CRESCIMENTO MICROBIANO em suspensão em meio líquido

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1 CRESCIMENTO MICROBIANO em suspensão em meio líquido

2 Fases da divisão celular fissão binária (p.ex. E.coli) Microscopia de contraste de fase Microscopia de fluorescência (coloração do nucleóide com DAPI) Detecção das proteínas que formam o anel FtsZ) (combinação de colorações nucleóide e anel FtsZ) - Anel proteico (~10000 moléculas FtsZ) no centro da célula, quando começa a segregação dos dois nucleóides (DNA). Fts Filamentous temperature sensitive - Proteinas Fts do anel proteico divisoma (no centro da célula em divisão; orquestra síntese da membrana plasmática e da parede celular durante enlongamento da célula, seguindo-se constrição para formar o septo e separação das células).

3 Ciclo celular (ex. Eschericia coli) Fase C Fase D E. coli Tempo de geração médio, em condições óptimas ~ 25 minutos

4 EXPERIÊNCIA DE CRESCIMENTO DE UMA POPULAÇÃO MICROBIANA EM SUSPENSÃO EM MEIO LIQUIDO 1. INOCULAÇÃO A B 2. INCUBAÇÃO COM AGITAÇÃO ORBITAL CONSTANTE E TEMPERATURA CONTROLADA 3. DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE CÉLULAS, AO LONGO DO TEMPO

5 CRESCIMENTO EXPONENCIAL Imagine que arranja uma forma de manter uma população de células de E. coli em crescimento exponencial durante 24 horas. Se partir de uma única célula, estime quantas células obteria após esse período de 24 horas. Escherichia coli tempo de duplicação ~ 25 minutos 1 célula (10-12 gramas) 24 horas 57 duplicações = células (~1,4 x ) ~ 144 Kg de biomassa

6 Evolução da concentração de células da população microbiana CRESCIMENTO EXPONENCIAL ( [células] n (após n gerações) [células] N 0 N N N 0.2 n (após n gerações) Concentração de células no início da fase de crescimento exponencial Concentração de células após um periodo de tempo t de crescimento exponencial - N t. N t = N 0.2 n n = log N t - log N 0 log 2 n - nº de gerações ocorridas durante o período t de crescimento exponencial g = t / n g é o tempo de duplicação (ou, de geração) (min ou h)

7 Representação gráfica do crescimento exponencial

8 Cinética do crescimento exponencial Escala logaritmica Representação matemática (fase exponencial) Fase exponencial dn t dt = µ.n t µ -taxa específica de crescimento da população microbiana Equivalente a lnn t = lnn 0 + µ (t-t 0 ) (1) Ou µ (t-t 0 ) N t = N 0 e N, N 0 t 0 Prescott, Harley & Klein, Microbiology, th edition,mc GrawHill, 2002 g Crescimento exponencial equilibrado células completamente adaptadas às condições de crescimento N pode representar: - Concentração de células, N; - Densidade óptica da cultura, DO; - concentração de biomassa, X, - concentração de qualquer componente celular (p.ex. proteinas)

9 Estimativa da taxa específica de crescimento da população, µ A equação que representa o crescimento exponencial de uma população microbiana corresponde à equação de uma recta ( onde y = lnn t, x = (t-t 0 )) ln N t = lnn 0 + µ (t-t 0 ) (1) y = b + ax a - declive (= µ) b ordenada na origem (= ln N 0 ) µ - taxa específica de crescimento da população microbiana (o valor de µ corresponde ao declive da recta lnn t vs. (t-t 0 )) Unidades : tempo -1 (h -1 ; min -1 ) Estimativa do tempo de duplicação da população, g Substituindo na equação (1) (t-t 0 ) = g quando N t = 2.N 0 g = ln 2 µ (h; min)

