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Figura 14. Seqüenciamento do gene da condroitinase AC clonado no vetor pcdna3.1(+). Para confirmar a correta inserção do gene da condroitinase AC no plasmídeo pcdna3.1(+) o gene foi dividido em 5 partes que foram seqüenciadas e as seqüências obtidas foram comparadas à seqüência descrita por Tkalec e col. (2000), utilizando o programa DNAstar. Na figura, a seqüência superior é a consenso entre os 5 seqüenciamentos que realizamos (cac1-cac5) e a seqüência descrita na literatura (cac cds Tkalec e col.). cac: condroitinase AC; cds: seqüência codificadora do gene. 4.2 Transfecção de células mononucleadas derivadas de medula óssea e das linhagens celulares CHO e 9L (gliosarcoma) Uma vez que o gene da condroitinase AC de F. heparinum foi clonado, a expressão, secreção e atividade da enzima foram avaliadas in vitro pela transfecção de células mononucleadas derivadas da medula óssea e das linhagens celulares CHO-K1 e 9L. Escolhemos utilizar células mononucleadas derivadas da medula óssea para a terapia celular, pois estas células são de fácil obtenção e já foi demonstrado que são capazes de promoverem regeneração do SNC com recuperação funcional (Yoshihara e col., 2007). Verificamos, inicialmente, a eficiência da lipofecção utilizando diferentes condições. Para tanto, as células foram transfectadas com o plasmídeo pegfp-n1, que possui o gene GFP (green fluorescent protein), e analisadas em microscópio invertido de varredura Confocal a laser (Zeiss modelo LSM510). O protocolo que vem com a Lipofectamine recomenda uma faixa de quantidade de DNA, de volume de reagente (lipofectamina) e de tempo de transfecção a serem usados. Assim, utilizando as células CHO-K1, variamos a quantidade 50
de DNA, a quantidade de lipofectamina e o tempo de transfecção, mas dentro da faixa recomendada, para verificar quais condições resultariam em uma maior porcentagem de células transfectadas. A Figura 15 mostra a transfecção de células CHO-K1 utilizando diferentes quantidades de lipofectamina. Podemos observar que a porcentagem de células transfectadas é praticamente a mesma quando utilizamos 8μg (Figuras 15A e B) ou 16μg (Figuras 15C e D) de lipofectamina. Além disso, podemos observar que na presença de 40μg de lipofectamina, muitas células morrem (Figuras 15E e F). Assim, escolhemos utilizar 8μg de lipofectamina nos protocolos. Utilizamos também a Lipofectamine 2000 nos ensaios, e verificamos que 4μl desta lipofectamina equivalem aos 8μg da outra (Figura 15G). As melhores condições encontradas para ambas as lipofectaminas foram as descritas em Material e Métodos (item 3.10), ou seja, uma incubação de 5 horas com a mistura DNA/lipofectamina na proporção 1,5μg de DNA/8μg ou 4μl de lipofectamina. 51
Figura 15. Teste do protocolo de transfecção: determinação da quantidade de lipofectamina. Células CHO-K1 um dia (A, C, E e G) e dois dias (B, D e F) após transfecção com plasmídeo pegfp-n1 e 8μg (A e B), 16μg (C e D) ou 40μg (E e F) de Lipofectamine, ou 4μl de Lipofectamine 2000 (G). Barra de escala: 100μm. 52
A seguir, testamos este protocolo na linhagem celular de gliosarcoma (9L) e em células mononucleadas derivadas da medula óssea. Na Figura 16, podemos observar que uma grande porcentagem de células expressa GFP um dia após a transfecção e a quantidade de células expressando GFP aumenta dois dias após a transfecção. Figura 16. Teste do protocolo de transfecção para a linhagem celular de gliosarcoma e para células mononucleadas derivadas da medula óssea. Transfecção de células de gliosarcoma 9L (A e B) e células mononucleadas derivadas da medula óssea (C e D), com o plasmídeo pegfp-n1. A e C: 1 dia após transfecção; B e D: 2 dias após transfecção. As células foram transfectadas com 1,5µg de DNA e 4µl de Lipofectamine 2000. Barra de escala 100μm em A e B, e 50μm em C e D. Como realizamos uma transfecção transitória, sem seleção de células transfectadas, verificamos por quanto tempo, células mononucleadas derivadas de medula óssea transfectadas com o plasmídeo pegfp-n1 expressariam GFP in vitro. Esta informação é importante para a expectativa da duração da transfecção transitória nas células que seriam transplantadas nos animais. Para tanto, as culturas foram acompanhadas e fotografadas ao microscópio por até 13 dias após a transfecção (Figura 17). Observamos que, ao longo do 53
