1 Universidade Federal de Viçosa Departamento de Zootecnia Laboratório de Fisiologia e Reprodução Animal 84ª. Semana do Fazendeiro Coleta e Armazenagem do Sêmen Suíno Autores: Juliana Andrea Parra Salinas Carolina Rodriguez Jimenez Erly Luisana Carrascal Triana Ciro Alexandre Alves Torres Viçosa-MG 2013
2 SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO... 03 2. VANTAGENS E LIMITAÇÕES DA I.A.... 3. MATERIAIS PARA AVALIAÇÃO DO SÊMEN... 04 06 4. COLETA DE SÊMEN... 07 5. ARMAZENAGEM... 6. DILUIÇÃO E RESFRIAMENTO... 13 15 7. CONSIDERAÇÕES FINAIS... 18 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 19
3 1. INTRODUÇÃO O Brasil é o quarto maior produtor e exportador mundial de carne suína, produzindo 2,8 milhões de toneladas em 2006. Sua participação mundial tem crescido acentuadamente desde 1990 e hoje representa 2,7% do total de carne suína produzida no mundo. O rebanho brasileiro é formado, atualmente, por 2,4 milhões de matrizes. Desse total, 1,51 milhão são consideradas fêmeas tecnificadas e são criadas nas regiões Sul, Sudeste e Centro-Oeste (Porkexpo, 2009). A inseminação artificial (I.A.) é uma importante ferramenta para a distribuição de genética superior, tendo sido utilizada em diversas espécies incluindo, bovinos, suínos, ovinos e búfalos (Sukhato, et al., 2001). A I.A. em suínos, com sêmen resfriado vem sendo utilizada com sucesso em vários países. No Brasil, em 1975, houve a criação das primeiras centrais de I.A. na região sul com um avanço lento da utilização desta técnica pelos criadores. Em 1990, apenas cerca de 2,0% do rebanho nacional era inseminado (Scheid, 1991). O emprego da I.A. em suínos no Brasil tem aumentado consideravelmente ano a ano; sendo uma biotecnologia que se firmou definitivamente em granjas comerciais em nível mundial, chegando a representar 70% dos negócios realizados no setor. Ela vem sendo acompanhada por uma evolução tecnológica constante, entretanto, um cuidado especial deve ser dedicado às práticas básicas visando à sua realização da forma mais correta possível, sendo estes cuidados importantes para alcançar boa produtividade e lucratividade do setor (Toniolli, 2010). Os programas brasileiros de inseminação artificial trabalham com sêmen diluído, armazenado/conservado a temperaturas entre 15 e 18 C até três dias após a coleta. A avaliação rotineira dos ejaculados suínos para a preparação de doses inseminantes tem resultado em garantia de qualidade principalmente em termos de motilidade e morfologia espermática. Devido ao crescente aumento na utilização da I.A. na indústria suína, há interesse na identificação de machos com fertilidade subótima para descartá-los ou reduzir seu uso.
4 A fertilidade de um rebanho é uma resultante de três fatores: fertilidade da porca, fertilidade do varrão e manejo reprodutivo. Na teoria, estes três componentes influenciam na mesma intensidade. No entanto, de acordo com Flowers (1997) a função do varrão dentro de uma suinocultura, é cerca de 15 vezes mais importante que a fertilidade de uma porca isoladamente e representa a metade da influência do manejo reprodutivo geral. Portanto, aspectos relacionados à coleta, avaliação e processamento do sêmen do varrão são de grande importância para o sucesso da I.A. (Reis, 1997). Desta forma, o uso do macho suíno deve ser otimizado, pois um mesmo reprodutor pode fornecer sêmen para um número maior de fêmeas. Um eficiente programa de biosseguridade, manutenção da saúde dos reprodutores e uma correta manipulação do ejaculado são condições imprescindíveis para a qualidade das doses inseminantes. 2. VANTAGENS E LIMITAÇÕES DA I.A. A viabilidade econômica de um sistema de produção de suínos está diretamente relacionada à eficiência de produção do mesmo. Nesse sentido, estratégias para redução de custo nas diferentes áreas de produção são fundamentais para avaliação econômica do produtor. O manejo reprodutivo do macho e fêmea e a utilização de biotecnicas como a utilização da I.A., bem desenvolvendo resultados satisfatórios. No entanto, precisa-se de conhecimento e boas praticas zootécnicas para o sucesso do produto final. Assim, é importante que haja uma conscientização a respeito das vantagens que poderão ser
