatro sub populações: SPZ vivos com o acrossoma intacto (1º quadrante); vivos com o acrossoma danificado (2º quadrante); mortos com o acrossoma intacto (3º quadrante) e finalmente mortos com o acrossoma danificado (4º quadrante). Relativamente à microscopia, um total de duzentos SPZ foram avaliados por microscopia óptica, servindo-nos os valores aqui encontrados como controlo dos obtidos por citometria de fluxo. Foi avaliada a mobilidade dos SPZ, a qual foi estimada segundo dois parâmetros: a percentagem de SPZ móveis (de 0 a 100%) e a nota de mobilidade (de 0 a 5) a fim de caracterizar a qualidade do movimento. Estes parâmetros foram estimados, por observação ao microscópio, utilizando uma gota de 5 µl de sémen colocado entre lâmina e lamela sobre uma placa aquecida a 37 0 C. Para avaliação da viabilidade, adicionaram-se 50 µl de sémen a 50 µll de Tripano Azul. Após homogeneização de ambos, retirou-se uma pequena porção (aproximadamente 20 µl), a qual foi colocada numa câmara de Bürker, procedendo-se assim à contagem dos SPZ vivos e mortos, numa população de duzentos SPZ distribuídos pelas duas partes da câmara. No que diz respeito à integridade acrossómica, após o repouso de 1 ml de sémen durante aproximadamente uma hora, foram retirados 500 µl do sobrenadante, tendo sido adicionados aos restantes 500 µl um total 10 µl de formol (10%), de forma a se proceder a fixação dos SPZ, de acordo com Bonet (1990). A integridade foi determinada ao microscópio de contraste de fase, por observação de uma população de duzentos SPZ. fluorescência verde com a fluorescência vermelha, para casa amostra, foram facilmente identificadas quatro sub-populações de SPZ (Figura 2); vivos com o acrossoma intacto, vivos com o acrossoma danificado, mortos com o acrossoma intacto e finalmente, mortos com o acrossoma danificado. Para a viabilidade dos SPZ, observamos uma tendência ascendente da curva representativa da média da fluorescência vermelha emitida ao longo do tempo (Figura 3), equivalendo a um aumento do número de espermatozóides mortos (Figura 4A) ao longo do tempo, a qual corresponde a um decréscimo da viabilidade dos SPZ, uma vez que são os SPZ mortos que são corados positivamente pelo Propídio Iodado emitindo assim uma maior intensidade de fluorescência vermelha. Este decréscimo da viabilidade ocorreu ao longo do tempo de forma constante, não apresentando oscilações drásticas durante os quatro dias em que os SPZ foram avaliados. Paralelamente, observou-se ao microscópio óptico duzentos SPZ onde se confirmaram estes valores obtido por citometria de fluxo (Figura 3). Relativamente à integridade dos acrossomas, a qual foi avaliada por citometria de fluxo pela avaliação da intensidade da fluorescência verde (Figura 5) e do número de espermatozóides corados (Figura 4B), observou-se uma tendência de subida desta característica, principalmente do segundo para o terceiro dia após a recolha de sémen, estabilizando posteriormente do terceiro ao quarto dia. A tendência assumida corresponde a um decréscimo da integridade dos acrossomas dos SPZ analisados, uma vez que são os SPZ com acrossoma danificado que são corados positivamente pela PSA/FITC, emitindo fluorescência verde. Resultados e discussão Com base nos dados recolhidos foram diferenciados dois grupos de resultados: o primeiro corresponde aos obtidos a partir da análise por microscópia e o segundo corresponde à análise dos SPZ efectuada por citometria de fluxo. A Figura 1 mostra um resultado típico obtido por citometria de fluxo após avaliação do sémen, onde foi possível identificar os SPZ individualizados (SPZ simples) de partículas de tamanho inferior, sendo posteriormente identificada a fluorescência verde e vermelha apenas da população, num total de 2000 SPZ. Tendo em consideração a combinação destas da Figura 3 - Avaliação da viabilidade dos SPZ de varrasco durante os quatro dias após a recolha de sémen: efectuada por citometria de fluxo (em cima) e por microscopia (em baixo). 79
