SthefanyPagliari. Diagnóstico molecular da Toxoplasmose congênita e gestacional: revisão bibliográfica

SthefanyPagliari Diagnóstico molecular da Toxoplasmose congênita e gestacional: revisão bibliográfica Londrina 2011

SthefanyPagliari Diagnóstico molecular da Toxoplasmose congênita e gestacional: revisão bibliográfica Monografia apresentada ao Curso de Especialização em Saúde Coletiva e Saúde da Família para a Banca Examinadora do Centro Universitário Filadélfia UniFil, para obtenção do título de Especialista. Londrina 2011

SthefanyPagliari Diagnóstico molecular da Toxoplasmose congênita e gestacional: revisão bibliográfica Monografia apresentada ao Curso de Especialização em Saúde Coletiva e Saúde da Família para a Banca Examinadora do Centro Universitário Filadélfia UniFil, para obtenção do título de Especialista. Aprovada em: / / Prof. Dr. Italmar Teodorico Navarro Orientador Prof.Ms.Vânia Oliveira Melo Membro da Banca Examinadora

Dedicatória Sempre aos meus pais, Ossiris e Beatriz pela dedicação e apoio dado em todas as minhas decisões!

PAGLIARI, Sthefany. Diagnóstico molecular da Toxoplasmose congênita e gestacional: revisão bibliográfica. 2011. 46 f. Monografia (Especialização em Saúde Coletiva e Saúde da Família) Centro Universitário Filadélfia, Londrina, 2001. RESUMO O Toxoplasma gondiié um parasita intracelular obrigatório de distribuição mundial que possui a capacidade de invadir uma enorme variedade de hospedeiros tendo os Felídeos como hospedeiros definitivos. O homem pode adquirir a infecção através da ingestão de oocistos esporulados presentes no meio ambiente, ingestão de cistos teciduais e pela via transplacentária.a transmissão congênita ocorre quando a mãe se infecta pela primeira vez durante o período da gestação, sendo assintomática e tendo o diagnóstico da infecção confirmado através da sorologia. Devido ao elevado número de resultados inconclusivos e de difícil interpretação encontrados na literatura, fez-se um levantamento bibliográfico sobre a toxoplasmose congênita e gestacional dando destaque ao diagnóstico e as principais técnicas moleculares utilizadas na identificação da infecção. As técnicas moleculares como a PCRe o WB, podem ajudar para uma melhor interpretação do estado real da interação parasito/homem, embora sejam ainda pouco validadas para uso na rotina de diagnóstico laboratorial no Brasil devido a diferenças quanto à sensibilidade e a especificidade em decorrência da grande variabilidade genotípica das cepas de T.gondii isoladas. Portanto é necessário ainda mais estudos envolvendo a caracterização genotípica das cepas, responsáveis pela infecção toxoplásmica em gestantes, nos diferentes ecossistemas do nosso país. Palavras-chave: Toxoplasmose congênita. Diagnóstico molecular. PCR. Wetern Blot.

PAGLIARI, Sthefany. Diagnóstico molecular da Toxoplasmose congênita e gestacional: revisão bibliográfica. 2011. 46 f. Monografia (Especialização em Saúde Coletiva e Saúde da Família) Centro Universitário Filadélfia, Londrina, 2001. ABSTRACT Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite with worldwide distribution. This parasite has the capacity of invading an enormous variety of hosts, but only the feline act as primary hosts. Humans can acquire infection through ingestion of sporulatedoocysts in the environment, ingestion of tissue cysts or via the placenta. The congenital transmission occurs when the mother becomes infected for the first time during pregnancy, the clinical presentation in asymptomatic and the diagnosis can be made through serological methods. Due to high number of inconclusive results with difficult interpretations found in the literature, this bibliographic survey on congenital and gestational toxoplasmosis focuses on diagnosis and the main molecular methods used for detection of this parasite. The molecular methods, such as PCR and WB, can assist to achieve a better interpretation of the real parasite / human interaction, although these methods are still little validated for routine use in the diagnosis laboratories in Brazil due to sensitivity and specificity differences. These differences are result of the great genotypic variability between isolated T. gondiistrains. Therefore more studies on genotypic characterization of strains are required. Keywords: Congenital Toxoplasmosis. Molecular Diagnosis. PCR. Western Blot.

SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO... 7 2. METODOLOGIA... 9 3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA... 10 3.1 Histórico... 10 3.2 O protozoário: Toxoplasma gondii... 11 3.3 O ciclo biológico... 12 3.4 Fontes de infecção... 16 3.5 Toxoplasmose Congênita e Gestacional... 18 3.6 Prevalência... 19 3.7 Diagnóstico... 19 3.7.1 Diagnóstico materno e fetal... 22 3.7.2 Diagnóstico no neonato... 24 3.8 Métodos Moleculares para detecção da toxoplasmose... 26 3.8.1 PCR (Polimerase Chain Reaction)... 26 3.8.2 Western blot... 30 3.12 Tratamento... 32 3.13 Estratégias de prevenção e vigilância... 32 4. CONSIDERAÇÕES FINAIS... 35 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 36

7 1. INTRODUÇÃO A toxoplasmose é uma zoonose causada pelo Toxoplasma gondii, parasita intracelular obrigatório, de distribuição mundial e que acomete animais de sangue quente (JACOBS; LUNDE, 1957). A doença possui alta prevalência sorológica, podendo atingir mais de 60% da população em determinados países, no entanto, os casos de doença clínica são menos frequentes. Em algumas regiões, 40 a 70% da população humana adulta apresentam sorologia positiva para a toxoplasmose (KAWAZOE, 2002). Condições ambientais, hábitos culturais e a própria fauna constituem alguns dos fatores que podem explicar a variabilidade desta infecção em diferentes áreas geográfica de um determinado país (DUBEY, 1977). O homem adquire a infecção por três vias principais: ingestão de oocistos esporulados presentes no meio ambiente, ingestão de cistos teciduais em carne crua ou mal cozida de animais infectados e pela via transplacentária (FRENKEL; DUBEY; MILLER, 1970). Nas gestantes, o diagnóstico precoce da infecção pelo T. gondii e o tratamento antiparasitário adequado podem reduzir a gravidade das sequelas ao feto (FOULON; NAESSENS; DERDE, 1994). A transmissão do T. gondii da mãe para o feto ocorre em 30% a 40% dos casos e a gravidade das sequelas varia de acordo com o período gestacional em que ocorre a infecção aguda (DESMONTS et al., 1985). O diagnóstico da toxoplasmose gestacional se baseia em exames laboratoriais, pois geralmente, a gestante não apresenta sintomas da infecção, entretanto, a sorologia é complexa e de difícil interpretação, sendo necessário o conhecimento das limitações de cada técnica, a avaliação do perfil das classes de imunoglobulinas presentes e a sua associação com a idade gestacional (JONES; LOPEZ; WILSON, 2003). Sem a interpretação correta dos resultados, muitas gestantes são tratadas desnecessariamente e outras, por falha ou ausência de diagnóstico, não são tratadas. Ambas as situações podem ser danosas tanto para mãe quanto para o feto (REMINGTON et al., 2006). Como auxiliar na determinação do tempo da infecção utiliza-se a detecção de anticorpos IgM específicos, entretanto, a interpretação do resultado IgM reagente é complicada pela persistência dessa imunoglobulina por mais de 18 meses após a infecção, e pela reação falso positiva dos testes comerciais (JONES; LOPEZ; WILSON, 2003; WILSON; MCAULEY, 1999). A alta sensibilidade das técnicas sorológicas atuais trouxe a realidade da presença de IgM residuais confundindo muitas vezes o diagnóstico final. Nesse sentido, o presente trabalho teve como objetivo realizar um levantamento bibliográfico sobre a toxoplasmose