5 alcançadas, bem como as limitações associadas com o emprego da I.A. em suínos. Vantagens Potencializar o uso de machos geneticamente superiores: ganhos genéticos associados a uma progênie com carcaças com maior percentual de carne magra, maior eficiência alimentar, menor idade para atingir o tempo de abate, com redução no período de alojamento na terminação. Redução do número de machos necessários para a reprodução: na monta natural são empregados 4,0 a 5,0% de machos com relação ao plantel de fêmeas. Na I.A. tradicional esse índice varia de 0,5 a 1,0%. Alojar maior número de fêmeas: nas granjas que passam da monta natural para a I.A. é possível alojar 10,0 a 15,0% mais fêmeas no setor de reprodução onde seriam alojados os machos, caso fosse utilizada a monta natural. Redução nos custos da mão de obra: na I.A., em comparação à monta natural, há uma racionalização nos serviços associados ao acasalamento. Maior segurança sanitária: embora não se descarte a possibilidade de introduzir doenças via doses de sêmen, os riscos são bem menores quando comparados à entrada de animais na granja. Eliminação de ejaculados impróprios para uso: ao contrário do que ocorre na monta natural, na I.A. todos os ejaculados são avaliados antes do processamento. Normalmente, 3,0 a 5,0% dos ejaculados são descartados por problemas de motilidade ou alterações de morfologia. Dessa forma, reprodutores subférteis podem ser eliminados do plantel.
6 Maiores cuidados higiênicos associados ao acasalamento: com o emprego da I.A., observa-se melhora na limpeza das fêmeas e na higienização dos procedimentos de acasalamento. Limitações Estrutura laboratorial mínima: necessária se as doses forem produzidas na própria granja. Nas situações em que são adquiridas, é necessário investir em câmaras para armazenamento das doses. Ser humano qualificado: necessidade de treinamento e fiscalização periódica da equipe envolvida nos procedimentos de produção das doses e inseminação. Curto período de armazenamento da dose inseminante: a dose costuma ser armazenada por até 72h. Isso requer rapidez entre sua coleta e distribuição. 3. MATERIAIS PARA AVALIAÇÃO DO SÊMEN Antes de iniciar as coletas, é preciso organizar o material necessário para a realização da inseminação. E necessário limpar e desinfetar tudo o material e a sala específica para essa finalidade, sendo recomendável limpar com álcool 70,0% removendo assim as partículas contaminantes. Banho-maria. Antes de ligar ele, certifique-se que ele tenha água limpa, Microscópio óptico.
7 Placa Aquecedora. Ela deve estar limpa e desinfetada, para preparação das lâminas e lamínulas. A diluição deverá ser realizada em água destilada com a temperatura á 37 C o que vai facilitar a homogeneização e o bom desenvolvimento dos espermatozoides. Antes do recebimento do ejaculado, todos os materiais para sua análise e processamento deverão estar organizados antes de iniciar as coletas. Na preparação do material, todo cuidado deve ser tomado no sentido de mantê-lo sempre à mesma temperatura (37ºC), evitando-se, desta forma, problemas de choque térmico. O copo de coleta (capacidade para 500 ml) deve ser colocado dentro de um protetor isotérmico resistente a choques e quebras, coberto por gaze (Toniolli, 2010). 4. COLETA DO SÊMEN Os machos são condicionados à colheita com 150 a 170 dias de idade, quando normalmente chegam às centrais/granjas (Bortolozzo et al., 2010). É importante se manter uma rotina de hora e de periodicidade de coleta (uma ou duas vezes/semana), sendo desaconselhados os horários mais quentes do dia. A condução do animal para a sala de coleta e de volta a sua baia deve ser sempre feita da forma mais tranquila possível. O envolvimento do coletador com os animais é muito importante para o sucesso da coleta, pois o bom relacionamento entre o reprodutor e o responsável pela coleta favorece a obtenção de um bom ejaculado. A frequência de coletas deverá seguir parâmetros fisiológicos da espécie e características particulares de cada reprodutor. De uma maneira geral, pode ser usado como regra o seguinte esquema: varrões jovens (até 12 meses de idade) = de uma coleta/semana até três coletas/duas semanas.