Figura 4A - Percentagem de espermatozóides mortos com acrossoma intacto e danificado. Cada coluna representa a média ± o desvio padrão de 26 ejaculados de nove varrascos (2000 spz/ejaculado). Em relação à mobilidade e qualidade do movimento (Figura 6) verificou-se também um decréscimo ao longo do tempo, o qual poderá ser explicado não só pelo decréscimo ocorrido na viabilidade espermática como também pela aglutinação, a qual aumentou ao longo do tempo, consequência não só pela agregação de partículas, (e.g. células epiteliais), sedimentação dos constituintes do diluidor assim como dos próprios SPZ mortos. De forma idêntica, a integridade dos acrossomas dos SPZ avaliados por citometria de fluxo, na observação da integridade do acrossoma ao microscópio óptico de contraste de fase (Figura 7), este também se degradou ao longo do tempo, acompanhado a diminuição da viabilidade. Na análise efectuada por microscopia de contraste de fase pôde observar-se que a curva se mantém mais ou menos constante desde o dia da recolha até ao dia seguinte apresentando posteriormente uma tendência decrescente, mais evidente a partir do segundo dia após a recolha de sémen. Observamos desta forma que a citometria de fluxo é uma técnica que engloba novos dados relativos ao estudo dos SPZ proporcionando uma medida rápida, multiparamétrica e objectiva de determinadas características que possam estar relacionadas com o poder fecundante dos mesmos (Shapiro, 1989). Além disso, apresenta a vantagem de estudar milhares de células em menos de um minuto, quando o sistema se encontra calibrado correctamente, com o mínimo de manipulação. Figura 4B - Percentagem de espermatozóides vivos com acrossoma intacto e danificado. Cada coluna representa a média ± o desvio padrão de 26 ejaculados de nove varrascos (2000 spz/ejaculado). Graham et al. (1990), descreveram que a técnica da citometria de fluxo é um sistema que pela primeira vez permite estudar SPZ sem se proceder à sua fixação prévia. Contudo, quando os SPZ de varrasco são analisados por citometria de fluxo, estes apresentam uma grande variação apresentando-se como uma população mais heterogénea que se for observada ao microscópio. Este facto deve-se a que, junto aos SPZ individualizados, outras partículas como restos celulares, SPZ aglutinados e até SPZ mal orientados são também contemplados. Por este motivo, e como geralmente é recomendado (Zucker et al., 1992; Harrison et al., 1993) torna-se necessário a realização de uma primeira selecção da população em função do tamanho celular (FSC) e uma segunda selecção da população em função da sua estrutura interna (SSC). Só desta forma, aquando da avaliação dos SPZ poderemos ter uma população homogénea a ser avaliada, eliminando todos os detritos que não pretendemos avaliar. Figura 5 - Integridade dos acrossomas avaliada por FCM desde o dia da recolha (dia zero) até quatro dias depois. Cada valor representa a média ± o desvio padrão da fluorescência verde de 26 ejaculados de nove varrascos (2000 SPZ/ejaculado). Figura 6 - Mobilidade dos SPZ (em cima) e qualidade dos seus movimentos (em baixo) avaliada por microscopia óptica. Cada valor representa a média ± o desvio padrão do número de SPZ móveis. Foram avaliados 27 ejaculados, em 9 varrascos. 80
A análise da vitalidade espermática mediante microscopia, é um método no qual se torna necessário o emprego de algum tempo na contagem individualizada dos SPZ. Por este motivo, normalmente as análises efectuadas por este método, são de um número reduzido de células. Relativamente aos resultados obtidos, verificou-se que as curvas apresentadas quer para os resultados da citometria de fluxo, quer para os resultados obtidos por microscopia óptica, apresentam tendências semelhantes, embora nas curvas visíveis nos gráficos correspondentes à citometria de fluxo deve-se ter em conta que as médias das fluorescências emitidas aumentam ao longo do tempo variando