10 OBTENÇÃO DA CURVA DE CRESCIMENTO DA POPULAÇÃO MICROBIANA MÉTODOS PARA AVALIAR A CONCENTRAÇÃO DE CÉLULAS NUMA POPULAÇÃO MICROBIANA Contagem de células viáveis (N) - Método das diluições sucessivas e espalhamento em meio sólido Método espectrofotométrico (DO) Determinação da massa celular (biomassa, X) Contagem directa de células Câmaras de contagem (microscópio óptico) Contadores electrónicos

11 CONTAGEM DE CÉLULAS VIÁVEIS [expresso em UFC (Unidades Formadoras de Colónias) por ml de suspensão] Método das diluições sucessivas e espalhamento em meio sólido As placas devem ter entre ~ 20 e 300 colónias N = 1.59 x 10 5 UFC / ml

12 DETERMINAÇÃO ESPECTROFOTOMÉTRICA DA DENSIDADE CELULAR (Densidade Optica DO λ - medida a um comprimento de onda, λ, particular) I 0 intensidade de luz incidente ( λ particular) I 0 I I intensidade de luz transmitida através da suspensão de células Transmitância (T) = (I/I o ) x 100 (%) I 0 I DO = Abs = - log T/100 = log (I 0 /I) Prescott, Harley & Klein, Microbiology, th edition,mc GrawHill, 2002

13 Teórico Medido DO 640nm Medições no espectrofotómetro 0 Concentração de células

14 BIOMASSA - representado normalmente por X Estimativa da biomassa seca (peso seco) - Pesagem da massa de células presentes na cultura microbiana. - Peso seco ou húmido - É usado em circunstâncias específicas, como, por exemplo quando se pretende obter o rendimento em biomassa do crescimento. Em certas condições, o aumento da massa pode não reflectir crescimento da população, mas aumento de compostos de reserva

15 Câmara de contagem Lâmina de vidro especial, onde está marcado um reticulado com dimensões conhecidas; também é conhecida a distância da lâmina à lamela, sendo possível estimar o volume de suspensão de células sobre o reticulado. Fácil, barato e rápido. Útil para contar células de eucariotas e procariotas. Observação no Microscópio Óptico Não distingue células viáveis de mortas. Figure 6.5 Prescott, Harley & Klein, Microbiology, th edition,mc GrawHill, 2002

16 CURVA DE CRESCIMENTO DUMA POPULAÇÃO MICROBIANA EM DESCONTÍNUO ( BATCH ) Cultura batch sistema fechado (excepto troca de gases) Fase estacionária Log Optical Density (OD. ---) Fase de morte Fase de latência Fase exponencial Prescott, Harley & Klein, Microbiology, th edition,mc GrawHill, 2002

17 Exemplo cálculo da taxa específica de crescimento Variação da concentração de células duma população bacteriana (incubação em meio de cultura líquido, a 37ºC) Tempo (h) N (células / ml) x x x x x x x 10 4 Latencia Exponencial Estacionária x 10 4 N (Escala logaritmica) Estimativa da taxa específica de crescimento da população, µ (Análise de regressão linear: ln N t vs. t declive = 0.7 µ = 0.7 h -1 ) Declive: 0, Tempo (h) População duplica em 1h ln N 2 ln N 1 µ = = ln (3.0 x 10 4 ) - ln (1.5 x 10 4 ) = 0.7 h -1 (2-1) Estimativa do tempo de duplicação, g g = ln2 / µ = ln2 / 0.7 = 1 h

18 Valores de g e de µ dependem de: - potencial genético da estirpe microbiana. Prescott, Harley & Klein, Microbiology, th edition,mc GrawHill, composição do meio de cultura; - condições ambientais (Temperatura, ph, disponibilidade de água, nível de oxigénio, etc.)