8 No caso de machos adultos (maiores de 12 meses) = duas coletas/semana. O método mais utilizado é o da técnica de coleta pela mão enluvada (Toniolli, 2010). A sala de colheita propriamente dita deve ter uma área total de 7 a 9 m 2, equipada com um manequim fixado ao solo, com altura regulável, confeccionado em material que permita a sua fácil higienização (aço inox ou metal galvanizado). Junto à sala de colheita é importante que haja áreas laterais de proteção, que podem ser delimitadas por barras de ferro ou PVC fixadas na posição vertical ao piso. Próximo ao local de colheita é importante que seja reservada uma área para a instalação de uma cela de higienização dos machos a ser empregada na higienização pré-colheita e na lavagem periódica dos reprodutores (Bortolozzo et al., 2010). O coletador deverá estar usando luvas de borracha antiderrapante e sobreluva para higienização da região prepucial. No local especifico para esta ação, preferivelmente a baia de pré-coleta, com uso de luva, deve-se fazer a limpeza do prepúcio do macho com papel toalha, caso apresente pelos longos, eles devem desaparecer, devem evitados e assim evitar desconfortos e contaminação do material no momento da coleta. A higienização deve ser feita a seco e consiste em remover, por pressão mecânica, o conteúdo dos divertículos prepuciais. Ao concluir essa atividade, o operador deve estar preparado para iniciar a colheita do ejaculado removendo a luva empregada na pré-higienização. É recomendado que o macho seja coletado pela técnica da mão enluvada na sala de coleta. Após o macho montar no manequim, o pênis, uma vez exposto, deverá ser fixado pelo coletador próximo à sua extremidade (em torno de 7 cm) e tracionado fazendo-se uma flexão dele em ângulo de 90º. Durante a ejaculação, o coletador deverá exercer pressão rítmica sobre o pênis do animal, imitando a pressão feita pela cérvix da porca, até que o varrão retraia o pênis e desça do manequim. A glande do varrão deverá estar sempre livre a fim de se evitar contato do sêmen com a luva do coletador (Toniolli, 2010). O recipiente de colheita deverá ser preparado previamente e ter sobre a sua abertura uma gaze dupla ou um filtro específico para evitar que a fração
9 gelatinosa permaneça em contato com o ejaculado. O recipiente de colheita deverão estar à temperatura de 35 a 37 o C. Para reduzir o choque térmico, o suporte isolante térmico deve acompanhar o ejaculado até o momento em que este seja remetido ao laboratório. A colheita de um ejaculado sem contaminação é praticamente impossível de ser realizada, mas o operador deve estar atento para colher um ejaculado com o menor grau de contaminação possível. Além da contaminação microbiológica, deve-se estar atento à contaminação química do ejaculado. As luvas empregadas na colheita, principalmente algumas de látex, possuem substâncias tóxicas aos espermatozóides, causando redução no percentual de espermatozoides móveis ou no desempenho reprodutivo. Logo após a colheita, a fração gelatinosa que fica retida no filtro fixado na borda do recipiente de colheita deve ser removida e o ejaculado remitido imediatamente ao laboratório. Nesse momento, o sêmen é submetido a exame macro e microscópico. Avaliação Macroscópica O exame macroscópico consiste na avaliação do aspecto do ejaculado, Aspecto do Ejaculado O aspecto visual e a primeira ejaculação que é feita fornece informação sobre a contaminação. Quando e detectada contaminação de qualquer origem o ejaculado deve ser descartado, não deve ser utilizado para o processamento. Tabela 1. Aspecto do Ejaculado. Cor Presença Recomendação Avermelhado Presença de Sangue Descarte Amarelado Presença de Urina Descarte Branco Normal APROVADO
