Métodos de Pesquisa e Diagnóstico dos Vírus

Estratégias Isolamento em sistemas vivos Pesquisa de antígeno viral Pesquisa de anticorpos Pesquisa do ácido nucléico viral (DNA ou RNA)

Pré requisitos para um diagnóstico Escolha do espécime adequado Colheita no momento adequado Encaminhamento ao laboratório

Exemplos de espécimes para o diagnóstico de vírus

Colheita de espécimes, transporte e processamento Colher o mais cedo possível (fase aguda da doença) Usar containeres adequados (à prova de vazamento) com identificação (tipo material, data colheita, nome do paciente, etc) Refrigerar todos os espécimes até o diagnóstico [imediatamente após a colheita geladeira (4 o C); freezer (-20 o C); [existem algumas restrições dependendo do vírus]

Material usado para colheita

Parasita intracelular obrigatório Necessita de um sistema vivo para o isolamento: cultura de células; ovos embrionados de galinha; animais de laboratório.

Sistemas de Hospedeiro Vivos Cultura de células Ovos embrionados de galinha Animais de laboratório

Vírus: o menor microrganismo conhecido

Detecção direta do vírus (Ag) Microscopia eletrônica

Princípio da coloração negativa A. Vaporização do metal pesado B. Formação de camada na superfície do vírus C. Qualquer objeto no caminho do vapor de metal formará uma sombra. D. Detalhe da sombra com dois ângulos de luz

Microscópio eletrônico

Princípio da coloração negativa http://www.utmb.edu/virusimages/

Detecção direta do vírus (Ag) Microscopia eletrônica

Pesquisa de antígeno viral Usando-se um anticorpo (Ac) obtido após a inoculação de um animal com um antígeno (Ag) purificado conhecido. Ligação do Ac conhecido com o Ag na amostra clínica. Visualização dessa ligação através de marcação de um segundo Ac com substâncias cromogênicas (fluoresceína, peroxidase) ou radioativas (isótopos radioativos).

ELISA (p/ Ag)

Pesquisa de antígeno viral Pesquisa do Ag viral em células infectadas (reação de imunofluorescência) Reações de aglutinação (aglutinação de hemácias, aglutinação de látex) Western blot (pesquisa de proteínas virais)

Reação de imunofluorescência

Hemadsorção

Reação de hemaglutinação

Coaglutinação

Aglutinação Passiva

Aglutinação

Western blot

Pesquisa do DNA ou RNA viral Pesquisa de DNA viral (Southern blot) Pesquisa de RNA viral (Northern blot) PCR (Reação em cadeia da polimerase) Sequenciamento

Eletroforese em Gel

Eletroforese em gel

Eletroforese em Gel

Southern blot

Northern blot

HPV DNA Chip

PCR Princípio: amplificação in vitro de segmentos definidos de DNA Acúmulo exponencial da sequência alvo ~2 n Reagentes: sais - Tris ph 8,3-8,9 -KCl - MgCl 2 dntps (ATCG) TaqDNA polimerase Primers (iniciadores da reação)

PCR (Polymerase chain reaction)

PCR CÉLULAS OU TECIDOS PRODUTO AMPLIFICADO DNA de HPV Controle ELETROFORESE EM GEL

Sequenciamento de DNA

Sequenciamento

Pesquisa de anticorpos (sorologia) Usando-se um antígeno (Ag) viral purificado e conhecido, obtido após a inoculação do vírus em um sistema vivo (cultura de células, ovos embrionados de galinha ou um animal). O Ag produzido é usado em reações para a pesquisa de anticorpos (Ac) específicos contra este Ag no sangue do paciente. Ligação do Ag conhecido com o Ac na amostra clínica. Visualização dessa ligação através de marcação de um segundo Ac com substâncias cromogênicas (fluoresceína, peroxidase) ou radioativas (isótopos radioativos).