19 Crescimento diáuxico Exemplo: Crescimento de população de Escherichia coli em meio de cultura com duas fontes de C e energia, glucose e lactose. β-galactosidade lactose glucose + galactose ln [ Células viáveis] Consumo de lactose Glucose esgotada Consumo de glucose Tempo Glucose rapidamente metabolizada; Repressão da expressão do operão da lactose (Fenómeno: Repressão Catabólica)

20 INFLUÊNCIA DA CONCENTRAÇÃO DE NUTRIENTE LIMITANTE NO CRESCIMENTO MICROBIANO

21 [Biomassa] X (mg/l) [Nutriente], S (---) Tempo (h) A cheio (vermelho) - Curva de crescimento expressa em termos de evolução da concentração total de biomassa formada (escala logaritmica) em função do tempo. A tracejado (azul) Evolução da concentração do nutriente S ao longo do tempo de crescimento.

22 The relationship between concentration of limiting nutrient, growth rate (green curve) and growth yield (red curve) in a batch culture (closed system). At low nutrient concentrations both growth rate and growth yield are affected.

23 A taxa específica de crescimento, µ, depende da concentração de nutriente limitante (S) fornecida no meio de cultura µ max µ max EQUAÇÃO DE MONOD µ = µ max K s S + S 2 K s, S Concentração saturante de S Situação raramente encontrada nos ambientes naturais, onde um ou mais nutrientes estão normalmente presentes em concentrações limitantes ( µ < µ max )

24 µ max - Taxa específica máxima de crescimento - quando concentração de S é saturante; sistemas de transporte transmembranar para o nutriente S estão saturados K S Constante de semi-saturação - numericamente igual à concentração de substrato que permite uma taxa de crescimento igual a metade da µ max ; reflecte a afinidade dos sistemas de transporte transmembranar para a molécula do nutriente limitante (maior K s menor afinidade menor µ) Os valores das constantes µ max e K S dependem: - das caracteristicas intrínsecas do microrganismo; - do substrato limitante; - das condições ambientais (ex. Temperatura, ph, etc.) Microrganismo Temperatura Nutriente limitante µ max (h -1 ) K s (mg/l) Escherichia coli 37ºC Glucose Escherichia coli 37ºC Glicerol Escherichia coli 37ºC Lactose Saccharomyces cerevisiae 30ºC Glucose Candida tropicalis 30ºC Glucose Competição entre diferentes microorganismos (p.ex. S. cerevisiae e C. tropicalis)

25 Inibição pelo substrato, S Rendimento do crescimento, Y = Biomassa total formada (fase estacionária) = X Massa de nutriente usada S - Y reflecte a eficiência do crescimento microbiano relativamente ao nutriente (substrato) limitante usado para crescimento (fins comerciais / custos de produção)

26 FACTOR DE RENDIMENTO EM ATP (Y ATP ) = Biomassa produzida (g) ATP produzido (moles) Medida da eficiência com que a célula utiliza para crescimento (i.e. biossíntese de novo de biomassa) a energia que produz. Conceito de ENERGIA DE MANUTENÇÃO Exemplo: S fonte de C e energia, fermentiscível (p.ex. glucose) S BIOSSÍNTESE DE MATERIAL CELULAR (CRESCIMENTO) ENERGIA ( ATP) verifica-se que Y ATP real < Y ATP teórico (i.e., admitindo que todo o ATP sintetizado é usado para biossíntese) Energia de MANUTENÇÃO (desvio) (Ex. Gastos em renovação de macromoléculas (proteínas, RNA), expulsão activa de metabolitos tóxicos, manutenção de gradientes electroquímicos de iões e do ph intracelular em níveis óptimos, etc. Para uma dada estirpe microbiana, o valor Y ATP depende das condições ambientais. Quanto mais afastadas das condições óptimas, maiores são os gastos de energia para manutenção: Y ATP

27 Prescott, Harley & Klein, Microbiology, th edition,mc GrawHill, 2002 Esquema de bioreactor (ou fermentador) industrial para microrganismo aeróbio (Note os sistemas para medição e controlo de temperatura, ph, nivel de oxigénio e para análise de metabolitos biosensor unit)