10 O odor do ejaculado suíno é característico e eventuais contaminações por secreções prepuciais ou urina são facilmente detectadas. Avaliação Microscopica Motilidade Espermática A motilidade é um atributo importante para o deslocamento espermático no trato reprodutivo e para a penetração no oócito. Por ser um exame simples, rápido, de baixo custo e bom indicador da integridade e funcionalidade das membranas (Braundmeier et al.; 2004), a avaliação subjetiva da motilidade espermática é o principal parâmetro utilizado para selecionar os ejaculados. Estará aprovado apenas se o ejaculado obter motilidade mínima de 70%. Esta avaliação deve ser realizada em microscópio óptico, para tal avaliação, devese colocar uma gota de sêmen puro entre a lâmina e lamínula previamente aquecidas na placa aquecedora e avaliar no microscópio. Quando há maior variação nas características seminais, a associação com os dados de fertilidade parece ser mais facilmente detectada. Gadea et al. (1998), separaram os ejaculados de quatro machos de acordo com a taxa de parição, nos seguintes grupos: baixa (0-20%), intermediária (40-60%) e alta (80-100%) fertilidade. Os resultados evidenciaram que os ejaculados de baixa fertilidade, apresentavam em média, 43% de espermatozoides com defeitos, em contraste com 11,0% no grupo de alta fertilidade. A motilidade foi menor no grupo baixa fertilidade em comparação aos grupos intermediária e alta fertilidade. Além disto, a motilidade esteve correlacionada com o tamanho da leitegada e taxa de parto, quando foi analisada em modelos de regressão, junto com outras características seminais. Aglutinações As aglutinações são observadas em grande parte dos ejaculados na espécie suína, com pequenas variações na intensidade. Normalmente, essas aglutinações são de tipo cabeça cabeça do espermatozoide e são visíveis no
11 momento em que se examina a motilidade do sêmen in natura, ou mesmo diluído. A aglutinação espermética, quando muito intensa, causa dificuldade e erros na avaliação da concentração, independente do método utilizado, sendo motivo de descarte do ejaculado. Concentração Espermática Existem diversas maneiras e equipamentos para avaliação da concentração espermática do sêmen suíno: Câmara de Neubauer É um equipamento utilizado na avaliação da concentração espermática, através da contagem das células. Espermodensímetro E um método manual que avalia a concentração espermática através da opacidade. De fácil manipulação, mas a margem de segurança dos resultados, podem ser inferiores quando e comparado com outros equipamentos. Espectofotometro ou Fotocolorimetro Equipamentos que avaliam a concentração espermática através de passagem de ondas luminosas pela amostra. São aparelhos automáticos e que possuem boa segurança de leitura. Morfologia A análise morfológica do sêmen é um parâmetro importante de qualidade e, de modo geral, permite descartar ejaculados ou machos que ultrapassam um determinado nível de anormalidades.
12 Tabela 2. Morfologia do espermatozoide. Local de alteração morfológica Limite máximo (%) Acrossoma 5 Cabeça 5 Colo 5 Gota citoplasmática proximal (GCP) 10 Peça intermédia 5 Gota citoplasmática distal (GCD) -x- Cauda ou flagelo 10 TOTAL 20 Fonte: Adaptação de Toniolli (2010) Sutkeviciene et al. (2005) classificaram os espermatozóides em quatro grupos: normais, com defeitos principais, com gotas proximais e com defeitos secundários. Não houve correlação entre os percentuais dessas categorias e a fertilidade, mas quando os machos foram separados pelo nível de fertilidade, o grupo de machos mais férteis apresentou menor percentual de defeitos principais. Integridade De Membrana A integridade da membrana plasmática é um requisito essencial para o metabolismo e função espermática. A integridade da membrana espermática pode ser avaliada com a coloração eosina-nigrosina ou com uso de corantes fluorescentes. A avaliação se baseia na capacidade de membranas intactas impedirem ou não a entrada de determinados corantes nos compartimentos internos dos espermatozóides, permitindo, assim, separar as células com membrana íntegra (Bernardi, 2008).