8 congênita e gestacional dando destaque ao diagnóstico e as principais técnicas moleculares utilizadas na identificação desta infecção, tais como a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) e Western Blot, as quais podem ajudar a uma melhor interpretação do estado real da interação parasito/homem.

9 2. METODOLOGIA A pesquisa bibliográfica é um levantamento científico de produções compatíveis ao tema proposto (BIAZIN, 2008) e tem por finalidade conhecer as diferentes formas de contribuição científica que se realizam sobre um determinado assunto, sem ser confundida como pesquisa de documentos (OLIVEIRA, 2004). Sendo assim a presente pesquisa foi realizada com base em Teses, Dissertações, livros, manuais de orientação, artigos encontrados através de pesquisas em bibliotecas e pesquisa eletrônica nas bases de dados Pubmed e Scielo no período de Outubro de 2010 a agosto de 2011. Não houve restrições de línguas e usaram-se as seguintes palavras chaves: "toxoplasmosis, "pregnancy", "molecular diagnosis". Todo o material obtido durante a pesquisa foi revisado e incluído de acordo com os seguintes critérios de seleção: revisões, artigos completos e estudos originais relacionados com a toxoplasmose congênita e gestacional no âmbito do diagnóstico sorológico e molecular, prevenção e tratamento, incluindo obras nacionais e internacionais.

10 3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 3.1 Histórico O protozoário T. gondii foi primeiramente encontrado no baço, fígado e sangue de um pequeno roedor popularmente conhecido como gondi (Ctenodactylus gundi), descrito por Nicolle e Manceaux em 1908, no Instituto Pasteur da Tunísia, Norte da África sendo denominado de Leshimania gondii (NICOLLE E MANCEAUX, 1909). Ao mesmo tempo e independentemente Splendore isolou o parasita de um coelho mantido no Instituto Biológico de São Paulo no Brasil e o denominou de Toxoplasma cuniculli. Somente no ano seguinte, baseado nas características morfológicas foi proposta a denominação T.gondii para o parasita pertence ao filo Apicomplexa, cujo gênero é derivado do grego toxon (arco) e plasma (molde), devido ao seu formato curvado e crescente. A primeira descrição da infecção por T.gondii em humanos ocorreu na cidade de Praga, em uma criança de 11 meses que faleceu de hidrocefalia congênita, microftalmia e formação de cistos oculares (JANKU, 1923). Em 1927, Torres encontrou lesões no sistema nervoso central, coração e músculo esquelético e a presença de um parasito intracelular de uma menina recém-nascida no Rio de Janeiro (GUIMARÃES, 1943). Somente no ano de 1939, a infecção congênita foi descrita por Wolf, Cowen e Peige, como causa da morte de uma menina com um mês de vida que desenvolveu convulsões e coriorretinite em ambos os olhos após três dias de idade sendo que os achados de T.gondii foram isolados de animais inoculados com material da medula espinhal e córtex cerebral após a necropsia da mesma. No ano de 1940, Pinkerton e Weinman foram os primeiros a descreverem a doença em um adulto de 22 anos, do Peru, e um ano depois Pinkerton e Henderson relataram outros dois casos em adultos com idade entre 40 a 50 anos em St. Louis, Missouri, demostrando a presença de T.gondii como agente etiológico nos tecidos pós mortem e passagem seriada em animais. Esses foram os primeiros relatos de toxoplasmose aguda em adultos com ausência de sinais neurológicos (revisado por WEISS e DUBEY, 2009). Somente após a introdução das técnicas sorológicas desenvolvidas por Albert Sabin e Feldman Herry, como o teste de corante, que se tornou possível a realização de estudos epidemiológicos sobre a real incidência da infecção pelo T.gondii no homem e a prevalência mundial desta infecção (SABIN e FELDMAN, 1948).

11 3.2 O protozoário: Toxoplasma gondii O T. gondii é um protozoário pertencente ao reino Protista, sub-reino Protozoa, filo Apicomplexa, classe Sporozoa, subclasse Coccidia, ordem Eucoccidiida, subordem Eimeriina, família Sarcocystidae, subfamília Toxoplasmatinae, gênero Toxoplasma, espécie Toxoplasma gondii (KAWAZOE, 2002). É um eucarionte estruturalmente formado por uma membrana externa, anéis polares, conóide, microtúbulos, grânulos densos, micronemas, roptrias, mitocôndria, retículo endoplasmático, complexo de golgi, ribossomos, retículo endoplasmático rugoso, microporo e um núcleo com parede bem definida (figura 1) (METSIS e PETERSEN, 1995). Três linhagens clonais tipicamente distintas do T.gondii são designadas em cepa tipo I, II e III, que diferem em virulência e padrão epidemiológico de ocorrência. Na Europa e América do Norte, mais de 95% dos isolados pertencem quase que exclusivamente a um dos três tipos. Na França, mais de 600 isolados pertencem ao tipo II, inclusive os isolados da toxoplasmose congênita (BECK et al., 2009). Em pacientes com doença congênita, são relatados os tipos I e II, já os isolados em animais são predominante do genótipo tipo III. As cepas de T. gondii tipo I são extremamente virulentas, produzindo altos níveis de parasitemia com aumento do risco de transmissão transplacentária e aumento da morbi-mortalidade em fetos em desenvolvimento. Já as cepas dos tipos II e III levam a cronificação da infecção e produção de cistos teciduais (HOWE e SIBLEY, 1995)

