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Cinética Enzimática Profª Eleonora Slide de aula

Cinética das Reações Bioquímicas As células ias dos organismos heterotróficos e dos organismos autotróficos (na ausência de luz) obtêm a energia de que necessitam a partir da oxidação dos poliosídios de resera a CO 2 e água. Esse conjunto de reações, assim como, as reações de síntese das macromoléculas, só é possíel deido à interenção dos catalisadores bioquímicos as enzimas. Todas as enzimas são proteínas globulares e catalisadores eficientes. Catalisadores Energia de atiação necessária para iniciar um processo químico pode ser fornecida pela eleação da temperatura que aumente a agitação molecular. Em Bioquímica, a temperatura dos sistemas não pode ultrapassar os alores compatíeis com a ida dos organismos (aquecimento desnaturação das proteínas). Catalisadores bioquímicos função de baixar a energia de atiação necessária à reação e permitir que a reação ocorra em elocidade muito mais eleada.

Centro atio ou sítio atio É constituído pelo conjunto de aminoácidos que entram em contato com o substrato. Compreende o local de fixação: que se combina com o substrato por ligações fracas; e o centro catalítico: que atua sobre o substrato leando-o a sofrer a reação química. A conformação do local e fixação se modifica em conseqüência da ligação ao substrato substrato induz a alteração da conformação. Nas enzimas que atuam atraés de um cofator (metal; grupo prostético ou coenzima), essa estrutura se encontra ligada na izinhança do centro catalítico.

Velocidade da Reação enzimática A elocidade de uma reação enzimática é, em geral, obtida pela medida da quantidade de produto (ou produtos) formado (s) por unidade de tempo. S + E P + E S substrato; E enzima; P produto A determinação experimental da elocidade da reação é feita recolhendo do meio reacional, a interalos regulares de tempo, alíquotas da solução. A elocidade de reação num tempo (t) é: d[ P] d t A elocidade pode ser medida, também, a partir do decréscimo da concentração de substrato: d[ S] d t

Representação gráfica: Quantidade de produto formado α 1 o tg α o 1 tg α 1 elocidade inicial de uma reação enzimática elocidade num instante t 1 α ο t 1 Tempo Até certo ponto da reação, a ariação é linear. É antajoso medir a elocidade no início da reação, quando pouco substrato foi transformado e a elocidade inersa é desprezíel. A inclinação é então máxima, o que permite ter a elocidade inicial da reação ( 0 ).

A elocidade da reação é diretamente proporcional à concentração da enzima [P] 4 x x 2 x 1 x E 4 E E2 E 1 Velocidade de uma reação enzimática em presença de quantidades crescentes de enzima (E 2 2E 1 ; E E 1 ; etc..) A elocidade de formação de produto (dp/dt) é constante para E1 e E2 até o tempo t 1 t 1 t 2 Tempo E 1 [ P] t 1 E 2 E E 4 Variação linear de elocidade inicial de uma reação enzimática com a concentração de enzima Na determinação de produto formado em interalo de tempo mais longo, a resposta não será linear em todas as faixas de [E] [E]

Fatores que Influenciam a Atiidade Enzimática Vários fatores influenciam a atiidade de uma enzima. Os mais importantes são a temperatura, ph, concentração de substrato e a presença ou ausência de inibidores. Temperatura A elocidade da maioria das reações químicas aumenta quando a temperatura aumenta. Moléculas se moem mais lentamente a baixas temperaturas do que a altas temperaturas e, portanto, muitas podem não ter energia suficiente para promoer a reação química. Para as reações enzimáticas, entretanto, eleações além de certa temperatura reduz drasticamente a elocidade de reação. A temperatura ótima para a maioria das enzimas se situa entre 5 e 40ºC. A redução da elocidade de reação acima da temperatura ótima é deida à desnaturação das enzimas, ou seja, a perda de sua estrutura tridimensional característica. A desnaturação de uma proteína enole o rompimento de ligações de hidrogênio e outras ligações não coalentes. Velocidade da reação 0 10 20 0 40 50 60 Temperatura (ºC)

