UNIVERSIDADE FEDERAL DO TRIÂNGULO MINEIRO

UNIVERSIDADE FEDERAL DO TRIÂNGULO MINEIRO GLÁUCIA APARECIDA DOMINGOS RESENDE REPRODUTIBILIDADE INTRA E INTEROBSERVACIONAL DOS DIAGNÓSTICOS MORFOLÓGICOS E CITOQUÍMICOS DAS LEUCEMIAS AGUDAS FRENTE À IMUNOFENOTIPAGEM UBERABA MG 2013

GLÁUCIA APARECIDA DOMINGOS RESENDE REPRODUTIBILIDADE INTRAO E INTEROBSERVACIONAL DOS DIAGNÓSTICOS MORFOLÓGICOS E CITOQUÍMICOS DAS LEUCEMIAS AGUDAS FRENTE À IMUNOFENOTIPAGEM Dissertação apresentada ao curso de pósgraduação em Ciências da Saúde-Patologia Humana da Universidade Federal do Triângulo Mineiro, como requisito parcial para obtenção de Título de Mestre em Ciências da Saúde- Patologia Humana. Orientador: Prof. Dr. Paulo Roberto Juliano Martins Co-orientador: Prof. Dr. Hélio Moraes de Souza UBERABA MG 2013 II

Catalogação na fonte: Biblioteca da Universidade Federal do Triângulo Mineiro Resende, Gláucia Aparecida Domingos 00000 Reprodutibilidade intra e interobservacional dos diagnósticos morfológicos e citoquímicos das Leucemias agudas frente á imunofenotipagem /Glaucia Aparecida Domingos Resende. 2013. 000 f. : tab. ; graf. ; fig. Tese (Mestrado em Ciências da saúde-patologia Humana) - Universidade Federal do Triângulo Mineiro, Uberaba, MG, 2013. Orientador: Prof. Dr. Paulo Roberto Juliano Martins 1. Leucemia. 2. Diagnóstico citológico. 3. Citoquímica. 4. Imunofenotipagem. I. Martins, Paulo Roberto Juliano. II. Universidade Federal do Triângulo Mineiro. III. Título. CDU 000.00-000.000.0 III

GÁUCIA APARECIDA DOMINGOS RESENDE REPRODUTIBILIDADE INTRA E INTEROBSERVACIONAL DOS DIAGNÓSTICOS MORFOLÓGICOS E CITOQUÍMICOS DAS LEUCEMIAS AGUDAS FRENTE À IMUNOFENOTIPAGEM BANCA EXAMINADORA Data da aprovação: Prof a Dr Miriane da Costa Gileno Prof. Dr Antonio Carlos Oliveira de Menezes Prof. Dr Paulo Roberto Juliano Martins IV

5 Dedicatória V

Aos meus pais, Vardelício Resende e Vera Lúcia Domingos Resende. Dedico este trabalho aos meus amados pais, com muito amor e gratidão, por tudo que fizeram por mim ao longo de minha vida, pelos ensinamentos, por estarem ao meu lado durante todos os momentos difíceis, quando não apenas me amparam, mas suportaram comigo todas as dores e venceram obstáculos. Eu tenho tanto pra lhe falar Mas com palavras não sei dizer Como é grande o meu amor por você E não ha nada pra comparar Para poder lhe explicar Como é grande o meu amor por você... (Roberto Carlos) VI

Ao meu irmão, Glauber Aparecido Domingos Resende. Dedico esta dissertação ao meu irmão, com muita gratidão pelo seu gesto de amor e total desprendimento. Hoje carrego comigo muito mais do que um pedacinho de você, um órgão, mas acima de tudo a sua demonstração de eterno amor. Obrigada, Te amo! VII

A minha irmã, Glaucimara Aparecida Domingos Resende. Dedico esta dissertação a minha irmã, pelo companheirismo, amor, incentivo e pela presença em todos os momentos que necessitei. Uma declaração de amor, eu quero te oferecer Duas palavras podem expressar... Te Amo! Tudo o que eu sinto por ti É um sentimento de Deus Talvez num gesto possa demonstrar... Se eu somasse as estrelas às águas do mar... (Cassiane) VIII

A minha sobrinha e cunhada, Larissa Domingos Resende e Luciney O S Resende. Dedico esta dissertação a minha sobrinha por trazer tantos momentos de alegria, pelo seu sorriso que acalma e aconchego nos momentos de angústia. A minha cunhada Luciney pelo apoio, incentivo e carinho. Obrigada. IX

