TÉCNICAS BÁSICAS DA MICROBIOLOGIA
DUAS OPERAÇÕES BÁSICAS EM MICROBIOLOGIA ISOLAMENTO DE MICRORGANISMOS Separação de estirpes microbianas específicas a partir de populações mistas (ex. amostras ambientais, amostras clínicas) CULTURA DE MICRORGANISMOS Crescimento de populações de microrganismos em meios de cultura laboratoriais (usualmente, em cultura pura) Técnicas básicas da Microbiologia Preparação de meios de cultura Técnicas de assépsia e de esterilização Isolamento de culturas puras Manutenção de células viáveis no laboratório Microscopia
Preparação de meios de cultura A composição de um dado meio de cultura está dependente da espécie que se pretende cultivar. O conhecimento do habitat natural de um dado microrganismo é muitas vezes útil na selecção do meio de cultura adequado, já que as suas necessidades nutricionais reflectem esse mesmo habitat. ELEMENTOS ESSENCIAIS Carbono (C) (Elemento comum a todos os constituintes celulares ~ 50% do peso seco da célula) Oxigénio (O) (~ 20% do peso seco da célula) Azoto (N) (~ 14% do peso seco da célula) Proteínas, ácidos nucleicos, polissacáridos, lipidos Proteínas, ácidos nucleicos, polissacáridos, lipidos Proteínas, ácidos nucleicos, coenzimas Hidrogénio (H) (~ 8% do peso seco da célula) Fósforo (P) (~ 3% do peso seco da célula) Enxofre (S) (~ 1% do peso seco da célula) Proteínas, ácidos nucleicos, polissacáridos, lipidos Fosfolípidos, ácidos nucleicos, ATP Proteínas, coenzimas
CATEGORIAS NUTRICIONAIS DOS MICRORGANISMOS Fontes de Carbono - CO 2 - Compostos orgânicos Fontes de energia Maior parte dos microrganismos usam um de três tipos de fontes de energia Chlorophyll or bacteriochlorophyll Macronutrientes ( ) (In Prescott, Harley & Klein, Microbiology, McGrawHill, 6th ed) Fig. 9.1
Macronutrientes Fontes de elementos principais (In Brock Biology of Microorganisms, 10th edition, Prentice Hall) (g/l) (mg/l)
Micronutrientes ou elementos traço (µg/l) (In Brock Biology of Microorganisms, 10th edition, Prentice Hall) Vitaminas factores de crescimento essenciais.
(In Brock Biology of Microorganisms, 10th edition, Prentice Hall)
Meios de cultura sintéticos ou definidos meios de cultura cuja composição química é perfeitamente conhecida. Meios de cultura complexos - meios de cultura cuja composição exacta é desconhecida. Podem ter como componentes diversos ingredientes, tais como Peptonas, Extracto de Levedura, Extracto de Carne, etc. PEPTONAS Hidrolizados de proteínas preparados por digestão proteolitica parcial de fontes proteicas (p.ex. extracto de carne, caseína, soja, gelatina, etc.). Os aminoácidos e pequenos péptidos resultantes servem como fonte de carbono (C), de energia e de azoto (N), para os microrganismos. EXTRACTO DE LEVEDURA ( Yeast extract ) Obtido a partir da lise de células de levedura da cerveja e hidrólise dos seusconstituintes. Fonte de vitaminas, compostos de Carbono (C), de azoto (N) e sais minerais.
Meios de cultura liquidos e sólidos Agar agente solidificante (polissacárido de alga marinha vermelha) Meios selectivos e meios diferenciais Os meios de cultura podem ser usados na selecção e crescimento de um determinado microrganismo ou na identificação de uma espécie em particular. Meios selectivos suprimem o crescimento de determinados microrganismos em benefício de outros. (ver aula sobre cultura de enriquecimento ) Meios diferenciais permitem a distinção entre diferentes grupos de microrganismos com base na capacidade de metabolizar componentes específicos presentes no meio de cultura e/ou na morfologia (aparência) das colónias. Permitem, por vezes, a identificação de microrganismos com base nas suas características fisiológicas.