12 Figura 1- Morfologia geral da forma taquizoíta de Toxoplasma gondii. (A) Representação esquemática. O esquema foi construído a partir de corte aleatórios do parasito observados em microscopia eletrônica de transmissão. (B) Corte longitudinal onde várias das estruturas representadas em (A) estão assinaladas: N - núcleo, c - conóide, R - róptrias, A - apicoplasto, CG - Complexo de Golgi, g - grânulo denso, seta - micronema, VP - vacúolo parasitóforo. Barra: 1μm. Fonte: Souza et al., 2010. 3.3 O ciclo biológico O T. gondii é um parasita intracelular obrigatório que possui a capacidade de invadir uma enorme variedade de células, tecidos e hospedeiros, porém somente os membros da família Felidae (gatos domésticos e felídeos selvagens) são os hospedeiros definitivos do parasita, podendo excretar 100.000 oocistos/g de fezes, no período de uma a duas semanas na primoinfecção (FRENKEL et al., 1970) e seu ciclo biológico envolve duas fases, uma assexuada e uma sexuada que ocorre somente nos hospedeiros definitivos (figura 2). As três principais formas evolutivas do T.gondii são os taquizoítas, encontrado na fase aguda da infecção como forma proliferativa capaz de invadir as células do hospedeiro, os bradizoítas ou cistos teciduais, presente em vários tecidos na fase crônica da infecção e os oocistos que são produzidos nas células intestinais dos felídeos sendo muito resistentes as condições ambientais devido à presença da dupla parede (figura 3) (KAWAZOE, 2002).

13 Na fase assexuada, após a ingestão de cistos ou dos oocistos ocorre a liberação dos bradizoítas ou esporozoítas por degradação enzimática e as formas infectantes são liberadas no lúmen intestinal, que invadem o tecido dos hospedeiros e transformam-se em taquizoítas, multiplicando-se localmente e se disseminando por todo o organismo pela via hematógena. Essa série de eventos caracteriza o chamado ciclo extra-intestinal, tecidual ou sistêmico, fase assexuada ou esquizogonia (DUBEY et al, 1998; FORTES, 1997). Em aproximadamente duas semanas, os bradizoítas se confinam no citoplasma das células, em cistos, quando o hospedeiro começa a desenvolver imunidade, fazendo com que a taxa de multiplicação do parasita diminua (MARTINS, 2003). A resposta imune do hospedeiro destrói os taquizoítas, mas os bradizoítas ficam protegidos pelo cisto intracelular e permanecem viáveis, por muitos anos, em estado latente. Nos felídeos, a fase sexuada se dá no epitélio do intestino desses animais por um processo denominado gametogonia, já a esporogonia é o processo pelo qual o oocisto torna-se infectante no meio ambiente contendo dois esporocistos cada um contendo quatro esporozoítas. No interior das células epiteliais intestinais os parasitas crescem, transformamse em esquizontes, reproduzem-se e originam os merozoítas. Estes invadem outras células epiteliais e prossegue o processo de multiplicação assexuada. O ciclo sexuado começa dois dias após a ingestão dos cistos teciduais, alguns merozoítas originam macrogametócitos, e outros, microgametócitos. Estes deixam as células da parede intestinal, atingem a luz do intestino e são atraídos pelos macrogametas. A fecundação ocorre na célula da parede intestinal, com a união dos dois núcleos e resultará na formação de um ovo ou zigoto que, após segregar a parede cística, dá origem ao oocisto. As células epiteliais infectadas se rompem e despejam os oocistos no lúmen intestinal, que começam a ser eliminados junto com as fezes dos felídeos cinco a dez dias após o repasto infectante isto é, o momento em que o animal foi infectado e a eliminação permanece por 1 a 2 semanas (DUBEY, 1994; MILLER, 1997). Estes são encontrados em todo o intestino delgado, principalmente no íleo em 3 a 15 dias após inoculação (DUBEY et al, 1998). A origem dos gametas ainda não foi determinada. Nesta fase, o gato elimina os oocistos, entretanto, estes devem esporular antes de se tornarem infectantes, processo que leva de 1 a 5 dias após a excreção. A esporulação ocorre no ambiente sendo dependente da temperatura e umidade (DUBEY, 1994; DUBEY et al, 1998), após a maturação, os oocistos podem permanecer por muito tempo viáveis no ambiente numa temperatura entre 20 C e 37 C, desde que não

14 expostos à luz solar direta e sob condições razoáveis de umidade relativa (DUBEY; FRENKEL, 1972). Figura 2- Ciclo biológico de Toxoplasma gondii. Fonte: Mistuka-Breganó; Lopes-Mori; Navarro (2010).

15 Figura 3- Estágios morfológicos de T.gondii. (A) Taquizoítas circulantes. As setas apontam taquizoítas individuais em forma crescente, enquanto as cabeças de seta apontam taquizoítas em divisão; (B) Cistos teciduais em corte de músculo esquelético. A seta está apontando para a fina parede do cisto, enquanto as cabeças de seta estão apontando para bradizoítas no seu interior; (C) Cisto tecidual separado dos tecidos do hospedeiro por homogeneização de cérebro infectado. A parede do cisto está apontada pela seta, enquanto centenas de bradizoítas no seu interior estão apontados pelas cabeças de seta; (D) Esquizonte com alguns merozoítas (cabeça de seta) presentes em tecido intestinal de gato infectado; (E) Gameta masculino com dois flagelos (setas) presente em tecido intestinal de gato infectado; (F) Oocisto não esporulado eliminado nas fezes de gato infectado. Sua parede é formada por duas camadas (seta) circundando uma massa central única; (G) Oocisto esporulado com uma parede mais fina (seta maior), dois esporocisto (cabeça da seta). Cada esporocisto contém quatro esporozoítas (seta menor), não totalmente focados nesta figura. Fonte : HILL e DUBEY, 2002