tempo, embora o número de células tenha diminuído, as células vivas continuam expressando GFP. Figura 17. Teste do tempo de expressão de GFP por células mononucleadas derivadas da medula óssea transfectadas com plasmídeo pegfp-n1. A: 1 dia após transfecção; B: 6 dias após transfecção; C: 9 dias após transfecção; D: 13 dias após transfecção. As células foram transfectadas com 1,5µg de DNA e 4µl de Lipofectamine 2000. Barra de escala 100μm. 4.3 Expressão da condroitinase AC bacteriana recombinante por células eucarióticas A expressão da condroitinase AC por células de gliosarcoma de rato (linhagem 9L) e células mononucleadas derivadas de medula óssea com o plasmídeo recombinante pcdna3.1(+)-condroitinase AC foi analisada por RT-PCR. O RNA total foi extraído das células transfectadas com o vetor vazio ou com o vetor contendo o gene para a condroitinase AC e o cdna foi obtido pela ação da transcriptase reversa. O cdna foi utilizado como molde em reação de PCR com primers específicos para condroitinase AC e β-actina (descritos em Material e Métodos, item 3.11). Os produtos de PCR foram analisados por eletroforese em gel de agarose e uma banda referente à amplificação do 54
RNAm da condroitinase AC foi obtida apenas em amostras de células transfectadas com a construção pcdna-condroitinase AC (9L/pcDNA-cAC e MO/pcDNA-cAC) (Figuras 18 e 19). As amostras obtidas das células transfectadas com o plasmídeo vazio (9L/pcDNA e MO/pcDNA) ou de células que não foram transfectadas (9L e MO) não apresentaram uma banda referente à amplificação do RNAm da condroitinase AC, confirmando assim, que células transfectadas com o vetor recombinante expressam RNAm da condroitinase AC. Figura 18. Células de gliosarcoma de rato transfectadas com o vetor pcdna3.1(+)- condroitinase AC expressam RNAm da enzima. Eletroforese em gel de agarose dos produtos de amplificação por RT-PCR de condroitinase AC e β-actina a partir de RNA total extraído de células de gliosarcoma de rato não-transfectadas (9L), transfectadas com pcdna3.1(+) (9L/pcDNA) ou transfectadas com a construção pcdna3.1(+)-condroitinase AC (9L/pcDNA-cAC). Figura 19. Células mononucleadas derivadas da medula óssea de camundongos transfectadas com o vetor pcdna3.1(+)-condroitinase AC expressam RNAm da enzima. Eletroforese em gel de agarose dos produtos de amplificação por RT-PCR de condroitinase AC e β-actina a partir de RNA total extraído de células mononucleadas derivadas de medula óssea não-transfectadas (MO), transfectadas com pcdna3.1(+) (MO/pcDNA) ou transfectadas com a construção pcdna3.1(+)-condroitinase AC (MO/pcDNA-cAC). 55
4.4 Células eucarióticas transfectadas com o vetor contendo o gene para condroitinase AC secretam a enzima ativa in vitro Após termos verificado que as células de gliosarcoma de rato (9L) e células mononucleadas derivadas de medula óssea expressam a condroitinase AC recombinante, passamos a investigar se essas células secretariam uma forma ativa da enzima. Para tanto, utilizamos linhagens celulares 9L e CHO-K1 que são utilizadas rotineiramente no laboratório para estudar a expressão de proteoglicanos. Como não havia informações sobre os tipos de proteoglicanos expressos pelas células 9L foi realizada marcação metabólica com [ 35 S]-sulfato de sódio e os glicosaminoglicanos foram isolados e analisados por eletroforese em gel de agarose, conforme descrito em Material e Métodos (item 3.14). Podemos observar na Figura 20 que as células 9L sintetizam condroitim sulfato e heparam sulfato, sendo que a maior parte do condroitim sulfato é secretada para o meio de cultura. Figura 20. Células de gliosarcoma de rato expressam condroitim e heparam sulfato. Glicosaminoglicanos expressos por células de gliosarcoma de rato (9L) foram metabolicamente marcados com [ 35 S]-sulfato de sódio (5,55MBq, por 6h). O meio condicionado e extrato celular das culturas foram obtidos e os glicosaminoglicanos analisados por eletroforese em gel de agarose. CS: condroitim sulfato; HS: heparam sulfato. Em seguida, a secreção e a atividade da condroitinase AC recombinante foram avaliadas in vitro. Foram realizadas diferentes tentativas para avaliar a atividade enzimática da condroitinase AC recombinante produzida pelas linhagens celulares. Entre os 56