Microrganismos são ubíquos (água, ar, solo, corpo, etc.) Solo ar língua (In J. Black, Microbiology, principles and exploration, 6th ed, J Wiley & Sons) Figura mostra colónias de microrganismos (na superfície de meio sólido)
Pasteur Sec. XIX. Refutação final da teoria da geração expontânea. Desenvolvimento de técnicas de esterilização eficientes (pasteurização) (In Brock Biology of Microorganisms, 10th edition, Prentice Hall) Crescimento microbiano em meio líquido turbidez
Esterilização no Laboratório ESTERILIZAÇÃO Morte ou remoção de todos os organismos vivos, estruturas biológicas e virus de um material, meio de cultura, etc. (in Brock Biology of Microorganisms) CALOR CALOR SECO - em estufa (160ºC/2horas; 180ºC/1 hora) - pouco eficiente - em desuso; só aplicável a material de vidro ou outro resistente a temperaturas altas CALOR HÚMIDO na AUTOCLAVE RADIAÇÃO Ultra- Violeta (λ = 260 nm) Limitada a superficies (p.ex. salas, pequenos compartimentos, superficie de utensílios (Não penetra vidro, filmes sujos, água, etc.) FILTRAÇÃO
Esterilização na AUTOCLAVE por acção do calor húmido* * Vapor de água saturado, sob pressão (1 bar) CONDIÇÕES DE ESTERILIZAÇÃO NA AUTOCLAVE 121ºC (pressão: 1 bar) Duração depende de: Volume de material dentro da autoclave; Grau de contaminação do material a esterilizar (usual 15 min) APLICADA A: - Meios de cultura sem componentes termolábeis (p.ex. muitos açucares, aminoácidos, vitaminas, não são estáveis a 121ºC) - Materiais de plástico ou vidro (In Brock Biology of Microorganisms, 10th edition, Prentice Hall) - Descontaminação de materiais contaminados com células viáveis
Esterilização na autoclave Porquê 121ºC, durante pelo menos 15 minutos? Esporos bacterianos (endósporos) são as estruturas biológicas mais resistentes ao calor (é a sua extrema resistência que determina quais as condições de funcionamento da autoclave que asseguram uma esterilização eficiente dos materiais) Condições que causam a MORTE CELULAR: Bacillus sp. Célula vegetativa Levedura Bolor Bactéria Vírus Células vegetativas 5 min a 50-60ºC 30 min a 62ºC 10 min a 60-70ºC 30 min a 60ºC Esporos 5 min a 70-80ºC 30 min a 80ºC 2-800 min a 100ºC ou 0,5-12 min a 121ºC - Endósporo ENDÓSPOROS: - Presentes na água, solo, etc - Podem permanecer viáveis durante muito tempo (décadas; milhares/milhões(?) de anos encontrados em locais arqueológicos, no intestino de abelha extinta preservada em ambar) - Algumas bactérias que os produzem são agentes de doenças graves (ex. Tétano, Botulismo)
TESTE QUE PODE SER USADO PARA VERIFICAR O FUNCIONAMENTO EFICIENTE DA AUTOCLAVE (1) (2) (Perry, Staley, Lorry, Microbial Life, Sinauer ed.) Spore strip = Tira de papel esterilizada contendo sobre a superfície endósporos de uma bactéria (p.ex. do género Bacillus)
Esterilização por filtração (In J. Black, Microbiology Fundamentals and Applications, J. Wiley and sons) APLICADA A: Líquidos - Soluções de compostos sensíveis a temperaturas altas (p.ex. antibióticos, vitaminas, aminoácidos, açucares podem sofrer alterações, incluindo degradação, a 121ºC) - Meios de cultura liquidos com componentes termossensíveis Gases
Esterilização do AR por filtração Máscaras cirurgicas Rolhas de algodão nos frascos onde são cultivados microrganismos. Sistemas usados para filtrar ar que entra em bioreactor Filtros HEPA ( high-efficiency particulate air filters ) (eficácia de retenção de 99,99% para particulas de 0,3 µg) usados em: - câmaras de fluxo laminar de segurança biológica - salas limpas (In Prescott, Harley & Klein, Microbiology, McGrawHill, 6th ed)
Câmaras de Fluxo Laminar de Segurança Biológica (vários graus de contenção biológica) Segurança Biológica (nível de contenção 4) (In Prescott, Harley & Klein, Microbiology, McGrawHill, 6th ed) ( In Microbiology today, vol 33, pag 18)
Transferência de culturas de microrganismos - Técnicas de assépsia Chama do bico de Bunsen (Vizinhança da chama do bico de Bunsen oferece condições assépticas) Ansa de repicagem (filamento metálico) (In Brock Biology of Microorganisms, 10th edition, Prentice Hall)
A imobilização das células num meio sólido torna possível a visualização do crescimento em massas celulares homogéneas e isoladas denominadas colónias. Isolamento de colónias pela técnica de RISCADO EM MEIO SÓLIDO Isolamento de colónias em meio sólido (In Brock Biology of Microorganisms, 10th edition, Prentice Hall) Colónia cultura pura de um microrganismo A cultura pura de um dado microrganismo é uma cultura de células genética e morfologicamente idênticas.
CRESCIMENTO MICROBIANO é exponencial (Inóculo inicial num ponto da superfície de meio de cultura sólido)... 1ª geração 2ª geração 3ª geração...