16 3.4 Fontes de infecção Muitos fatores estão associados à ocorrência da infecção de toxoplasmose incluindo clima, comportamento cultural, hábitos alimentares e padrões de higiene (RORMAN et al., 2006). A infecção pelo T. gondii ocorre principalmente pelo consumo de carnes cruas ou mal cozidas, contendo cistos teciduais viáveis, alimentos e águas contaminados pelos oocistos esporulados provenientes das fezes dos felídeos. Dubey (2004) e Dubey e Shen (1991), afirmam que as infecções causadas por oocistos esporulados, em humanos são mais severas comparadas com aquelas induzidas por cistos teciduais, porém não existem testes capazes de diferenciar as fontes de infecções (GAGNE, 2001). Os oocistos também podem ser veiculados mecanicamente por artrópodes como moscas, baratas e besouros (LINDSAY; BLAGBURN; DUBEY, 1997). O solo contaminado com oocistos do T. gondii provenientes dos gatos domésticos é uma via de transmissão de grande importância epidemiológica, já o contato com o animal não resulta grande perigo porque os oocistos não se aderem aos pelos do animal (DUBEY, 2006). Além da infecção usual pela ingestão de cistos teciduais ou por oocistos esporulados, outras vias de transmissão são os transplantes de órgãos, transmissão congênita, transfusão sanguínea e acidentes de laboratório tem sido relatado (MONTOYA e LIESENFELD, 2004). A transmissão congênita ocorre quando a mãe se infecta pela primeira vez durante o período da gestação (DUBEY, 1977) podendo causar danos de diferentes graus de gravidade dependendo da virulência da cepa do parasito, da capacidade da resposta imune da mãe, do período gestacional, além da fase de vida do parasita e quantidade de inóculo, ou menos comumente quando mulheres cronicamente infectadas têm imunocomprometimento importante durante o período gestacional (REMINGTON et al., 2001). Muitos recémnascidos, infectados congenitamente, podem não apresentar sintomas, no entanto deverão desenvolver sequelas após o nascimento (MCAULEY, 1994). Os sintomas clássicos da toxoplasmose congênita são a hidrocefalia, a coriorretinite, a calcificação cerebral e o retardo mental, conhecida como Tétrade de Sabin que pode tanto manifestar na infância como na fase adulta. Diversos surtos de toxoplasmose ligados à ingestão de água não filtrada contaminada vêm sendo relatados. No Canadá em 1995, houve um súbito aumento no número de casos de toxoplasmose aguda, onde cerca de 100 indivíduos foram afetados e destes, 19 apresentaram retinite e 51 tiveram linfadenopatia. Após o estudo e mapeamento dos casos concluiu-se que a

17 provável via de transmissão foi a água fornecida pelo sistema municipal, que era apenas clorada e não filtrada (BOWIE et al., 1997). O primeiro surto de toxoplasmose relatado no Brasil, causado pela água contaminada ocorreu na cidade de Santa Isabel do Ivaí, no estado do Paraná, no ano de 2001, onde um dos reservatórios que abastece a cidade foi contaminado por oocistos liberados pelos filhotes de uma gata doméstica que vivia no local. Mais de 600 pessoas se infectaram e 10 mulheres gestantes soro-converteram, destas, seis bebês nasceram com toxoplasmose congênita e houve um abortamento. Segundo Silveira (2002) a Vigilância Sanitária deve ficar em alerta para a importância da qualidade da água de beber como via de transmissão da toxoplasmose, pois este episódio demonstrou a vulnerabilidade dos sistemas de abastecimento de água para a contaminação por oocistos de protozoários. Em estudos realizados por Mead et al. (1999) a toxoplasmose foi a terceira maior causa de morte atribuída à transmissão pela ingestão de alimentos contaminados (21%), perdendo apenas para a salmonelose (31%) e para a listeriose (28%). A maioria dos óbitos por toxoplasmose ocorreu em pacientes HIV (Vírus da Imunodeficiência Humana) positivos. Uma pesquisa realizada pelo Serviço de Pesquisas Econômicas do Departamento de Agricultura dos EUA concluiu que metade dos casos de toxoplasmose dos EUA são causadas pela ingestão de carne contaminada. O custo desta infecção foi estimado em 7,7 bilhões de dólares por ano, principalmente com a toxoplasmose congênita (BUZBY; ROBERTS, 1996). No Brasil a prevalência da infecção em humanos é elevada, chegando a 100% em algumas regiões, mas estes dados podem variar entre os países, áreas geográficas dentro do mesmo país e até em grupos étnicos de uma mesma região (DUBEY et al., 2006). Cook et al., (2000) em um estudo multicêntrico europeu, determinaram que a ingestão de carne crua ou mal cozida corresponde ao principal fator de risco para a infecção em gestantes, em 30% a 63% dos casos, seguido do contato com o solo contaminado, com 6% a 17% das infecções. Em um estudo realizado por Roghmann et al. (1999) a prevalência de toxoplasmose encontrada em um grupo de 105 pessoas pertencente a um grupo religioso, cuja alimentação é livre de carne foi de 18%, mais baixa quando comparado ao grupo controle, composto por 146 pessoas que não tinham restrição à alimentação com carne, sendo a prevalência de 40%. Esta informação sustenta a estimativa de que aproximadamente metade dos casos de exposição ao T. gondii são devidos à ingestão de carne contaminada. Carne fresca e linguiça suína tipo frescal são, provavelmente, as principais vias de transmissão do T. gondii em muitos países, seguidas das carnes de caprinos, ovinos e aves (DUBEY; TOWLE, 1986).

18 3.5 Toxoplasmose Congênita e Gestacional A toxoplasmose congênita é definida como a infecção contraída pela mãe e transmitida ao feto. Embora existam relatos de que possa acorrer durante a fase crônica da infecção, assume-se que a transmissão congênita só deve ocorrer durante a primoinfecção materna (FRENKEL, 2004). O parasito atinge o concepto via transplacentária causando danos de diferente gravidade, podendo resultar em morte fetal ou em graves sintomas clínicos (SPALDING et al., 2002), dependendo da taxa de transmissão fetal que varia de acordo com a parasitemia materna, idade gestacional no momento da infecção e competência da resposta imunológica materna ao T. gondii (WILSON; REMINGTON, 1992). Pode ocorrer ainda o nascimento de crianças normais que posteriormente irão apresentar alterações de retinocoroidite, retardo mental ou até distúrbios psicomotores. Durante a infecção aguda, o T. gondii passa pelo epitélio intestinal, dissemina-se para os tecidos e atravessa as barreiras biológicas, tais como a placenta e a barreira hematoencefálica, para alcançar sítios imunologicamente privilegiados, onde o parasito causa as patologias mais severas como: a toxoplasmose congênita disseminada (PEYRON et al., 2003), complicações neurológicas severas em indivíduos imunocomprometidos (COHEN, 1999) e patologias oculares em indivíduos saudáveis (SILVEIRA et al., 2001). Embora a gravidade da doença no feto seja inversamente proporcional à idade gestacional, ou seja, no início da gestação as lesões são mais graves, a taxa da transmissão vertical é diretamente proporcional à idade gestacional, a qual a mãe se encontra quando adquire a primoinfecção (SÁFADI et al., 2003). Desmonts e Couvreur (1974) estudaram 180 gestantes, dividindo-as em três grupos de acordo com o trimestre em que provavelmente adquiriram a infecção, o parasito foi transmitido para 17% dos fetos quando a infecção foi adquirida no primeiro trimestre, 24% dos fetos adquiriram a infecção no segundo trimestre e 62% no terceiro trimestre. Sáfadi et al. (2003) avaliaram e acompanharam 43 crianças com toxoplasmose congênita atendidas na Santa Casa de São Paulo (SP) durante cinco anos. Os autores encontraram uma predominância de 88% de infecção subclínica ao nascimento, 51% de desenvolvimento de manifestações neurológicas, 95% de alterações oculares. Três crianças, que inicialmente apresentaram exames oculares normais, desenvolveram coriorretinite após anos do diagnóstico, mesmo tendo sido tratadas durante o primeiro ano de vida. Cinco outras crianças com diagnóstico tardio e consequentemente não tratadas durante o primeiro ano de