protocolos, foi testada a atividade do meio condicionado pelas células transfectadas com o vetor contendo o gene da enzima sobre condroitim sulfato disponível comercialmente. Porém, com esse método não conseguimos observar degradação, possivelmente porque a quantidade de enzima expressa é muito baixa para conseguirmos observar degradação. Houve também uma tentativa de testar atividade enzimática por zimograma, no qual o condroitim sulfato foi submetido à eletroforese em gel de agarose em tampão PDA, seguido da incubação desse gel com meio condicionado. Também por este método não fomos capazes de observar degradação de condroitim sulfato. Como os dois métodos testados não se mostraram eficientes, pensamos que poderíamos avaliar a degradação do condroitim sulfato sintetizado pela própria célula transfectada, desde que esse glicosaminoglicano fosse metabolicamente marcado. A idéia é que, se a enzima recombinante fosse secretada com atividade ela deveria agir sobre o condroitim sulfato secretado pela célula e deveríamos observar uma diminuição na quantidade desse glicosaminoglicano no meio condicionado. Sendo assim, foi realizada a quantificação do condroitim sulfato marcado com [ 35 S]-sulfato de sódio presente no meio condicionado de células CHO-K1 e 9L transfectadas com pcdna3.1(+) ou a construção pcdna3.1(+)-condroitinase AC. A Figura 21A mostra a eletroforese em gel de agarose dos glicosaminoglicanos marcados presentes no meio condicionado de células 9L. Os glicosaminoglicanos foram quantificados e observamos uma diminuição de 40% na quantidade de condroitim sulfato presente no meio condicionado de células transfectadas com o plasmídeo recombinante comparado com células transfectadas com o plasmídeo vazio (Figura 21B). Em células CHO-K1, a diminuição foi de 22% (Figura 21C). Estes resultados mostram que células de mamífero transfectadas com o plasmídeo recombinante expressam e secretam condroitinase AC ativa. 57
Figura 21. Células de gliosarcoma e CHO transfectadas com o vetor contendo o gene da condroitinase AC secretam a enzima recombinante na forma ativa. Expressão de glicosaminoglicanos por células 9L transfectadas com o plasmídeo pcdna3.1(+) (9L/pcDNA) ou a construção pcdna3.1(+)-condroitinase AC (9L/pcDNA-cAC). Os glicosaminoglicanos foram metabolicamente marcados com [ 35 S]-sulfato de sódio (5,55MBq, por 6h) e analisados por eletroforese em gel de agarose (A). Os glicosaminoglicanos secretados para o meio condicionado por células 9L (B, *p=0,012) e por células CHO (C, *p=0,008) foram quantificados. O experimento foi realizado 2 vezes, em duplicata, para as células 9L e 4 vezes, em duplicata, para as células CHO. O CS não degradado restante em cada amostra foi quantificado usando como padrão CS metabolicamente marcado por células não transfectadas, extraído e analisado da mesma maneira. Foi calculada a média das duplicatas em cada experimento e os dados apresentados são a média dos experimentos. 9L: células de gliosarcoma de rato; CHO: células ovarianas de hamster chinês; CS: condroitim sulfato; HS: heparam sulfato. 58