28 Scale-up na produção industrial de microrganismos (exemplo- produção de células da levedura Saccharomyces cerevisiae)

29 TIPOS E EXEMPLOS DE PRODUTOS DE ORIGEM MICROBIANA

30 Metabolitos primários vs. secundários ( ) Concentração de células ou massa celular Crescimento Crescimento Formação de metabolito primário Tempo Formação de metabolito secundário ( ) Concentração de produto formado Metabolito primário associado ao metabolismo essencial do microrganismo (Ex. etanol, produzido em resultado da fermentação alcoólica) Metabolito secundário após a fase de produção das células (após o crescimento exponencial), normalmente a partir de um metabolito primário ou de substrato usado para crescimento que esteja em excesso Ex. antibióticos produzidos por fungos miceliais ou por bactérias)

31 CULTURA CONTÍNUA DE MICRORGANISMOS NO QUIMIOSTATO

32 S 0, F Esquema de funcionamento de um bioreactor para a cultura contínua de microrganismos (exemplo - quimiostato) X, S, F QUIMIOSTATO opera por fornecimento do nutriente limitante do crescimento a uma taxa constante (relacionada com o caudal de entrada do meio de cultura fresco), de modo que a densidade celular (biomassa) e a taxa específica de crescimento do microrganismo se ajustam a este fornecimento.

33 TAXA DE DILUIÇÃO Caudal de alimentação do meio fresco = caudal de saída da cultura = F (Litros/hora) Volume da cultura no quimiostato = V = constante (L) F D taxa de diluição = (h -1 ) (inverso do tempo de retenção médio da célula V no interior do quimiostato) ESTADO ESTACIONÁRIO O quimiostato permite manter a população microbiana em crescimento equilibrado, isto é, na fase de crescimento exponencial, durante períodos de tempo longos i.e. em ESTADO ESTACIONÁRIO.

34 Equação do estado estacionário no quimiostato Balanço de massas à massa celular, X (não há morte celular; não há entrada de células do exterior, X 0 =0)) S 0, F Variação da massa celular = Massa celular - Massa celular no quimiostato produzida que sai no efluente dx dt = µ.x - F V.X V = volume de cultura no quimiostato (L) Estado estacionário dx dt = 0 F µ.x = V.X F V µ = D µ = = D X massa celular (g/l) F caudal (L/h) X, S, F S concentração de nutriente Limitante (g/l) T tempo (h) µ taxa específica de crescimento (h -1 ) D taxa de diluição (h -1 )

35 Estado estacionário ( steady state ) no quimiostato Dependência da concentração de biomassa (X), da concentração de nutriente limitante (S) e do tempo de duplicação da população microbiana no estado estacionário, em função da taxa de diluição a que o quimiostato opera (D). (X) (S 0 ) (S) (D) Exemplo: Volume cultura = 5000 ml; Caudal através do quimiostato, F = 2500 ml/hora --- D = 0,5 h -1 Nota: alteração de F alteração da taxa de diluição, D WASHOUT (quando D D c D c taxa de diluição crítica)

36 Desvio ao modelo estabelecido para o quimiostato (X em função de D): Caso - limitação do crescimento pela fonte de C Microrganismos quimiorganotróficos hetrotróficos (p.ex., nutriente limitante S é fonte de Carbono e de energia) uma parte significativa da energia produzida a partir de S é desviada para gastos energéticos de manutenção (Energia de Manutenção). Mensurável quando a taxa de diluição a que o quimiostato opera é muito baixa (X) (S 0 ) (S) (D)

37 Vantagens/aplicações do crescimento microbiano em contínuo no quimiostato (versus crescimento descontínuo ou batch ): População microbiana na fase exponencial do crescimento durante períodos longos (semanas, meses) Culturas em crescimento exponencial com taxas específicas de crescimento diferentes (através da (simples) modificação da taxa de diluição útil para estudos fisiológicos) Produto com características constantes durante períodos de tempo longos Maiores produtividades, e eliminação de tempos mortos Vantagens na selecção de microrganismos que sejam mais competitivos na utilização do nutriente limitante Vantagens no estabelecimento de culturas de enriquecimento para isolamento de populações microbianas específicas a partir de populações mistas (por ex., amostras ambientais)