19 vida manifestaram reativação de lesões oculares. Este estudo nos demonstra a importância do diagnóstico e tratamento precoce, uma vez que na ausência do tratamento houve progressão das lesões, já que 88% das crianças não tinham sintomas ao nascimento, mas 51% desenvolveram manifestações neurológicas durante o acompanhamento. 3.6 Prevalência A prevalência de anticorpos IgG anti- T. gondii apresenta variações regionais, devido à diferenças climáticas e, sobretudo, culturais da população. Em diferentes países, a frequência de aquisição de toxoplasmose durante a gravidez varia de um a 14 casos por 1.000 gestações, no entanto, a infecção congênita ocorre em 0,2 a 2,0 recém-nascidos por 1.000 nascimentos. Spalding et al. (2002) encontraram uma taxa de transmissão de 2,2 em 1.000 nascimentos e de 0,7 em 1.000 nascidos vivos apresentando sintomatologia. Neto et al. (2000) verificaram, no Rio Grande do Sul, uma prevalência de 1: 3000 nascidos vivos. Estudo realizado em gestantes atendidas pelo SUS, nas Unidades Básicas de Saúde de Londrina, em 2006, revelou uma prevalência de anticorpos IgG anti- T. gondii de 51,16% e IgM anti-t. gondii de 1,55%, segundo dados de 2009 de Lopes, a cidade de Londrina-PR possui uma prevalência de anticorpos IgG anti-t. gondii de 49,2% e uma prevalência observada de 1,2% dos anticorpos IgM. Foram analisados vários fatores que poderiam estar envolvidos na infecção, sendo que a renda per capita, grau de escolaridade, presença de gato na residência e hábito de ingerir verduras e legumes crus foram associados à maior chance de adquirir a toxoplasmose, enquanto que a ingestão de carnes cruas ou mal passadas e o contato com solo não demonstraram esta associação (LOPES, 2009). 3.7 Diagnóstico A metodologia mais utilizada para o diagnóstico sorológico da toxoplasmose consiste na pesquisa de anticorpos contra o parasita através da pesquisa de diferentes classes de imunoglobulinas IgG, IgM, IgA e IgE anti-toxoplasma. A presença dos anticorpos antitoxoplasma no curso da infecção permite a análise de perfis sorológicos muito característicos, seja de infecção recente, em fase aguda com a detecção de IgM, ou de infecção antiga em fase de latência ou crônica com a detecção de IgG (CONTRERAS et al., 2000). A detecção desses

20 anticorpos depende da sensibilidade dos testes, uma vez que a imunoglobulina IgM pode persistir por períodos variáveis (LESER et al., 2003; SENSINI, 2006). No diagnóstico de adultos imunocomprometidos e na infecção fetal, há necessidade de testes para a detecção do T. gondii, já em indivíduos imunocompetentes os testes sorológicos com pesquisa de IgG e IgM são suficientes para o diagnóstico, por serem sensíveis, específicos e de fácil execução (CAMARGO, 2001). O teste do corante de Sabin Feldman, a imunofluorescência indireta e o ensaio de aglutinação por imunoabsorção de IgM, demonstram principalmente anticorpos dirigidos contra os antígenos da membrana do parasita e o teste de hemaglutinação indireta e o ensaio imunoenzimático usam o extrato antigênico de parasitas lisados (DUFFY et al, 1989). A reação de Sabin-Feldman é o processo sorológico clássico para o diagnóstico da toxoplasmose, este teste baseia-se no princípio imunológico, onde os parasitas expostos a um soro contento anticorpos anti-toxoplasma, sofrem lise da membrana citoplasmática após a reação antígeno-anticorpo e ativação do complemento, sendo corados por azul de metileno. Quando existem anticorpos contra o parasita no soro, ele não se cora (SABIN e FELDMAN, 1948). Apesar da sua elevada sensibilidade e especificidade, seu uso se tornou restrito em decorrência da complexidade da técnica empregada e do risco de contaminação com os antígenos vivos de T. gondii, além de não ser possível diferenciar anticorpos IgM e IgG (REMINGTON et al., 2001). A reação de fixação de complemento é um método que por ser de difícil realização e necessitar de reagentes de difícil padronização caiu em desuso, uma vez que depende do consumo de complemento exógeno em sistemas padronizados (SANCHEZ, 1996). A reação de aglutinação por imunoabsorção (ISAGA- immunosorbent agglutination assay), os antígenos adicionados às placas constituem-se em uma suspensão de toxoplasmas, que se aglutinam na presença de IgM específica. Esta reação é utilizada para identificação de anticorpos IgM, sendo importante no diagnóstico de infecção aguda. (DESMONTS et al, 1981). No teste de hemaglutinação indireta (HAI), hemácias de aves são recobertas com antígenos completos do parasita e aglutinam na presença de anticorpos IgG e IgM. Apesar do baixo custo empregado na realização do teste de hemaglutinação, este não é usualmente recomendado para diagnósticos em rotinas laboratoriais visto que, diferentes preparações de antígenos causam resultados distintos (REMINGTON et al., 2001) e ocasionalmente observam-se resultados falso-positivos por interferência de anticorpos IgM naturais, aglutininas IgM não-específicas, em geral de títulos baixos (CAMARGO et al., 1989).