4.5 Células mononucleadas derivadas de medula óssea adulta não sintetizam condroitim sulfato Se por um lado a degradação do condroitim sulfato secretado pelas células transfectadas com o vetor contendo o gene da condroitinase AC se apresentou como uma maneira eficiente de observar a atividade enzimática da enzima recombinante, por outro isso poderia afetar o conteúdo de condroitim sulfato das células mononucleadas derivadas da medula óssea. O perfil de expressão dos glicosaminoglicanos secretados por estas células após um dia em cultura foi investigado. Os glicosaminoglicanos (Figura 22A) e proteoglicanos (Figura 22B) foram marcados metabolicamente com [ 35 S]-sulfato de sódio e analisados por eletroforese em gel de agarose, conforme descrito em Material e Métodos (item 3.15). Obtivemos uma banda única que apresenta migração eletroforética menor do que os glicosaminoglicanos CS, DS e HS padrões, indicando que, ou as células mononucleadas da medula óssea sintetizam proteoglicanos que são dificilmente degradados por enzimas proteolíticas ou os glicosaminoglicanos dessas células são estruturalmente muito diferentes dos glicosaminoglicanos padrões. Figura 22. Células mononucleadas derivadas da medula óssea expressam glicosaminoglicanos com migração diferente dos glicosaminoglicanos padrões. Glicosaminoglicanos (A) e proteoglicanos (B) secretados para o meio condicionado por células mononucleadas derivadas de medula óssea de camundongo adulto (MO) foram metabolicamente marcados com [ 35 S]-sulfato de sódio (5,55MBq, por 6h) e analisados por eletroforese em gel de agarose. O experimento foi realizado em quadruplicata 2x. CS: condroitim sulfato; DS: dermatam sulfato; HS: heparam sulfato; GAG: glicosaminoglicano; PG: proteoglicano. 59
A fim de investigar a composição do glicosaminoglicano da banda obtida na Figura 22, as amostras foram incubadas com diferentes combinações das enzimas de F. heparinum condroitinase AC, condroitinase ABC, heparitinase I e heparitinase II, ou com extrato bruto, que contém todas as glicosaminoglicanoliases produzidas pela bactéria. Os glicosaminoglicanos foram então analisados por eletroforese em gel de agarose (Figura 23A) e quantificados (Figura 23B). Além disso, padrão contendo uma mistura dos glicosaminoglicanos CS, DS e HS, também foi incubado nas mesmas condições para verificar a atividade das enzimas (Figura 23C). 60
Figura 23. Glicosaminoglicanos expressos por células mononucleadas da medula óssea não são degradados por condroitinases bacterianas. Glicosaminoglicanos expressos por células mononucleadas derivadas de medula óssea foram metabolicamente marcados com [ 35 S]-sulfato de sódio (5,55MBq, por 6h). Os glicosaminoglicanos extraídos do meio condicionado foram incubados com diferentes enzimas e analisados por eletroforese em gel de agarose (A) e quantificados (B). Uma mistura de glicosaminoglicanos padrões (P) CS, DS e HS também foi submetida à degradação com as diferentes enzimas, seguida de análise por eletroforese em gel de agarose. Os glicosaminoglicanos padrões foram corados por azul de toluidina (C). 1: glicosaminoglicanos não degradados; 2: incubação com condroitinase ABC; 3: incubação com condroitinase AC; 4: incubação com heparitinase I, heparitinase II e condroitinase AC; 5: incubação com heparitinase I, heparitinase II, condroitinase AC e condroitinase ABC; 6: extrato bruto. CS: condroitim sulfato; DS: dermatam sulfato; HS: heparam sulfato. Após incubação com a condroitinase ABC, observamos uma diminuição de cerca de 5% dos glicosaminoglicanos presente no meio condicionado de células mononucleadas derivadas de medula óssea, entretanto a condroitinase AC parece não ter efeito sobre esses glicosaminoglicanos (Figura 23A e B, condições 2 e 3, respectivamente). Ao incubar o meio condicionado com uma mistura de condroitinase AC e heparitinases I e II, houve uma degradação de 17% dos glicosaminoglicanos (Figura 23A e B, condição 4). Todas as 61