Agradecimentos X

Agradecimentos Agradeço a Deus, que nos fortalece e ampara quando acreditamos não mais conseguir. Ao meu orientador, Dr Paulo Roberto Juliano Martins, pelo apoio, pela dedicação e pela presteza no auxílio às atividades e discussões, colocando a disposição todos os quesitos necessários para que este trabalho fosse concluído. Ao Dr Hélio Moraes de Souza, pela confiança em oferecer oportunidades que permitiram meu crescimento profissional. Ao Dr Leonardo, pela colaboração e pela em realizar as coletas de medula e ceder o material para que este trabalho fosse realizado, pelo auxílio em fotografar as lâminas e por acreditar que seria possível incentivando sempre. Ao funcionário Carlos Humberto Lima, que prontamente cedeu seu espaço, para que eu pudesse realizar os experimentos, me auxiliando e me dando suporte sempre que necessário, meu carinho e respeito. A Dr Rita Cleide Amorim Coelho do Hemorio, que prontamente nos forneceu protocolos e orientações, permitindo o aprimoramento de nossas técnicas. A Dr Silvia do Hemorio que propiciou o nosso contato com a Dr Rita. XI

Ao professor Gilberto de Araújo Pereira, pelas orientações e por ter realizado a análise dos resultados. Ao professor Sebastião Tostes pela colaboração e correções do artigo. As funcionárias Marise Carvalho Silveira e Maria Célia Bento de Freitas, que ao longo desta jornada tornaram-se grandes amigas e companheiras. As minhas queridas amigas Aline Meneses, Valéria Zeferino e Alexandra Leal, que ao longo desta jornada compartilharam sorrisos, lágrimas e angústias, fortalecendo nossos laços de amizade, tornandonos companheiras e parceiras. Obrigada por fazerem parte desta história. Ao meu cunhado Eber Alves dos Santos pelo carinho e incentivo. A amiga Fernanda, Bernadelli pela colaboração e pelas palavras de apoio e incentivo. Aos pós-graduandos do grupo de hematologia, Bruna Bereta, Ranata Volpe, Vitor, Márcia Ferreira, Aline Aparecida, Andreza, Milena e Ricardo Olivo por compartilharem seus conhecimentos. A toda equipe da Central de Quimioterapia, Denise Silva da Cunha, Ana Carolina Rodrigues da Silva, Guaraciaba Silva Pereira e Tatiana Penhalver, pela gentileza, prestatividade e pela forma carinhosa com que sempre fui recebida no setor. A Dr Polliana Valize e Laura Cardoso, pelo carinho, pela presteza e por contribuírem encaminhando amostras dos pacientes da oncohematologia pediátrica.

XII As doutoras Thais Camargo e Luzia Zago, pela colaboração. Ao Dr Marcel Mendes, por colaborar cedendo amostras e dados de seus pacientes, sempre com muita gentileza. Aos funcionários dos setores técnicos, administrativos, recepção, vigilância e limpeza do Hemocentro Regional de Uberaba, pela gentileza e pela colaboração sempre que se fez necessário. Aos hematologistas do serviço de hematologia e hemotrapia da Universidade Federal de Uberaba/Hemocentro Regional de Uberaba, pela colaboração. Agradeço ao fotógrafo Edmundo Alves por colaborar na edição das fotos. Enfim, Agradeço a todos aqueles que de alguma forma tenham contribuído para que este trabalho fosse concluído. XIII

Epigráfe O sucesso nasce do querer, da determinação e persistência em se chegar a um objetivo. Mesmo não atingindo o alvo, quem busca e vence obstáculos, no mínimo fará coisas admiráveis. José de Alencar XIV

SUMÁRIO LISTA DE FIGURAS LISTA DE TABELAS ABREVIATURAS E SÍMBOLOS 1 INTRODUÇÃO... 25 1.1 Leucemia Mieloide Aguda... 27 1.2 Leucemia Linfoide Aguda... 33 1.3 Leucemia Aguda Bifenotípica... 35 1.4 Diagnóstico... 36 1.4.1 Diagnóstico Morfológico e Citoquímica... 36 1.4.2 Imunofenotipagem... 41 2 OBJETIVOS... 46 2.1 Objetivos geral... 46 2.2 Objetivos específicos... 46 3 JUSTIFICATIVA... 48 4 MATERIAL E MÉTODO... 50 4.1 Apectos Éticos... 50 4.2 Critérios de inclusão... 50 4.3 Critérios de exclusão... 50 4.4 Amostra populacional... 50 4.5 Coleta das Amostras... 51 4.6 Materiais e Preparo dos Reagentes... 51 4.6.1 Mieloperoxidase... 52 4.6.2 Coloração de Sudan Black... 52 4.6.3 Reação de Ácido Periódico de Schiff (PAS)... 52 4.6.4 Alfa naftil acetato esterase... 53 4.7 Estudo do sangue periférico e medula óssea... 53 XV