21 Outro método sorológico utilizado amplamente em laboratórios de rotina e pesquisa é o teste de Imunofluorescência Indireta (IFI), segundo Sanchez (1996) esta técnica é considerada de boa especificidade, sensibilidade e apresenta uma maior rapidez na execução, reprodutibilidade e preservação dos reagentes quando comparado ao teste do corante de Sabin-Feldman. Na IFI, utiliza-se, como antígeno, o parasita preservado e fixado em lâminas de microscopia, tornando-o muito mais prático e seguro para a rotina laboratorial além de permitir a identificação dos anticorpos segundo as classes de imunoglobulina. Porém a leitura e a interpretação dos resultados são subjetivas podendo apresentar resultados falso-positivos IgM pela interferência de fatores reumatóides, eventualmente presentes no soro (CAMARGO et al., 1972; REMINGTON et al., 1985; WILSON et al., 2003). Os testes para anticorpos IgM podem também revelar resultados falso-negativos, devido à competição que os anticorpos IgG fazem aos IgM, impedindo que estes se fixem aos antígenos parasitários (CAMARGO et al., 1972). Fialho e Araújo (2002) compararam as técnicas de IFI e HAI e concluíram que para fins de diagnósticos a IFI é superior a HAI e que esta reação tem sua principal indicação em inquéritos epidemiológicos. Os testes de IFI por serem manuais estão sendo substituídos por tecnologias automatizadas, que apresentam maior facilidade de realização, porém devido a sua capacidade em detectar níveis mínimos de anticorpos IgM circulantes, a interpretação dos resultados dos testes sofreu alterações em especial quando aplicados em uma rotina, no rastreamento de infecções assintomáticas, como é o pré-natal. Em especial para a gestante, há a possibilidade de resultados falso-positivos para infecção aguda ou a detecção de infecções assintomáticas em maior número (BARINI et al., 2000). Com a introdução do ensaio imunoenzimático - ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) o diagnóstico da toxoplasmose teve um grande avanço. Esta técnica é baseada na reação se soros testes com antígenos imobilizados em placas de microtitulação de poliestireno, onde o anticorpo específico presente na amostra testada liga-se ao antígeno sendo demonstrado pela adição de conjugado imunoenzimático (anti-imunoglobulina marcada com enzima) seguido pela reação da enzima com o substrato e tampão cromógeno. A coloração gerada pode ser mensurada por meio de leitura em espectofotômetro comparada com a coloração desenvolvida pelo controle negativo (VOLLER, et al., 1976). No início da década de noventa, foi desenvolvido o teste ELISA IgG para avidez, que parece ser um marcador informativo de infecção aguda adquirida. Este método avalia a avidez ou afinidade funcional de ligação ao antígeno dos anticorpos IgG contra o T. gondii,

22 separando os de baixa afinidade, produzidos numa fase inicial da infecção, dos anticorpos de alta afinidade indicativos de infecção crônica (JOYNSON et al, 1990). Agentes desnaturantes de proteínas, como a uréia, são usados para dissociar a ligação dos complexos antígenosanticorpo, de modo que apenas os anticorpos de maior avidez (maior afinidade) permanecem ligados ao antígeno (HEDMAN et al., 1989). O Ensaio Imunoenzimático de Micropartículas (MEIA) utiliza uma suspensão de micropartículas em látex para medir a concentração de substâncias a ser analisada. As partículas são revestidas com o antígenos para o anticorpo anti-t.gondii (BARBOSA, 2006) e incubadas com o soro a ser testado. Em seguida, uma alíquota de complexo antígenoanticorpo antitoxoplasma é transferida sobre uma matriz de fibra de vidro que fixa os complexos. Após a lavagem, são adicionadas as imunoglobulinas humanas anti-igm ou anti- IgG conjugadas à fosfatase alcalina. Após a segunda lavagem é acrescido um substrato enzimático e é medida a fluorescência emitida pela desfosforilação do substrato. O resultado de IgG é expresso em UI/ml (segundo as curvas de calibração obtida com os padrões da OMS) enquanto que a IgM é expressa em índice (taxa de fluorescência produzida pelo soro testado em relação à fluorescência emitida pelo calibrador do aparelho) (STELLA, 2004). Embora estas reações estejam sujeitas a alguma discrepância de resultado, pois ainda não estão suficientemente padronizadas, vêm assumindo importância crescente como marcadores de infecções recentes, inclusive congênitas (DECOSTER et al., 1992; WONG et al., 1993). Apesar de serem considerados de grande importância no diagnóstico da toxoplasmose, os testes sorológicos são ainda muito frágeis, requerem habilidade técnica, consomem tempo e necessitam de equipamentos adequados. Além disso, o diagnóstico baseado apenas na clínica e na sorologia nem sempre é possível devido à complexidade da interpretação dos marcadores de fase aguda como, por exemplo, a persistência de IgM e da avidez de IgG que pode gerar falhas no diagnóstico da gestante (CASTILHO-PELLOSO et al., 2005). 3.7.1 Diagnóstico materno e fetal O diagnóstico de toxoplasmose na gestante é confirmado através de pacientes soronegativas que apresentam soro-conversão e daquelas com perfil sorológico de toxoplasmose recém-adquirida. Sabe-se que os anticorpos IgG normalmente aparecem uma a duas semanas após a infecção, atingem pico dentro de um a dois meses e apresentam um

23 declínio, permanecendo definitivamente presentes e atestando imunidade adquirida. A presença de IgG indica que ocorreu a infecção, mas o título ou grau de reatividade não indica se a infecção foi tardia ou recente. O aparecimento dos anticorpos IgM é mais precoce e seu declínio é mais rápido do que a IgG (LIESENFELD et al., 2001). De acordo com os resultados, a gestante será considerada imune na presença de IgG positiva e IgM negativa, suscetível quando os anticorpos IgG e IgM são negativos e imune ou portadora de infecção aguda se IgG e IgM estão positivas. Devido ao grande número de gestantes que não apresentam anticorpos para T. gondii, à necessidade de repetição dos testes a cada quatro ou cinco semanas naquelas que permanecem soronegativas e ao número significativo de recém-nascidos acometidos pela toxoplasmose congênita, torna-se necessário o conhecimento das manifestações clínico-laboratoriais da toxoplasmose na gestante e o momento da soroconversão materna, a fim de iniciar precocemente o tratamento antiparasitário e reduzir a possibilidade de alterações no feto, para tanto são necessários testes sensíveis para a triagem, porém de baixo custo e de execução simples, capazes de detectar anticorpos IgG e IgM e de fornecerem resultados em curto prazo (figura 4 e 5) (JONES et al., 2003, MISTUKA-BREGANÓ; LOPES-MORI; NAVARRO, 2010) Figura 4 - Interpretação de resultado e condutas para gestantes com até 16 semanas de gestação. Fonte: MISTUKA-BREGANÓ; LOPES-MORI; NAVARRO (2010).

24 Figura 5 - Interpretação de resultado e condutas para gestantes a partir das 16 semanas de gestação. Fonte: MISTUKA-BREGANÓ; LOPES-MORI; NAVARRO (2010). 3.7.2 Diagnóstico no neonato A maioria das crianças infectadas no período pré-natal não apresentam sintomas ao nascimento, mas há probabilidade de apresentarem sequelas no futuro (JONES et al., 2001). O diagnóstico da toxoplasmose no recém-nascido baseia-se principalmente no acompanhamento sorológico, interpretado de forma criteriosa e sempre associado aos dados clínicos e epidemiológicos (HOLLIMAN, 1990). A detecção de IgM, IgA, e IgE no sangue do cordão ou no sangue do recém-nascido é diagnóstico de infecção congênita, caso não tenha ocorrido contaminação com o sangue materno, tanto nos casos sintomáticos como nas infecções subclínicas (REMINGTON et al., 2001). A pesquisa de anticorpos IgM tem sido amplamente executada como marcador de toxoplasmose congênita pós-natal, devido ao seu peso molecular, a IgM não atravessa a barreira placentária íntegra, indicando infecção aguda na criança (NAESSENS et al., 1999).