13 A dificuldade de detectar associação entre a fertilidade in vivo e algumas características espermáticas como a motilidade pode ser reflexo da pequena variação destas características em machos férteis (Berger et al., 1996) Assim o valor preditivo de alguns testes pode ser limitado quando a seleção por critérios como concentração, motilidade ou morfologia, exclui ejaculados ou machos de baixa qualidade seminal. E importante fazer a seleção dos animais, ejaculados, o número de espermatozoides por dose, e tudo o que corresponda a elevar a qualidade do sêmen usado no programa de I.A., que contribuem na redução na variabilidade das características seminais. E preciso ter em conta que há variação na qualidade espermática e a fertilidade entre ejaculados de um mesmo animal, isto implica a necessidade de usar um número maior de ejaculados para conhecer, o histórico do cada animal e a avaliação possa ser representativa e confiável. 5. ARMAZENAGEM Vários fatores podem influenciar a qualidade espermática durante o processo de conservação por resfriamento ou congelamento. Esses fatores podem estar relacionados à suscetibilidade ao choque térmico, à velocidade de resfriamento, à composição dos diluentes, aos fatores inerentes ao espermatozoide, às diferenças entre cachaços e ejaculados, além das taxas de diluição do sêmen. Há grande variabilidade na resposta dos machos suínos ao resfriamento ou à congelação, que não é possível de ser identificada previamente, até o momento,
14 pelos parâmetros convencionais de avaliação do sêmen. A I.A. com sêmen congelado tende a se restringir à exportação de sêmen entre países, ao transporte a longas distâncias e à formação de bancos de sêmen de raças e linhagens de alto valor genético, ou que se encontrem em vias de extinção, ou em risco sanitário. Pelo fato do emprego de sêmen congelado ainda estar associado com uma redução de 10 a 20% na taxa de parto e baixo número de leitões por leitegada, a conservação do sêmen suíno é realizada, predominantemente na forma líquida (Bortolozzo et al., 2008). A redução da temperatura de armazenamento do sêmen após a diluição tem sido um método utilizado para prolongar a viabilidade dos espermatozoides, pelo efeito de desaceleração dos processos metabólicos celulares. A motilidade das células espermáticas é determinada pela produção de energia. Como a quantidade de energia de cada célula é limitada, o sêmen deve ser armazenado em temperaturas nas quais o consumo de energia seja o menor possível. No entanto, a grande sensibilidade do espermatozoide suíno a temperaturas inferiores a 12 e 15 o C resulta em diminuição da taxa de sobrevivência espermática. Em condições de produção comercial, o sêmen suíno é armazenado em temperaturas entre 15 e 18 o C. Porém, essa temperatura apresenta limitações quando o sêmen é estocado por períodos prolongados, em virtude de não interromper totalmente o metabolismo dos espermatozoides, que continuam produzindo metabólitos, os quais se acumulam e interferem na motilidade espermática. Além disso, essa faixa de temperatura não impede a multiplicação bacteriana, que influencia na qualidade do sêmen e no período de armazenamento.
15 6. DILUIÇÃO E RESFRIAMENTO DO SÊMEN Os diluentes de sêmen possuem várias funções básicas, como aumentar o volume total da amostra de sêmen, suprir a necessidade de nutrientes para a produção de energia, permitir a proteção dos espermatozoides contra o choque térmico, apresentar tampão capaz de controlar a flutuação do ph, permitir o balanço osmótico e controlar o desenvolvimento bacteriano. Na I.A. de suínos, os diluentes utilizados têm sido tradicionalmente classificados em três grupos, com base no período de manutenção da viabilidade e da capacidade fecundante do espermatozoide: Os de curta duração (um a dois dias) Os de média duração (três a cinco dias) Os de longa duração (mais de seis dias) A maioria apresenta limitações com relação à manutenção de viabilidade espermática compatível com altas taxas de fecundação e parição, que ficam reduzidas após 72h de armazenamento do sêmen. O BTS, o Androhep e o MR A, são os diluentes mais utilizados no mundo, sendo seguidos pelo Modena e o Kiev. O BTS é o diluente mais utilizado em razão da facilidade de fabricação. É recomendado o uso da dose inseminante processada com BTS no máximo em até três dias de armazenamento a 15 e 18 o C. Os diluentes considerados de longa duração são usados, principalmente, para evitar a realização de colheitas e o processamento de sêmen nos finais de semana, além de possibilitar a diminuição no custo do transporte para o produtor, pois um grande volume de sêmen pode ser comprado em uma única entrega. Após a avaliação, o sêmen deve ser diluído o mais rápido possível. Em geral, são efetuadas diluições que variam de 1:3 (uma parte de sêmen e três partes de diluente) até 1:10 ou 1:15. Conhecendo o volume e o número total de
16 espermatozoides no ejaculado, e possível calcular a quantidade de diluente que deve ser adicionada para o número de espermatozoides por dose. A partir de um ejaculado com 200 ml e 60 bilhões de espermatozoides, podem ser preparadas 20 doses para I.A. de 100 ml cada, contendo 3 bilhões de espermatozoides. Para isso, seria necessário acrescentar 1.800 ml de diluente ao ejaculado. O diluente deve ser preparado pelo menos duas horas antes da diluição e estar aquecido a uma temperatura próxima à do sêmen. A diluição pode ser efetuada em etapas: 1. Diluir o sêmen com o diluente em proporção aproximada de 1:1. 2. Aguardar 5 a 10 min. Para estabilização inicial do ejaculado no diluente. 3. Adicionar lentamente o restante do diluente que falta, conforme o cálculo efetuado. 4. Envasar as doses. 5. Manter as doses em temperatura ambiente (20 a 24 o C) por cerca de 90 min. 6. Armazenar as doses em temperaturas de 15 a 18 o C em refrigerador com termostato. 7. Mover suavemente as doses, pelo menos uma vez ao dia.