38 A afirmação (ou não) de um dado microrganismo face a outro (p.ex., se a população for mista), depende da relação entre os coeficientes de Monod para os microrganismos em causa (depende em particular da constante de semi-saturação para o substrato S, K S, que é inversamente proporcional à eficiência com que o microrganismo utiliza o nutriente limitante). EXEMPLO Quimiostato a operar com D = µ A µ maxa ~ µ maxb D = Microrganismo A S µ A = µ max A K sa + S µ B = µ max B Microrganismo B S K sb + S Se K SB > K SA µ B < µ A µ B < D Só o microrganismo A permanece no quimiostato B não permanece no quimiostato (i.e. sofre washout ) Se K SB < K SA µ B > µ A µ B > D B permanece no quimiostato, juntamente com A Em cultura contínua, um microrganismo invasor (p.ex. contaminante ou mutante viável) pode acumular no quimiostato, se for competitivo, isto é, se utilizar o nutriente limitante eficientemente face à estirpe microbiana original contaminação da cultura original. Mas, se não for competitivo, é expulso do quimiostato.

39 NOTAS sobre crescimento microbiano

40 CRESCIMENTO MICROBIANO O crescimento microbiano é definido como o aumento coordenado de todos os constituintes celulares (por exemplo, ácidos nucleicos, proteínas, lípidos ). Este aumento está normalmente associado ao aumento do número de células em consequência da multiplicação celular. É definido como o crescimento duma população de células dum microrganismo, ou seja, o aumento do número de células do microrganismo ao longo do tempo. É normalmente quantificado em termos do aumento no tempo de: (i) nº de células; (ii) densidade óptica da cultura; ou, (iii) massa celular (biomassa). Em certas condições, o aumento da massa pode não reflectir crescimento da população, mas aumento de compostos de reserva (p.ex. glicogénio, poli-β-hidroxibutirato, etc.) Grande parte dos microrganismos multiplica-se por fissão binária (p.ex. maior parte das bactérias) ou por gemulação (p.ex. maior parte das leveduras). Em consequência do processo de multiplicação celular, uma célula dará origem a duas ao fim de um certo período de tempo que é designado por tempo de geração ou duplicação.

41 O tempo de duplicação (ou geração) pode repetir-se várias vezes, enquanto estiverem disponíveis no meio de cultura nutrientes em quantidade suficiente para assegurarem os metabolismos catabólico (bioenergético) e anabólico (biossíntese) das células e enquanto as condições ambientais forem favoráveis. A duração do crescimento exponencial de bactérias em meio de cultura laboratorial depende da bactéria em causa e pode ficar limitada por falta de nutrientes, privação de oxigénio, acumulação de produtos tóxicos, ou outros factores. O conhecimento dos valores de µ (taxa especifica de crescimento) e de g (tempo de duplicação) para um dado microrganismo permite: - prever como evoluirá a concentração de células ao longo do tempo de incubação num determinado meio de cultura e/ou em determinadas condições ambientais; - testar o efeito de uma determinada alteração das condições ambientais sobre o crescimento do microrganismo (p.ex. modificação do meio de cultura, da Temperatura, etc.) OBJECTIVOS ESSENCIAIS: seleccionar as condições de cultura óptimas para um dado microrganismo. estabelecer métodos que permitam controlar o crescimento de microrganismos.