ph A maioria das enzimas tem um ph ótimo no qual sua atiidade é máxima. Acima ou abaixo deste alor de ph a atiidade enzimática, e portanto a elocidade de reação, diminui. Quando a concentração de H + (ph) no meio é drasticamente alterada, a estrutura tridimensional da proteína também é alterada. Mudanças extremas na concentração de ácidos (ou bases) modificam a estrutura tridimensional de proteínas porque o H + (ou OH - ) compete com o hidrogênio nas pontes de hidrogênio e ligações iônicas presentes na estrutura da enzima, resultando na sua desnaturação. Atiidade Enzimática 4 6 8 10 ph

Concentração de Substrato Existe uma taxa máxima na qual certa quantidade de enzima pode catalisar uma reação específica. Apenas quando a concentração de substrato é extremamente alta, esta taxa máxima pode ser alcançada. Sob condições de alta concentração de substrato, a enzima está em saturação, isto é, seus sítios atios estão todos ocupados por moléculas de substrato ou produto. Nesta condição, um aumento na concentração de substrato não afetará a taxa de reação porque todos os sítios atios já estarão sendo utilizados. Em condições celulares normais, as enzimas não estão saturadas com o substrato. Em um determinado tempo, algumas das moléculas de enzima poderão estar inoperantes por falta de substrato, assim, a elocidade de reação é influenciada pela concentração de substrato. Inibidores Uma forma efetia de controlar o crescimento de um microrganismo, por exemplo, é controlar suas enzimas. Qualquer substância que reduza a elocidade de uma reação enzimática pode ser considerada como inibidor.

Cinética Enzimática Na reação enzimática se forma um complexo transitório entre enzima e substrato. A reação catalisada enzimaticamente se processa em duas etapas: E + S 1 ES A enzima se liga reersielmente ao substrato formando um complexo enzima-substrato (ES) O produto é liberado e a enzima olta à forma lire podendo, então, se ligar a outra molécula de substrato. E ES 2 E + P ES E + S 1 2 + P O estudo das reações enzimáticas se baseia em medidas de elocidade da reação catalisada. Velocidade de uma reação quantidade de produto formado em um tempo determinado. Velocidade inicial de uma reação medida em tempos suficientemente curtos para que no máximo 5% do substrato sejam transformados em produto. Em uma reação enzimática típica, a 1ª fase ocorre a elocidades muito maiores do que a 2ª fase. Equações de elocidade para estas fases são: 1 1 [ E] [ S] [ ES]

E + S 1 2 ES E + P A medida real da elocidade da reação, ou seja, a medida da elocidade de formação do produto é igual a, que é a etapa mais lenta e limitante do processo. Nas reações enzimáticas, a concentração de enzima é, normalmente, muito menor que a concentração de substrato. Um equilíbrio entre E, S e ES (com concentrações definidas e constantes de cada espécie) se estabelece muito rapidamente. Tendo ocorrido a formação de ES, se inicia a segunda parte da reação enzimática, aquela que efetiamente forma o produto, com uma elocidade proporcional à concentração de ES. O fato de ES estar sendo consumido na formação do produto não prooca diminuição da sua concentração, uma ez que há excesso de substrato para se combinar com a enzima liberada quando se forma o produto. Esta situação se mantém por algum tempo (tempo inicial): contínua formação do produto e concentrações estáeis de ES e S. A pequena e contínua diminuição da concentração de S não é significatia, face ao seu grande excesso.