17 Tabela 3. Composição química de alguns diluentes para conservação do sêmen suíno. Ingredientes Kiev Mod. Modena Modena BTS Androhep MR A Gramas (g) Glicose 60 27,5 25 37 26 Sim Citrato de sódio 3,7 6,9 6,9 6 8 Sim Bicarbonato de sódio 1,2 1 1 1,25 1,2 Sim EDTA 3,7 2,35 2,35 1,25 2,4 Sim Cloreto de potássio - - - 0,75 - - Acetato de potássio - - - - - Sim Cisteína - - - - - Sim Ácido cítrico - 2,9 2 - - - Tris - 5,65 5,65 - - - MOPS - - 10,5 - Sim - HEPES - - - - Sim - BSA 5-3 - 2,5 Sim ph 6,62 6,9 6,9 7,2 6,8 6,9 Osmolaridade 282 240 282 330 309 290 Fonte: Adaptado de Levis, D. 2000 Os diluentes devem ser dissolvidos em 1L de água destilada. EDTA: ácido etilenodiaminotetracético Tris: tris-hidroxiaminoetano
18 7. CONSIDERAÇÕES FINAIS A variação nos dados de fertilidade também depende de fatores relacionados ao processamento de A coleta e armazenamento do sêmen (tipo de diluente, envelhecimento in vitro, etc), e podem resultar em alterações dos espermatozoides. A realização da técnica de inseminação e o processamento das doses inseminantes, requerem cuidados básicos de higiene e conhecimentos técnicos para ter bons resultados. A I.A. além de diferenciar a fertilidade dos machos dentro do plantel de reprodutores contribui para nortear o produtor rural no momento de descartar os animais improdutivos ou que apresentem baixa produção. O impacto econômico quando se tem um reprodutor com baixa fertilidade no plantel é imediato considerando que um único macho produzirá um diluído para inúmeras fêmeas. Na implantação de um sistema de I.A., a qualidade do ejaculado, da dose e da detecção de estro e a adequada inseminação são fundamentais. Um único teste não será suficiente nem tampouco exato para determinar a fertilidade ou viabilidade do sêmen dos reprodutores. Por isso, a utilização de análises diferente, buscando determinar e apontar as características espermáticas se apresenta como uma ótima ferramenta para tornar eficiente o manejo reprodutivo das granjas.
19 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS BERGER T., ANDERSON D.L. & PENEDO M.C.T.. Porcine sperm fertilizing potential in relationship to sperm functional capacities. Animal Reproduction Science, v44, p.231-239, 1996 BERNARDI M.L. Tecnologias aplicadas no exame do ejaculado suíno para a produção de doses de sêmen de alta qualidade. Acta Scientiae Veterinariae, v.36 (Supl 1): p.s5-s16, 2008. BORTOLOZZO F.P.; BERNARDI M.L.; BENNEMANN P;E.; WENTZ I. Inseminação Artificial em Suínos. In: BIOTECNICAS APLICADAS A REPRODUÇÃO ANIMAL p. 125 144, 2008. BRAUNDMEIER A.G., DEMERS J.M., SHANKS R.D. & MILLER D.J. The relationship of porcine sperm zona-binding ability to fertility. Journal of Animal Science, v.82, p.452-458, 2004 FLOWERS, V.L. Management of boars for efficient semen production. J.Reprod. Fertil., v.52, p.67-78, 1997. GADEA J., MATAS C. & LUCAS X. Prediction of porcine semen fertility by homologous in vitro penetration hivp/assay. Animal Reproduction Science, v.56, p. 95-108, 1998. LEVIS, D. Liquid boar semen production: current extender technology and where do we go from here! In: IV INTERNATIONAL CONFERENCE ON BOAR SEMEN PRESERVATION, 2000. Beltsville. Proceedings of IV International Conference on Boar Semen Preservation, 2000.
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