25 A demonstração de anticorpos IgM depende da idade gestacional no momento da infecção materna, a taxa de soropositividade é 10% quando a infecção materna ocorre na 10ª semana, 20% e 60% de soropositividade na 20ª e 30ª semana respectivamente (REMINGTON et al., 2006). Resultados falso-positivos podem ocorrer devido a presença de fator reumatoide, anticorpos antinucleares, grande quantidade de anticorpos IgG maternos (que podem suprimir a produção neonatal específica de IgM) e lesão com escape placentário de IgM materno (CAMARGO, 2001; REMINGTON et al., 2001; SÁFADI e FARHAT, 1999;), portanto, um resultado IgM não reagente com suspeita clínica não exclui toxoplasmose congênita, sendo aconselhável a repetição do exame em 1 e 2 meses após o nascimento (CAMARGO, 2001). Para evitar essas falsas reações, utilizam-se testes de captura de IgM, mais sensíveis e específicos (CAMARGO, 2001). Em relação à análise do líquor de recém-nascidos, a presença de anticorpos para T. gondii é altamente sugestiva de infecção no sistema nervoso central, uma vez que o anticorpo materno não atravessa a barreira hematoencefálica normal e sua presença indica uma lesão. Mas, o diagnóstico definitivo se estabelece a partir da evidenciação do parasito por PCR (REMINGTON et al., 2001). A síntese de anticorpos IgG contra o Toxoplasma geralmente se inicia no terceiro mês de vida se o lactente não é tratado. Nos casos em que o lactente é submetido à terapêutica precoce, tal síntese poderá se iniciar somente após o sexto mês de vida. Desta maneira, é possível fazer o diagnóstico da infecção congênita através da monitorização sequencial das dosagens de anticorpos IgG contra o Toxoplasma (SÁFADI e FARHAT, 1999). Os títulos de anticorpos IgG para T. gondii caem progressivamente, nos recém-nascidos não infectados, até a negativação em prazos de poucos meses a um ano, porém, nos infectados, estes títulos são ascendentes (LEBECH et al., 1996). Devido aos resultados falso-negativos dos métodos de diagnóstico fetal, todas as crianças nascidas de mães com toxoplasmose aguda devem ser submetidas a exames sorológicos e clínicos para a detecção de possível infecção e sequelas. Após a confirmação do diagnóstico materno e/ou neonatal, o tratamento deve ser instituído o mais precocemente possível (OLIVEIRA, 2002).

26 3.8 Métodos Moleculares para detecção da toxoplasmose Os métodos moleculares que não dependem da resposta imune e permite a detecção do parasita, têm sido usados para estabelecer o diagnóstico mais acurado da infecção assim como na caracterização genotípica do isolado, determinando a cepa envolvida (SWITAJ, 2005). Devido ao amplo número de hospedeiros e à distribuição em nível mundial, uma grande variabilidade genética entre os isolados do T. gondii tem sido descrita (DUBEY et al., 2004) Vários antígenos de T.gondii têm sido definidos e caracterizados por anticorpos policlonais e monoclonais em reações de Western blot. A maioria destes antígenos está associada com estruturas da superfície do parasita (SAG), ou no interior das organelas secretoras (MIC), as roptrias (ROP) e os grânulos densos (GRA). A partir da análise por Western Blot é possível diferenciar IgG e IgM produzidos a partir da infecção fetal daqueles produzidos pela mãe (REMINGTON et al., 2005). Segundo Camargo (2001), a evidenciação do parasito, por isolamento a partir do material do paciente ou pela demonstração de seus componentes, como antígenos ou segmentos do DNA, é de alto valor diagnóstico, especialmente nos imunocomprometidos, seja por imunodepressão, como nos aidéticos ou transplantados, ou por imunoimaturidade como no feto e no recém-nascido. 3.8.1 PCR (Polimerase Chain Reaction) Em 1985, a estratégia para se amplificar um alvo genômico mediante a replicação do DNA in vitro foi descrita (SAIKI, 1985), os avanços recentes no conhecimento do genoma do T. gondii tornaram possível a utilização da PCR para a detecção do parasito (BASTIEN, 2002; WONG e REMINGTON, 1994). A técnica de PCR baseia-se na detecção do DNA do T. gondii em fluídos corporais ou fragmentos de tecidos e na amplificação de uma sequência dos genes específicos do T. gondii. Teoricamente, a partir de um único parasito na amostra, a PCR permite obter mais de 1.000.000 de cópias de um fragmento de genoma de algumas centenas de pares de bases após 30 ciclos de amplificação (COUTO et al., 2003). Um resultado positivo na PCR não permite distinguir entre taquizoítas e formas císticas, mas a evidenciação do parasito, independente de sua forma, em pacientes imunossuprimidos e fetos, é diagnóstico de infecção (CAMARGO, 2001).

27 A primeira etapa da PCR é a hibridização de primers específicos do genoma do parasita, escolhida com base na existência de várias cópias dessa sequência no DNA do mesmo. Vários segmentos do DNA correspondentes a diferentes genes, podem ser utilizados para a identificação do Toxoplasma, por apresentarem maior sensibilidade (AUBERT et al., 2000). O gene B1 encontrado em diferentes cepas, foi isolado e descrito por Boothroyd e Grigg. (2002), possui um tamanho de 2,2Kb, é a sequência mais utilizada possuindo 35 cópias genômicas (BURG et al., 1989). Junto a 100 mil células humanas, esses autores conseguiram detectar até um único parasito, mostrando a alta especificidade do gene B1 do T. gondii e a característica de ser uma região conservada em todas as cepas testadas. Apesar de estudos recentes demostrarem a baixa especificidade desse sistema, uma vez que foi evidenciada a coamplificação de outras sequências-alvo nos cromossomos humanos, o gene B1 ainda continua sendo o alvo mais usado no diagnóstico de parasitemia (KOMPALIC-CRISTO et al., 2004). Em um estudo realizado por Reischl et al. (2003), utilizando a sequência AF146527 de 529 pb, que apresenta 200-300 cópias genômicas, demostram um aumento em 10 vezes a sensibilidade da técnica, pois o limite de detecção do DNA genômico foi de 20fg e de 200 fg quando usado o gene B1. Porém, Filisetti et al. (2003) ao compararem a sequência do gene B1, Af 146527 e a sequência do DNA ribossomal 18S, não encontraram diferença significativa entre os três primers, tanto na especificidade quanto na sensibilidade da técnica. A detecção de sequências específica do genoma do parasita pode ser realizada a partir de amostras de líquido amniótico, sangue, líquor, urina, humor vítreo, humor aquoso, lavado broncoalveolar, fluído pleural e peritoneal, fragmentos de placenta e tecidos diversos (REMINGTON, THULLIEZ, MONTOYA, 2004; SWITAJ, et al., 2005). A PCR só será positiva em casos de parasitemia, assim, esta técnica será de utilidade apenas quando houver disseminação ou passagem do parasito para o sangue, tal como ocorre na etapa aguda dessa parasitose (KHALIFA et al., 1994). O diagnóstico pré-natal da toxoplasmose congênita utilizando a PCR no líquido amniótico foi inicialmente proposto por Grover et al. em 1990, sendo indicado para todas as gestantes com resultados positivos, sugestivos de infecção aguda adquirida durante a gestação ou quando há existência de danos fetais observados pela ultrassonografia (HOHLFELD et al., 1994). O valor preditivo positivo e a especificidade da PCR em líquido amniótico são próximos a 100% para o diagnóstico pré-natal da toxoplasmose congênita, já a sensibilidade e o valor preditivo negativo variam de acordo com a idade gestacionais sendo maiores quando a infecção ocorre entre as 17º e 21º semana de gestação (ROMAND et al., 2001).