Isolamento de colónias de microrganismos Técnica de ESPALHAMENTO em meio sólido (In Prescott, Harley & Klein, Microbiology, McGrawHill, 6th ed) Exemplo: Suspensão de solo em água (População mista de microrganismos) Após incubação à T ambiente durante 24 h COLÓNIAS COM MORFOLOGIAS DIFERENTES MICRORGANISMOS DIVERSOS (Noção de estirpe)
Morfologia de colónias forma e tamanho dependem do microrganismo mas, também podem depender das condições ambientais, tais como, quantidade de oxigénio e nutrientes disponíveis no meio de cultura, ph,etc.. (In Prescott, Harley & Klein, Microbiology, McGrawHill, 6th ed)
Robert KOCH (1876) primeiro cientista a definir CULTURA PURA e a isolar COLÓNIAS de bactérias em meios de cultura sólidos. R. Koch Microfotografia de bactérias provenientes de uma colónia isolada (confirmação de ser um único tipo morfológico) Bacillus anthracis (desenhos de R. Koch, sec XIX) (In Brock Biology of Microorganisms, 10th edition, Prentice Hall)
Passo 1. Isolamento de colónias e enumeração de Unidades Formadoras de Colónias (UFC) células viáveis (p.ex. numa amostra de solo) Solo população mista - vários triliões de células de microrganismos diversos Suspensão de solo em água (10g / 100 ml) Passo 2. Passo 3a 0,1 ml Passo1. Diluições sucessivas da suspensão de solo (10-1 ou 1: 10; 10-2 ou 1: 100; 10-3 ou 1: 1000; 10-4 ou 1: 10000;...) Passo 3b Passo 4. (In R. Maier, I L Pepper, C P Gerba, Environmental Microbiology, Academic Press)
Diluição 10-2 10-3 10-4 (In R. Maier, I L Pepper, C P Gerba, Environmental Microbiology, Academic Press) 50 colónias (diluição 10-3 ) Nº de colónias em cada placa de Petri está relacionado com o tamanho da POPULAÇÃO CULTIVÁVEL presente na amostra original de solo 50 x 10 x 10 3 UFC / ml suspensão de solo (A) 50 x 10 6 UFC / 100 ml de suspensão de solo /10 g de solo Tipos morfológicos diferentes das colónias em cada placa relacionado com a diversidade de microrganismos cultiváveis presentes no solo. Bactérias Fungos miceliais (bolores)
CULTURA DE ENRIQUECIMENTO Isolamento de microrganismos pouco abundantes e com requerimentos nutricionais específicos, a partir de populações mistas (p.ex. bactérias que são capazes de degradar benzoato, i.e. usam benzoato como fonte de C e energia). (adaptado de Perry, Staley, Lory, Microbial Life, Sinauer ed.) PRESSÃO SELECTIVA presença de fonte de C e energia única (neste caso, benzoato) Crescimento em meios de cultura selectivos 1º) enriquecimento em meio liquido (nas bactérias em causa) 2º) isolamento de colónias em meio sólido Outros exemplos: - Isolamento de bactérias que degradam um certo pesticida ou hidrocarbonetos do petróleo ou outros poluentes orgânicos do Ambiente.
LIMITAÇÃO DAS TÉCNICAS DE ISOLAMENTO DE COLÓNIAS Células viáveis, mas não cultiváveis Estima-se que que somente 1-10% dos microrganismos funcionais presentes nos ambientes naturais (p.ex solo, água, amostras clínicas) são cultiváveis em meios de cultura laboratoriais conhecidos versus 6 4.2 x 10 UFC de bactérias / g solo UFC=CFU Unidades Formadoras de Colónias (Colony Forming Units) vs Bactérias observáveis numa amostra de solo (observação directa através de microscópio de fluorescência) 4.2 x 10 10 Células totais / g solo Diversidade microbiana no solo é uma fonte importante para exploração biotecnológica de NOVOS microrganismos, produtos e processos
(Prescott, Harley e Klein, Microbiology, 5th edition) Exploração das potencialidades dos microrganismos não-cultiváveis nos meios de cultura laboratoriais conhecidos - Desenvolvimento de métodos moleculares (não dependentes do cultivo) para pesquisa e identificação ( ex. Análise de DNA, RNA, proteínas) -Procura de novas fórmulas para cultivo de microrganismos
Procura de microrganismos adequados para um processo industrial: - a partir da Natureza / Ambiente (solo, água, etc.) - são frequentemente sujeitos a processos de melhoramento (Engenharia Genética; mutação) Maximizar o rendimento do processo Novos produtos Estirpes adequadas (estirpes selvagens, mutantes ou geneticamente manipuladas) são conservadas em coleccções de culturas nacionais e internacionais (por ex. Micoteca da Universidade do Minho, American Type Culture Collection ATCC, National Collection of Industrial Cultures - UK)
Manutenção de microrganismos viáveis no Laboratório e em Colecções de Culturas Várias metodologias permitem a manutenção de culturas viáveis, não contaminadas e inalteradas nas suas propriedades durante períodos de tempo mais ou menos longos, nomeadamente:. Em rampas ou placas de Petri contendo meio sólido (viabilidade das células: dias ou semanas). Congelação (células suspensas em meio de cultura + glicerol (anti-criogénico) (viabilidade das células: anos) - em Azoto líquido (-196ºC) - em Arcas congeladoras (-70ºC). Liofilização (liofilização - desidratação das céluas por sublimação de água congelada, sob vácuo) (viabilidade das células: anos; décadas)