À medida que se aumenta a concentração inicial do substrato, as elocidades de formação do produto se tornarão cada ez maiores. No equilíbrio da 1ª etapa existirá cada ez mais complexo ES. Nestas condições haerá a maior concentração possíel do complexo ES; a reação será processada na máxima elocidade possíel. Existirá uma determinada concentração de substrato que proocará a formação de uma concentração de ES igual à metade da máxima possíel. Nestas condições, a elocidade será, naturalmente, a metade da maior elocidade possíel. Esta concentração definida de substrato é igual à Constante de Michaelis-Menten ou Km. V b ½ V a Km [S] a cinética de 1ª ordem (elocidade proporcional à concentração de substrato) b cinética de ordem zero (elocidade independente da concentração de substrato)

Variação de elocidade da reação com a concentração de substrato Teoria de Michaelis-Menten (com um único substrato) E + S 1 2 ES 4 E + P E Enzima S Substrato ES Complexo enzima-substrato P Produto Propostas A enzima e o substrato reagem rapidamente para formar o complexo enzima-substrato (ES) A fase mais lenta é a formação de produto (P) Há excesso de substrato (S) Todas as determinações de produto (P) são feitas no início da reação quando a elocidade de formação do complexo enzima-substrato (ES) a partir de enzima (E) + produto (P) é muito pequena e pode ser desprezada elocidades iniciais

Dedução 1 E + S ES E + 2 P [ E] [ ] [ ] t E + ES [ ES] V [ E] t Qual a elocidade de formação de [ES]? [ E][ S] Qual a elocidade de decomposição de [ES]? [ ES] [ ES] Variação de [ES] com o tempo: d [ ES] d t Como no estado estacionário [ES] não aria 1 [ ][ ] ( + )[ ] [ ][ ] 2 [ ] E [ ][ ] [ ] E E S S S Km + 1 2 ES ES ES 2 + 1 1 2 + [ E][ S] [ ES] [ ES] 1 2 Km [ ] d ES d t 0 Km Constante de Michaelis ou Constante de dissociação do complexo ES (Ks)

É muito difícil quantificar [ES], porém, se sabe que: [ E ] t [ E] + [ ES ] [ E] [ ES ] + [ E] t Substituindo em : [ E ][ S] Km[ ES] [ ]([ ] [ ]) [ ] [ ] [ ] V S E E t ES Km Km t ES S Km E t ES [ S ] [ ] Km S [ ] [ ] [ ES ] + 1 [ S ] [ S ] [ ] + [ ] ES ES V. Equação de Michaelis-Menten Km + elocidade obserada na reação quando a concentração de substrato é [S] Km Constante de Michaelis-Menten V elocidade máxima da reação. Ocorre quando o substrato está presente em concentrações de saturação. A equação de Michaelis e Menten permite, após a determinação experimental das ariáeis em função de [S], obter o alor de V e calcular Km. Em geral, os alores de Km estão compreendidos entre 10-2 e 10-8 M. Atribui-se a Km unidades de concentração.

Cura de Michaelis-Mentem Variação da elocidade de reação em função da concentração do substrato V ½ V b c Equação de Michaelis-Mentem: V. Km + [ S ] [ S ] a Km Analisando a cura: a. Quando [S] << Km b. Quando ½ V V 2 [S] V [ S] Km + [ S] 1 V [ S] Km + [ S] desprezado V Km [S] 1ª ordem Km + [ S] 2[ S] Km tem dimensões de Km [ S] concentração c. Quando [S] >> Km V [ S] Km + [ S] negligenciáel V não depende da [S] Ordem zero

Por que determinar Km? Km estabelece o alor aproximado para o níel de substrato intracelular. [S] intracelular << Km seria muito sensíel a ariações de S (1ª ordem) e o poder catalítico da enzima seria desperdiçado, pois << V. [S] intracelular >> Km não há sentido fisiológico pois não pode exceder V. Quando [S] >> Km; se torna insensíel a ariações de S. Km é específico para uma dada enzima. Sere de meio de comparação entre enzimas extraídas de diferentes fontes, mas que catalisam a mesma reação. Pode-se determinar se duas enzimas são idênticas ou se são proteínas diferentes que catalisam a mesma reação. Variação no alor de Km induzida por um ligante é uma maneira de regular a atiidade de uma enzima. Se Km determinada in itro for diferente da determinada em condições fisiológicas, isto pode indicar a falta de um efetor. Vários efetores podem ser testados para a identificação de quais atuam como inibidores ou atiadores. Conhecendo-se o alor de Km pode-se determinar V que é função da [E] total Utilizando [S] >> Km determina-se V. V Substrato 1 Km indica a adequacidade relatia de substratos a uma enzima. Quando mais baixo o alor de Km maior a afinidade do substrato com a enzima. ½ V Substrato 2 Km 1 Km 2 [S]