Sorologia Detecção do aumento do título de anticorpos entre as fases agudas e convalescentes da infecção, ou a detecção de infecção primária pela detecção de IgM.

Sorologia Critério para diagnosticar uma infecção primária aumento de 4 vezes ou mais no título de IgG ou anticorpo total entre os soros das fases agudas e convalescentes da infecção Presença deigm Soroconversão Critério para diagnosticar uma reinfecção Aumento de fold or more increase in titre of IgG or total antibody between acute and convalescent sera Ausência ou pequeno aumento em IgM

Perfil sorológico típico após uma infecção aguda Verificar que durante a reinfecção, IgM pode estar ausente ou presente em baixos níveis

Testes de Neutralização

Inibição da hemaglutinação

ELISA (p/ Ac)

ELISA para sorologia de HIV Microplaca de ELISA para sorologia de HIV: poços coloridos indicam reatividade http://www.biology.arizona.edu/immunology/activities/elisa/elisa_intro.html

Western Blot para pesquisa de Acs

Western Blot para pesquisa de Acs HIV 1: Controle Negativo 2: Controle Positivo 3: dia 0 4: dia 2 5: dia 3 6: dia 5 7: dia 7 8: dia 12 9: dia 22 10: dia 30

Western Blot para pesquisa de Acs Western Blot HIV-1 Lane1: Controle Positivo Lane 2: Controle Negativo Paciente A: Negativo Paciente B: Indeterminado Paciente C: Positivo

Uso dos métodos diagnósticos Identificação/confirmação da presença do agente. Relação do agente com determinado quadro clínico. Monitoramento

O que a nossa mente vê? As coisas são o que parecem ser. As coisas são e não parecem ser. As coisas não são, mas parecem ser. As coisas não são nem parecem ser. Epiteto (filósofo grego). Século II D.C.

Relação entre SER e PARECER SER + - PARECER + As coisas são o que parecem ser As coisas são são, mas parecem ser - As coisas são mas não parecem ser As coisas não são nem parecem ser

Relação entre teste diagnóstico e agente microbiano pesquisado AGENTE MICROBIANO (vírus) + - TESTE + Verdadeiro positivo Falso positivo - Falso negativo Verdadeiro negativo

Sensibilidade e Especificidade TESTE + - AGENTE MICROBIANO (vírus) Presente Ausente TOTAL (a) verdadeiro positivo (c) falso negativo (b) falso positivo (d) verdadeiro negativo TOTAL a + c b + d a + b c + d a + b + c + d Sensibilidade = a / (a + c) Especificidade = d / (b + d) Sensibilidade: é a probabilidade de um teste dar positivo na presença do vírus, isto é, avalia a capacidade do teste detectar o vírus quando este está presente. Especificidade: é probabilidade de um teste dar negativo na ausência do vírus, isto é, avalia a capacidade do teste negativar quando o vírus está ausente

Qual teste diagnóstico devo usar? Sensíveis Usados para o diagnóstico de vírus associados a doenças potencialmente graves Usado no rastreamento de doenças em uma população Específicos Usados para os casos quando um resultado falso positivo pode ser muito prejudicial Confirma um diagnóstico sugerido por outros testes

VANTAGENS DESVANTAGENS Isolamento do vírus Pesquisa de antígeno Pesquisa de ácidos nucléicos Pesquisa de anticorpos - permite futuro estudo do agente. - geralmente sensível para alguns vírus. -ME: diagnóstico rápido e detecta vírus não cultiváveis. -Permite distinguir sorotipos diferentes. -PCR: método rápido e sensível. - potencialmente aplicável a todos os vírus. -método rápido. -útil em acompanhamento de surtos na população. - demora no diagnóstico. - alguns vírus não são cultiváveis. -não é aplicável a todos os vírus. - PCR: risco de contaminação por DNA (falsos positivos). -PCR: requer conhecimento da sequência alvo a ser amplificada. - podem ocorrer falsos positivos.