enzimas utilizadas no ensaio estavam ativas, como mostra a Figura 23C, que apresenta a degradação de glicosaminoglicanos padrões pelas diferentes enzimas de F. heparinum. Quando os glicosaminoglicanos padrões são incubados com o extrato bruto de F. heparinum observamos sua degradação total (Figura 23C, condição 6). Ao incubar o meio condicionado de células mononucleadas derivadas de medula óssea com extrato bruto, 50% dos glicosaminoglicanos foram degradados (Figura 23A e B, condição 6). Portanto, os glicosaminoglicanos de células mononucleadas derivadas de medula óssea possuem uma estrutura que não é facilmente degradada pelas enzimas de F. heparinum, provavelmente por apresentarem uma estrutura diferente dos glicosaminoglicanos padrões. A menor migração eletroforética desses glicosaminoglicanos em relação à migração dos padrões utilizados sugere que eles apresentem aumento na sulfatação. Assim, podemos supor que os glicosaminoglicanos de células mononucleadas derivadas da medula óssea, transfectadas com o gene recombinante da condroitinase AC, não serão degradados pela enzima recombinante. 4.6 Clonagem do gene da condroitinase AC no vetor de expressão pegfp-n1 Além de construir um vetor para a expressão da condroitinase AC nós também necessitávamos de uma maneira de rastrear as células após o transplante. Para isso existem várias estratégias, como transplantar células de camundongo macho em fêmeas e localizar as células pela presença do cromossomo Y, marcar as células com corantes fluorescentes, utilizar células de animais transgênicos (lacz, GFP + ) ou construir uma quimera do gene de interesse com a proteína GFP. Essa estratégia nos pareceu interessante, pois poderíamos, além de localizar as células transplantadas, verificar exatamente quais células estariam expressando a enzima e também localizar o destino final da enzima produzida. Para tanto decidimos utilizar o plasmídeo pegfp-n1 uma vez que já havíamos testado a eficiência da lipofecção com esse plasmídeo (Figuras 15-17). A seqüência que codifica para a condroitinase AC foi amplificada por reação de PCR a partir de DNA genômico de F. heparinum utilizando o par de primers referentes ao plasmídeo pegfp-n1 descritos em Material e Métodos (item 3.6). A análise dos produtos da amplificação foi realizada por eletroforese em gel de agarose para DNA. O primer sense usado foi o mesmo da clonagem no plasmídeo pcdna3.1(+), entretanto, o primer antisense não poderia incluir um códon de término além de ter que estar em fase com a 62
seqüência da GFP. A banda de 2.103pb foi purificada do gel, clonada no plasmídeo pegfp-n1 e E. coli DH5α quimicamente competentes foram transformadas. Colônias positivas foram identificadas por amplificação por PCR seguido de eletroforese em gel de agarose utilizando os mesmos primers usados para a clonagem (Figure 24A). A colônia positiva indicada na Figura 24A foi selecionada e a incorporação do gene da condroitinase AC foi confirmada por digestão com as enzimas de restrição KpnI e BamHI (Figura 24B) e por seqüenciamento. Figura 24. Clonagem do gene da condroitinase AC no vetor de expressão pegfp-n1. O gene da condroitinase AC foi amplificado por PCR utilizando DNA genômico de F. heparinum como molde e clonado no vetor de expressão pegfp-n1. Em seguida, células E. coli DH5α foram transformadas com a construção e colônias positivas foram identificadas por PCR seguido de eletroforese em gel de agarose (A). Uma das colônias positivas (seta em A) foi selecionada e a incorporação do gene foi confirmada por digestão com as enzimas de restrição KpnI e BamHI seguido de eletroforese em gel de agarose (B). Em B, a seta indica a banda referente ao gene da condroitinase AC e a cabeça de seta indica a banda referente à construção pegfp-condroitinase AC não degradada. Embora a digestão com as enzimas de restrição KpnI e BamHI não tenha sido muito eficiente (Figura 24B), passamos a avaliar a secreção e atividade da enzima in vitro pela análise de condroitim sulfato marcado com [ 35 S]-sulfato de sódio presente no meio condicionado de células CHO-K1 transfectadas com pegfp-n1 ou a construção pegfpcondroitinase AC. Os glicosaminoglicanos foram analisados por eletroforese em gel de agarose e quantificados (Figura 25). Observamos uma diminuição de 15% na quantidade de condroitim sulfato presente no meio condicionado de células transfectadas com o plasmídeo recombinante comparado com células transfectadas com o plasmídeo vazio. 63