Eliminação de todas as formas de vida de seu interior ou superfície

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1 ESTERILIZAÇÃO Esterilização de um equipamento: Eliminação de todas as formas de vida de seu interior ou superfície Métodos físicos: Calor seco, radiação ultravioleta, radiação com partículas ionizantes (gama), ultra-som Métodos químicos: Limpeza do equipamento com líquidos ou gases que matam os microrganismos ou danificam irreversivelmente sua capacidade de reprodução Hipoclorito, fenóis, formaldeído, óxido de etileno, ozônio, dióxido de enxofre, entre outros

2 Esterilização de Meios de Fermentação Conseqüências da presença de um contaminante no processo: Compromete seriamente o resultado Ex: produção de penicilina (penicilinase); fermentação acetonabutanólica (vírus bacteriófagos) Afeta negativamente o processo Consomem os nutrientes competindo com o microrganismo de interesse: produção de enzimas, vitaminas, etanol Pouco ou nada compromete o processo Tratamento de resíduos, produção de vinagre Eliminação de contaminantes depende de cada caso Em alguns casos a eliminação de contaminantes pode inviabilizar economicamente o processo

3 ESTERILIZAÇÃO Métodos utilizados Reatores bioquímicos, tubulações, bombas, filtros, centrífugas, misturadores, separadores: calor úmido Material de laboratório: calor úmido (autoclave), calor seco (fornos), radiação ultravioleta Meios de cultura: calor úmido, filtração em membranas ou cartuchos esterilizantes Ar: cartuchos esterilizantes Embalagens: radiação gama, calor úmido ou lavagens com produtos químicos

4 AGENTES ESTERELIZANTES Calor úmido: Temperatura elevada + alto grau de umidade Desnatura irreversivelmente as proteínas (a resistência térmica das proteínas está diretamente ligada ao grau de hidratação das células) Carameliza carboidratos produzindo, neste processo, produtos tóxicos Autoclaves (vapor sob pressão) Transferência de calor é favorecida pela condensação ocorrida no material rápido aumento de temperatura Manutenção do nível de hidratação da célula

5 AGENTES ESTERELIZANTES Calor seco: Destrói o microrganismo pela oxidação de seus constituintes químicos Mais lenta e menos eficaz que o calor úmido Calor é transmitido muito lentamente Nível de hidratação das células tende a diminuir o que, de certa forma, pode proteger as proteínas

6 AGENTES ESTERELIZANTES Radiação UV Radiação UV é absorvida pelos ácidos nucléicos causando lesões Seu efeito letal é proporcional à dose de radiação aplicada Região do espectro com efeito esterilizante: 220 a 300nm Fatores que influenciam na sensibilidade microbiana a UV: ph Estado fisiológico da célula (fase de crescimento) e; Constituição genética

7 Esterilização de Equipamentos Agentes Físicos (Calor úmido) Calor úmido por vapor de água saturado: Mais usado Facilidade de obtenção, eficácia, custo relativamente baixo Vapor é obtido em caldeiras e transportados por dutos de aço galvanizado ou inoxidável, isolados termicamente

8 Esterilização de Equipamentos Agentes Físicos (Calor úmido) PROCESSO DESCONTINUO - BATELADA Esterilização de reatores vazios Injeção de vapor no interior do reator e promovendo expulsão de todo o ar presente fecha-se o reator e injeta-se vapor até a temperatura e pressão adequada (121 o C, 1atm) terminada a esterilização: injeta-se ar esterilizado para evitar o resfriamento e condensação do vapor após resfriamento e estabilização na pressão o meio de cultura esterilizado externamente é carregado

9 Esterilização de Equipamentos Agentes Físicos (Calor úmido) Esterilização de reatores vazios ar vapor vapor 121 o C/1atm Ar esterilizado Estabilização da pressão e da temperatura

10 Esterilização de Equipamentos Agentes Físicos (Calor úmido) Esterilização de reatores com meio de cultura: 1 a etapa: circula-se vapor pela serpentina ou camisa até que a temp. do meio de cultura seja maior que 96 a 97 o C. 2 a etapa: injeta-se vapor diretamente no meio de cultura até atingir 100 o C fecha-se o reator, a injeção continua até que a temperatura atinja 121 o C e 1atm de pressão (mantidas através da serpentina ou camisa) 3 a etapa: resfriamento feito pela circulação de água fria na serpentina ou camisa

11 Esterilização de Equipamentos Agentes Físicos (Calor úmido) Esterilização de reatores com meio de cultura Vapor na serpentina Vapor no meio Água fria na serpentina 96 a 97 o C 100 o C Resfriamento

12 Esterilização de Equipamentos Agentes Físicos (Calor úmido) Esterilização de reatores com meio de cultura: Tempo de esterilização: Reator onde se usa o mesmo microrganismo sempre: 20 a 40 minutos Reator onde se utilizam vários microrganismos: mais de 60 minutos Relação adequada entre a área de serpentina e o volume do meio de cultura favorece o aquecimento rápido

13 Esterilização de Equipamentos Agentes Físicos (Calor úmido) Esterilização em autoclaves Para reatores de pequeno porte (até 30L) Horizontais e verticais Geração de vapor: elétrica, a gás ou externa (caldeira)