Método gráfico para determinação das constantes cinéticas Em irtude da cura ersus [S] ser uma hipérbole é muito difícil determinar V com precisão e, portanto, a [S] que fornece ½ V ou o Km. Para facilitar a determinação das constantes cinéticas, os dados são lançados em gráfico utilizando um dos métodos gráficos disponíeis. Gráfico dos recíprocos de Lineweaer-Bur: 1 ersus 1 [ S] Rearranjo da equação de Michaelis-Menten numa forma linear y ax + b V [ S ] Km + [ S ] V [ S ] Km + [ S ] Inertendo: Km + [ S] V [ S] Multiplicando os dois termos: 1 Km + [ S ] V [ S ] Separando os termos: 1 Km V + V [ S] [ S]

Michaelis-Menten V V [ S ] Km + [ S ] ½ V Km [S] Lineweaer-Bur 1/ 1 Km V 1 1 + [ S] V tg Km/V 1/V Onde: a inclinação da reta b interseção da reta em y -1/Km 1/[S]

Questão de cinética enzimática Os seguintes dados foram obtidos para a reação enzimática de transformação de um substrato (S) em produto (P): [S] (M) 6,25 x 10-6 7,50 x 10-5 1,00 x 10-4 1,00 x 10-1,00 x 10-2 V (nmoles x litro -1 x min -1 ) 15,00 56,25 60,00 74,90 75,00 a) Calcule V e Km. b) Qual seria com [S] 2,5 x 10-5 M e com [S] 5,0 x 10-5 M? c) Qual seria a com [S] 5,0 x 10-5 M, se a concentração de enzima fosse o dobro? d) A dada na tabela a lado foi determinada pela medida da concentração de produto que se acumulou por um período de 10 minutos. Veja se representa uma elocidade inicial erdadeira.

Resposta da questão a) se torna insensíel a mudanças da [S] acima de 10 - M. Portanto, na faixa de [S] de 10 - a 10-2, dee ser próximo a V V 75 nmoles litro 1 min Para calcular Km escolha qualquer alor de e a correspondente [S] V [ ] S Km [ S] + 75 10 4 60 Km + 60 10 4 60 75 4 10 Km+ 10 4 15 10 4 Km 0,25 10 4 60 1 Km,5 10 2 5 M b) [ S] 2,5 10 5 M Km e 0,5 V 7,5 nmoles litro 1 min 1 5 10 5 5 ( 5) ( 75) [ S] 5,0 10 5 M 75 ( 2,5 10 5 ) + ( 5 10 5 ) 7,5 50 nmoles litro 1 min 1 7,5

c) V Km [ ] S + [ ] S e V [ E] t [ S ] Km + [ ] S [ ] E t é diretamente proporcional à concentração de enzima, para todas as concentrações de substrato. Portanto, dobrando-se [E] t para a [S] 5 x 10-5 M dobra 100 nmoles litro 1 min 1 d) Vamos utilizar os alores mais baixos de [S]. [ ] S 6,25 10 6 M e 15 nmoles litro 1 min 1 Em 10 min 150 nmoles litro 1 6,25 10 6 150 10 9M ( de S utilizado/litro) M ( de S originalmente presente/ litro) 0,150 10 6,25 10 6 6 0,024 ou 2,4% Foram utilizados 2,4% de Substrato