42 Contadores electrónicos (ex. Contador coulter, citómetro de fluxo) São instrumentos usados para contar partículas em suspensão. Possuem um pequeno orifício onde é estabelecida uma corrente eléctrica por recurso a 2 eléctrodos. Suspensão de células é forçada a passar pelo orifício. A passagem de cada partícula (célula, esporo, etc.) causa uma diminuição momentânea da condutividade eléctrica entre os eléctrodos. Os períodos de interrupção da corrente eléctrica são contados, sendo essa contagem uma medida do número de partículas presentes na suspensão. Fácil e rápido Não permite distinguir células viáveis de mortas Útil para microrganismos grandes, mas não para a maior parte das bactérias

43 FASES DO CRESCIMENTO MICROBIANO EM DESCONTÍNUO Cultura batch sistema fechado (excepto troca de gases) Fase de latencia Não ocorre aumento mensurável do número de células. Fase de adaptação ao novo meio (p.ex. síntese de novas enzimas) e a condições ambientais novas. Duração da fase de latência pode ser longa (várias horas), quando estão presentes compostos tóxicos, substratos dificeis de metabolizar ou o inóculo é insuficiente (nº de células viáveis ou vitalidade das células insuficientes). Fase exponencial Crescimento da população com taxa (velocidade) constante. Durante esta fase, em que todos os nutrientes estão presentes em excesso, os microrganismo dividem-se e a população cresce com uma taxa específica de crescimento máxima. O valor desta taxa de crescimento depende do potencial genético do microrganismo, da composição do meio de cultura e das condições de crescimento (temperatura, ph, disponibilidade de água, etc.). Fase estacionária O crescimento da população pára, devido a esgotamento de nutriente essencial ou acumulação de metabolito tóxico. Parte das células podem permanecer viáveis durante algumas horas à custa do consumo de materiais de reserva endógenos. Algumas espécies bacterianas exibem, nesta fase de crescimento, a produção de endósporos. Fase de morte Perda irreversível da capacidade de divisão celular; ocorre o decréscimo progressivo no nº de células viáveis da população.

44 NOTAS SOBRE CULTURA CONTÍNUA QUIMIOSTATO opera por fornecimento do nutriente limitante do crescimento a uma taxa constante (relacionada com o caudal de entrada do meio de cultura fresco), de modo que a densidade celular (biomassa) e a taxa específica de crescimento do microrganismo se ajustam a este fornecimento. Meio de cultura fresco (esterilizado) é fornecido contínuamente (caudal F), o qual contém, entre outros nutrientes, o nutriente limitante (concentração S 0 ). Simultâneamente, parte da cultura é removida, com o mesmo caudal F a que meio de cultura fresco entra. O efluente removido contém células do microrganismo (biomassa, X), assim como produto(s) sintetizado(s) pelas células. A concentração de nutriente limitante à saída (S) é, em condições operacionais adequadas, muito baixa ou aproximadamente nula.

45 No estado estacionário (no quimiostato): a taxa específica de crescimento do microrganismo (µ) é controlada pela taxa de diluição a que o quimiostato opera (D) (i.e. é válida a equaçãoµ = D) e, consequentemente, pela razão entre o caudal (F) e o volume de cultura no recipiente (V) é possível obter populações microbianas em crescimento com taxas específicas de crescimento diferentes através da alteração da taxa de diluição aplicada no quimiostato a densidade celular (biomassa, X) obtida no quimiostato é controlada pela concentração do nutriente limitante, sendo válida a equação X = Y (S 0 -S) onde Y é o rendimento do crescimento para o substrato limitante e S representa a concentração residual do nutriente limitante no quimiostato. Modelo para o crescimento no quimiostato equação de Monod i.e., o valor da taxa de diluição, D, relaciona-se com a concentração de nutriente limitante do crescimento com base na equação de Monod D = µ D = µ max S K s + S S = D. K S µ max - D