14 Esterilização de Equipamentos Agentes Físicos (Calor úmido) Válvula de segurança Manômetr o Fermentador aquecimento água

15 Esterilização de Equipamentos Agentes Físicos (Calor úmido)

16 Esterilização de Equipamentos Agentes Físicos (Calor úmido) ESTERILIZAÇÃO DESCONTINUA DESVANTAGENS Manutenção do meio em temperaturas altas por tempo prolongado Desenvolvimento de reações químicas => alterações indesejáveis na composição do meio Elevados consumos de vapor e de água (resfriamento) Tempo não produtivo elevado Problemas de corrosão => tempo elevado de contato com o meio aquecido

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18 Esterilização de Equipamentos Agentes Físicos (Calor úmido) ESTERLIZAÇÃO CONTINUA VANTAGENS => tempo de permanência do meio em temperaturas elevadas é mais curto => maior rendimento. Ex: 5 a 6 x na prod de riboflavina => tubo de espera com dimensões menores => materiais especiais que não sofram corrosão => esterilização de meios viscosos sem utilização de agitadores => economia de vapor e de água => trocadores de calor com isolamento eficiente

19 CINETICA DA DESTRUIÇÃO TERMICA DOS MICRORGANISMOS Destruição por calor úmido depende de: Microrganismo: espécie, linhagem, existência de esporos, idade da cultura Meio de cultivo: composição, ph, presença de sólidos em suspensão Temperatura dn/dt = - k. N

20 CINETICA DA DESTRUIÇÃO TERMICA DOS MICRORGANISMOS t (minutos) N 25 8,5 x ,5 x ,0 x ,0 x Destruição térmica de Bacillus stearothermophilus a C ln N y = -0,034x + 12,16 R² = 0,999 N Linear (N) t (min)

21 Destruição de nutrientes do meio Quanto mais elevada a temperatura escolhida para a destruição dos m.o., menor será a destruição dos nutrientes Melhores resultados para a fermentação

22 CALCULO DO TEMPO DE ESTERILIZAÇÃO t= 1/k. Ln N 0 /N Problema (esterilização) 1- meio de cultivo não apresenta apenas 1 espécie microbiana a ser destruída solução: adotar um m.o. de referencia, extremamente resistente Bacillus stearothermophilus esporulado

23 CALCULO DO TEMPO DE ESTERILIZAÇÃO 2- k também depende do meio e da temperatura Solução: buscar valores de k do m.o. em suspensão no meio utilizado em várias temperaturas 3- as células microbianas podem estar em aglomerados ou protegidas por películas => aumento da resistência à destruição térmica 4- Por definição, esterilização => N = 0 Solução => Probabilidade de falha

24 CALCULO DO TEMPO DE ESTERILIZAÇÃO - Et => numero total de operações de esterilização realizadas nas mesmas condições - Ef => numero de operações de esterilização que falharam - P => probabilidade de falha P = Ef/Et x 100 => %

25 CALCULO DO TEMPO DE ESTERILIZAÇÃO - situação: probabilidade de falha = 0,03 (3%) => de 100 partidas: 97 esterilizadas 3 não esterilizadas - Considerando N0 = numero de m.o vivos em cada partida => nas 100 partidas: 100 N0 * para que falhe a partida há pelo menos 1 m.o. vivo => minimo de 3 m.o. vivos nas 100 partidas

26 CALCULO DO TEMPO DE ESTERILIZAÇÃO POR PROCESSO DESCONTINUO θ= t de esterlização N1 = no inicial de celulas vivas P = probabilidade de falha Te = temperatura de esterilização Tm = temperatura minima letal Tf = temperatura final do meio esterilizado = temp de fermentação -Curvas de aquecimento e resfriamento - variação de k com a temperatura

27 CALCULO DO TEMPO DE ESTERILIZAÇÃO POR PROCESSO DESCONTINUO

28 Esterilização de ar - métodos Calor seco

29 Esterilização de ar - métodos Filtração Filtros de materiais fibrosos Lã de vidro Pouca aplicação industrial Microrganismos são retidos por retenção mecânica e em profundidade A camada filtrante ocupa a parte central do recipiente A passagem do ar através da camada filtrante deve ser a uma temperatura superior a ambiente para manter a camada aquecida e evitar a condensação de umidade.

30 Esterilização de ar - métodos Filtração Filtros de membranas Membranas elaboradas de materiais poliméricos hidrofóbicos retenção de aerossóis microbianos na superfície do elemento filtrante (poros de dimensões menores que as dos microrganismos 0,45µm Filtros: Discos Cartuchos Filtros de membranas poliméricas microporosas. (Schmidell et al., 2001)

31 Esterilização de ar - métodos Filtração Filtros HEPA ( High Efficiency Particulate Air ) Filtros empregados em câmaras assépticas (fluxo laminar) ou áreas limpas Montados com vários elementos filtrantes separados por folhas de alumínio Antes do uso da câmara deve-se proceder a desinfecção das superfícies com etanol e a manutenção da mesma fechada com a luz ultravioleta ligada. Capela de fluxo laminar. (Schmidell et al., 2001)