de forma inversa a viabilidade e integridade dos acrossomas, isto é, quando maior a fluorescência emitida maior o número de SPZ mortos ou maior o número de SPZ com os respectivos acrossomas danificados. É visível o decréscimo da viabilidade ao longo do tempo sendo este acompanhado pelo decréscimo também do número de SPZ com acrossoma intacto. As correlações (Método de Pearson) efectuadas entre os dois métodos utilizados, quer para a viabilidade quer para a integridade dos acrossomas, apresentam os seguintes coeficientes de correlação, de r 2 = 0,97 e r 2 = 0,93 (P 0,05), respectivamente, indicando que os resultados obtidos de ambos os métodos estão muito próximos apesar de todas as diferenças já mencionadas entre ambos. Os resultados obtidos, ao nível da evolução da viabilidade e mobilidade ao longo do tempo, encontram-se de acordo com o estudo realizado por Patrício (2002), o qual estudou a variação da mortalidade e mobilidade de SPZ de suíno ao longo do tempo usando o diluidor MR-A, tendo comparado os resultados obtidos com este diluidor a outros tipos diluidores. Os resultados do presente trabalho indicam claramente que a citometria de fluxo é uma técnica objectiva, rápida e exacta na avaliação dos SPZ de varrasco previamente corados com propidio iodado e PSA/FITC, permitindo uma previsão a nível da viabilidade do sémen suíno. Bibliografia Figura 7 - Integridade do acrossoma de 200 espermatozóides avaliada ao microscópio óptico de contraste fase. Cada valor corresponde à média ± o desvio padrão dos espermatozóides com acrossoma intacto, num total de 27 ejaculados de 9 varrascos. Bento dos Santos CR e Druart X (2000). Le sexage des spermatozoides. Elevage et Insemination, 300: 3-10. Berger T (1990). Pisum sativum agglutinin used as an acrosomal stain of porcine and caprine sperm. Theriogenology, 33: 689-695. Berger T, Anderson DL, Penedo MCT (1996). Porcine sperm fertilizing potential in relationship to sperm functional capacities. Animal Reproduction Science, 44: 231-239. Bonet S (1990). Immature and aberrant spermatozoa in the ejaculate of Sus domesticus. Animal Reproduction Science, 22: 67-80. Chan SY, Fox EJ, Chan MM, Tsoi W, Wang C, Tang LC, Tang GW, Ho P (1985). The relationship between the human sperm hypoosmotic swelling test, routine semen analysis, and the human sperm zona-free hamster ovum penetration assay. Fertility and Sterility, 44: 668-672. Graham JK, Kunze EY, Hammerstedt R (1990). Analysis of sperm cell viability, acrossomal integrity, and mitochondrial function using flow cytometry. Biology of Reproduction, 43: 55-63. Hamamah S, Jean M, Royère D, Barrière P (1995). Capacité des spermatozoïdes à se fixer sur la zone pellucide. Andrologia, 5: 361-368. Harrison RAP, Asworth PJC, Miller NGA (1993). Rapid effects of bicabornate/co2 on boar spermatozoa detec by merocyanine, a probe of lipid packing. Journal of Reproduction and Fertility - Abstract Series 12, 14. Orfao A e Buitrago JMG (1995). La citometría en laboratorio clínico. Comité de Publicaciones de la Sociedad Española de Bioquímica Clínica y Patología Molecular. Patrício RAM (2002). Inseminação Artificial em Suínos Comparação de diferentes tipos de diluidores de sémen no número de leitões nascidos. Estágio curricular, Universidade dos Açores. Shapiro HM (1989). Practical flow cytometry. 2ª edição. Editado por Alan R. Liss, Inc., New York. Vazquez JM, Martinez E, Roca J, Coy P, Pastor LM (1993). Acrossome reaction of boar spermatozoa in homologous in vitro fertilization. Molecular Reproduction and Development, 36: 84-88. Vasquez JM, Martinez E, Pastor LM, Roca J, Matas CY, Calvo A (1996). Lectin histochemistry during in vitro capacitation and acrosme reaction in boar spermatozoa: new lectins for evaluating acrosomal status of boar spermatozoa. Acta Histochemica, 98: 93-100. Zucker RM, Perreault SD, Y Elstein KH (1992). Utility of light scatter in the morphological analysis of sperm. Cytometry, 13: 39-47. 81