28 Holfeld et al. (1989) utilizando a técnica de PCR por amniocente, encontrou uma sensibilidade de 92% e especificidade de 100%, ao passo que Jenum et al. (1998) encontraram 33% e 94%, respectivamente, no diagnóstico pré-natal de infecção fetal. Em 1994, Hohlfeld et al. estudaram 339 mulheres que soro-converteram durante a gestação, cuja infecção congênita foi demonstrada através dos métodos convencionais (inoculação do líquido amniótico e/ou sangue do cordão umbilical em camundongos e/ou cultivo celular e pesquisa de IgM no soro do cordão umbilical) em 34 dos 339 fetos. A PCR, utilizando o gene B1, foi positivo em todos os 34 fetos e em três outros, cujo resultado dos testes convencionais foram negativos. A sensibilidade foi de 97,4% contra 89,5% pelos métodos convencionais e o valor preditivo negativo foi de 99,7% contra 98,7% dos métodos convencionais, concluindo que o método de PCR é rápido, seguro e confiável para o diagnóstico pré-natal da toxoplasmose congênita. Em estudos citados por Wong e Remington (1993) e realizados por Thulliez et al. (1992), foi demonstrado que a sensibilidade e a especificidade da PCR amplificando o gene B1 de parasitos presentes no líquido amniótico foi de 100%, em contraste com a inoculação de sangue fetal ou líquido amniótico em camundongos e culturas. Castro et al. (2001) avaliaram a eficácia do método de PCR no líquido amniótico, utilizando-se um primer do gene B1, para a detecção da infecção fetal pelo T. gondii em gestantes com infecção aguda e correlacionou com a técnica de inoculação em camundongos e a histologia da placenta. Neste trabalho a sensibilidade da técnica de PCR foi de 66,7% e a especificidade de 87%. A inoculação em camundongos apresentou sensibilidade de 50%, 100% de especificidade já para a histologia da placenta foram 80% e 66,7%. Vidigal et al. (2002) encontrou uma sensibilidade de 62,5% e a especificidade de 97,4% na PCR contra 42,9% de sensibilidade e 100% de especificidade na inoculação em camundongos. Bessières et al. (2002) também compararam a técnica de PCR com a inoculação em camundongos do líquido amniótico de 261 gestantes com toxoplasmose adquirida durante a gestação, na França e encontraram sensibilidade de 90% para o PCR contra 70% para a inoculação e especificidade de 100% em ambos. A principal vantagem da PCR, além da alta especificidade e sensibildade é a rapidez na obtenção dos resultados. Porém a principal desvantagem são os altos custos dos equipamentos, a escasses de Kits comerciais padronizados e o não estabelecimento da fase da doença (SWITAJ et al., 2005). Além disso, muitos dos resultados falso-positivos ocorrem principalmente devido a contaminação com produtos de amplificação (COUTO et al., 2003), presença de inibidores da Taq polimerase, o período entre a infecção e a coleta da amostra ser muito longo, a parasitemia ser fugaz e as pacientes terem iniciado seu tratamento antes de

29 efetuar a coleta ou ainda devido a uma transmissão mais tardia do parasito ao feto, posterior à realização do PCR, apesar do tratamento com espiramicina (DAFFOS et al., 1988; SPALDING et al., 2002). Países, como o Brasil, o acompanhamento sorológico em gestantes, quanto realizado, é trimestral, tornando o diagnóstico de soro-conversão materna tardio, portanto no momento da amniocentese pode não haver mais parasitas detectáveis, fator que poderia contribuir para a baixa sensibilidade. É importante enfatizar que como o PCR ainda apresenta algumas limitações na sensibilidade e especificidade de acordo com a metodologia e o primer utilizado em cada laboratório, esta técnica não deve ser utilizado isoladamente no diagnóstico (CASTRO et al., 2001) embora seja um método promissor, não irá substituir os métodos sorológicos, pois necessita de maiores estudos para melhorar sua eficácia. Além do diagnóstico pré-natal, a técnica de PCR quantitativa do líquido amniótico pode ser utilizada como marcador do prognóstico precoce da infecção fetal pelo T. gondii. Romand et al. (2004) observaram que infecções maternas adquiridas antes de 20 semanas com uma carga parasitária maior que 100/ml tem maior risco de desenvolver sequelas fetais severas. A PCR em tempo real é uma metodologia rápida, sensível e quantitativa de detecção do T. gondii em amostras clínicas, nessa metodologia são combinados os tempos de amplificação e detecção numa mesma fase (COSTA et al., 2000; REMINGTON et al., 2004). A técnica pode ser usada para estimar a concentração de parasitos no fluído corporal e no caso de líquido amniótico é capaz de contribuir precocemente para o prognóstico da toxoplasmose congênita, ao permitir avaliar a concentração de parasitos no mesmo (REMINGTON et al., 2004; ROMAND et al., 2004), podendo ser usado na rotina de laboratórios em combinação com testes sorológicos. Resultados obtidos por Romand et al. (2004) mostram excelente relação entre carga parasitária, período da infecção materna e risco de infecção fetal, abrindo novas perspectivas para a valorização da PCR em tempo real como um ensaio que pode contribuir significantemente na orientação diagnóstica e terapêutica (ROMAND et al., 2004). A carga parasitária pode ser determinada e relacionada com a sintomatologia e o tratamento sendo de utilidade para o monitoramento da eficácia do tratamento e no entendimento da patogênese da reativação da toxoplasmose (COSTA et al., 2000), porém mais estudos são necessários para explorar o potencial dessa técnica no diagnóstico da toxoplasmose (KOMPALIC-CRISTO, 2004).