46 Notas sobre as representações gráficas da concentração de biomassa (X), da concentração de nutriente limitante (S) e do tempo de duplicação da população microbiana no estado estacionário, em função da taxa de diluição a que o quimiostato opera (D). A densidade celular (biomassa, X) é igual, para uma gama larga de taxas de diluição a que o quimiostato pode operar (consequentemente, a concentração residual de nutriente limitante, S, no quimiostato é mantida com um valor baixo, uma vez que este nutriente está a ser consumido pelas células da cultura em crescimento) ; Apesar da concentração de biomassa permanecer constante, a taxa específica de crescimento pode variar com a variação da taxa de diluição que é aplicada no quimiostato (porque µ = D); quanto maior a taxa de diluição, maior a taxa de crescimento da população (e, inversamente, menor é o tempo de duplicação ou geração). A gama de valores de taxa de diluição, D, a que o quimiostato pode operar é limitada. O valor limite é a taxa de diluição crítica (D c ). Para valores muito altos da taxa de diluição (D D c ), o crescimento celular não consegue compensar a diluição da cultura, e a população de células sai do quimiostato ( Wash-out lavagem do quimiostato) ; consequentemente, nessas condições, a concentração de nutriente limitante aumenta, porque não é consumido ; quando D D c S=S 0 ) A taxa de diluição torna-se crítica e ocorre o Wash-out quando a taxa de diluição a que o quimiostato opera ultrapassa a taxa específica máxima de crescimento da população microbiana (µ máx )

47 Cultura contínua permite estabelecer condições selectivas para o enriquecimento de amostras ambientais (populações mistas) em microrganismos específicos Por exemplo: microganismos capazes de metabolizar eficientemente nutrientes tóxicos ou dificilmente metabolizáveis (comparativamente a outros microrganismos presentes numa amostra ambiental, p.ex. solo, água, esgoto, etc.) P.ex. Útil para o isolamento de microrganismos capazes de biodegradar hidrocarbonetos do petróleo, benzeno, fenol, ácido benzóico, pesticidas ou outros compostos orgânicos, a partir de solo (população mista). (nestes casos, o quimiostato é inoculado com a amostra ambiental; o meio de cultura fresco contém o composto em causa como substrato limitante para crescimento e é fornecido contínuamente com taxa de diluição adequada; nestas condições, prolifera(m) preferencialmente o(s) microrganismo(s) que seja(m) capaz(es) de metabolizar eficientemente o composto em causa; outros microrganismos que não tenham essa capacidade (p.ex, com µ < D) eventualmente presentes na amostra ambiental, sofrerão washout, sendo expulsos do quimiostato) Em cultura contínua, mediante a selecção de taxa(s) de diluição adequada(s), é possível seleccionar uma população de células dum microrganismo único, que seja muito competitivo e metabolize muito eficientemente um composto orgânico face a outros microrganismos menos competitivos eventualmente presentes numa população mista inicial. Pelo contrário, em cultura descontínua/ batch, todos os microrganismos, mais ou menos competitivos na utilização do composto orgânico, permanecem no meio de cultura cultura batch é menos eficiente quando se pretende seleccionar microrganismos muito eficientes na utilização do composto em causa como substrato para crescimento.

48 Se ocorrer: 1 Contaminação da cultura Em cultura contínua, é necessário manter condições de esterilidade durante períodos longos. A adição contínua de meio fresco e o arejamento aumentam a probabilidade de ocorrer contaminação da cultura. Contudo, condições especiais, tais como temperaturas elevadas, valores de ph extremos e substratos pouco usuais podem reduzir a probabilidade de ocorrer contaminação da cultura. 2 Degenerescência da cultura Durante a multiplicação celular dum certo microrganismo pode ocorrer uma mutação expontânea, e surgir um mutante viável na cultura. Consequências Em cultura contínua, um microrganismo invasor (contaminante ou mutante viável) acumula no quimiostato se for competitivo, isto é, se utilizar o nutriente limitante eficientemente face à estirpe microbiana original contaminação da cultura original. Mas, se não for competitivo, é expulso do quimiostato. Na cultura bacth, todo o contaminante (ou, mutante viável) capaz de utilizar o nutriente limitante acumula no meio de cultura, juntamente com o microrganismo que se pretende cultivar contaminação da cultura original.