4.7.1Estudo das Reações citoquímicas... 54 4.7.2Imunofenotipagem... 54 4.8 Dados clínico-epidemiológicos... 55 4.9 Análise dos Dados... 55 4.10 Normas utilizadas na confecção do manuscrito... 55 5.0 RESULTADOS... 57 5.1 Distribuições dos pacientes conforme gênero e idade... 57 5.2 Resultados dos achados clínicos... 57 5.3 Resultados por linhagem... 59 5.3.1 Concordância intraobservador A... 59 5.3.2 Concordância intraobservador B... 59 5.3.3 Avaliação interobservador... 60 5.3.4 Análise Descritiva intraobservador por subtipo baseada na classificação FAB... 61 5.3.4.1Resultado do observador A... 61 5.3.4.2Resultado do observador B... 62 6. Discussão... 65 6.1 Caracterização clico-epidemiológica... 65 6.2 Avaliação intraobservador e interobservador... 66 7 CONCLUSÃO... 72 REFERÊNCIAS... 74 ANEXOS... 81 XVI

LISTA DE FIGURAS FIGURA 1 LMA-M0... 28 FIGURA 2 LMA-M1... 28 FIGURA 3 LMA-M2... 29 FIGURA 4 LMA-M3... 30 FIGURA 5 LMA-M4... 30 FIGURA 6 LMA- M4-Eo... 30 FIGURA 7 LMA- M5... 31 FIGURA 8 - LMA- M6... 32 FIGURA 9 - LMA- M7... 32 FIGURA 10 - LLA-1... 34 FIGURA 11- LLA-2... 34 FIGURA 12 - LLA-3... 34 FIGURA 13 Leucemia Aguda Bifenotípica... 36 FIGURA 14 Coloração de mieloperoxidase... 38 FIGURA 15 Coloração de Sudan Black... 40 FIGURA 16 Coloração de PAS(padrão difuso)... 40 FIGURA 17 - Coloração de esterase... 40 FIGURA 18 - Acordo intraobservador A de seis categorias, usando a análise morfológica no primeiro tempo t 1.... 61 FIGURA 19 -Acordo intraobservador A de seis categorias, usando a análise morfológica no primeiro tempo t 2.... 62 FIGURA 20 - Acordo intraobservador A de seis categorias, usando a análise morfológica no primeiro tempo t 3 (morfologia e citoquímica)... 62 FIGURA 21- Acordo intraobservador B de seis categorias, usando a análise morfológica no primeiro tempo t 1... 62 XVII

FIGURA 22 -Acordo intraobservador B de seis categorias, usando a análise morfológica no primeiro tempo t 2... 63 FIGURA 23 - Acordo intraobservador B de seis categorias, usando a análise morfológica no primeiro tempo t 3 (Morfologia E Citoquímica)... 63 XVIII

LISTA DE TABELAS TABELA 1: Perfil citoquímico das leucemias agudas quanto a linhagem... 37 TABELA 2: Perfil imunofenotípico das leucemias mieloides agudas... 42 TABELA 3: Perfil imunofenotípico das leucemias linfoides agudas... 43 TABELA 4: Reagentes usados nas colorações citoquímicas... 51 TABELA 5: Perfil epidemiológico das leucemias agudas... 57 TABELA 6: Achados clínicos das leucemias agudas... 58 TABELA 7: Concordância intraobservador A dos casos de leucemias agudas selecionados no Serviço de Hematologia/UFTM de agosto de 2009 à fevereiro de 2013.59 TABELA 8: Concordância intraobservador B dos casos de leucemias agudas selecionados no Serviço de Hematologia/UFTM de agosto de 2009 à fevereiro de 2013... 60 TABELA 9: Concordância interbservador dos casos de leucemias agudas selecionados no Serviço de Hematologia/UFTM de agosto de 2009 à fevereiro de 2013... 60 XIX

LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS LMA: Leucemia mieloide aguda LLA: Leucemia linfoide aguda BAL: Leucemia aguda bifenotípica PAS: Ácido Periódico de Shiff SBB: Sudan Black M MPO: Mieoperoxidase FAB: Franco Americano Britânico WHO: World Health Organization Classification of Tumores LMA-M0: Leucemia mieloblástica minimamente diferenciada LMA-M1: Leucemia mieloblástica sem maturação LMA-M2: Leucemia mieloblástica com maturação LMA-M3: Leucemia promielocítica aguda LMA-M3v: Leucemia promielocítica aguda (variante microgranular) LMA-M4: Leucemia mielomonocítica LMA-M4 Eo: Leucemia mielomonocítica com eosinófilos anormais LMA- M5a: Leucemia monocítica aguda pouco diferenciada LMA-M5b: Leucemia monocítica diferenciada LMA-M6: Eritroleucemia aguda LMA-M7:Leucemia megacarioblástica aguda OMS: Organização Mundial de Saúde NSE: Esterase não específica A-EST: α-naftil Acetato Esteras PMTs: Fotomultiplicadores NL: Não linfoide L: Linfoide XX

RESUMO XXI

RESUMO Introdução e objetivo: As leucemias agudas são doenças clonais do tecido hematopóetico, caracterizadas pela proliferação de células imaturas na medula óssea. A adequada caracterização dos tipos linfoides e mieloide é de fundamental importância para um diagnóstico preciso. Embora apresentem limitações, a morfologia e as reações citoquímicas são úteis de baixo custo e contribuem para o diagnóstico diferencial entre as linhagens linfoide e mieloide, imprescindível para o planejamento terapêutico e prognóstico. O objetivo deste trabalho foi verificar a reprodutibilidade intra e interobservacional citológica e citoquímica frente à imunofenotípica no diagnóstico das leucemias agudas em um Hospital Universitário. Materiais e métodos: Foram analisadas amostras de 70 portadores de leucemias agudas, com idade entre 2 e 93 anos, usando critérios morfológicos, citoquímicos e imunofenotípicos atendidos no Serviço de Hematologia/Hemoterapia da Universidade Federal do Triângulo Mineiro, entre agosto de 2009 a fevereiro de 2013. A reprodutibilidade intra e interobservador foi realizada por dois hematologistas separadamente, sem conhecimento de informações clínicas. Foram realizadas análise morfológicas nos tempos t 1 e t 2 com intervalo de duas semanas e posteriormente uma terceira análise associada à citoquímica t 3. Os resultados foram confrontados com a imunofenotipagem. Para análise da reprodutibilidade intraobservador e interobservador das linhagens linfoide e não linfoide foi utilizado o teste de kappa e para os subtipos apenas a análise descritiva. Resultados: A concordância por linhagem (linfoide e não linfoide) intraobservador A foi de 94,37% no tempo t 1, 91,43% no t 2 e 88,57% t 3 quando foi incluído a citoquímica com kappa médio de 0,80 (variação de 0,77 a 0,88). A concordância intraobservador B foi de 90% e 81,43 nos tempos (t 1 e t 2 ) e 91,43% t 3 quando incluído a citoquímica, com kappa médio de 0,74 (variação 0,62 a 0,82). A reprodutibilidade interobservador A e B mostraram concordantes em 88,57 % e 81,43% nos tempos (t1 e t2) respectivamente com coeficiente de kappa de 0,70 e 0,62 respectivamente. Quando associado a citoquímica, a concordância foi de 87,14 % com coeficiente kappa de 0,82. XXII

Conclusão: A concordância substancial entre os achados morfológicos e citoquímicos frente à imunofenotipagem e a identificação de mais de 80% na diferenciação entre as linhagens linfoides e mieloide agudas, neste estudo evidenciaram a importância da morfologia e da citoquímica, se não para o diagnóstico definitivo, pelo menos, seguramente, como medida de triagem e orientação na escolha dos anticorpos a serem empregados na imunofenotipagem. Fica claro, portanto, que cada metodologia apresenta suas contribuições e limitações, entretanto acreditamos que estas reações podem ser utilizadas como métodos de primeira linha em conjunto com imunofenotipagem, citogenética e estudos moleculares, viabilizando o diagnóstico, a terapêutica e o prognóstico, consolidando a importância da morfologia e citoquímica de grande valia na diferenciação das leucemias agudas de linhagem linfoide e não linfoides. Palavras-chave: Leucemia; diagnóstico; morfologia; citoquímica; imunofenotipagem XXIII

INTRODUÇÃO XXIV

25 1. INTRODUÇÃO Velpeau em 1827 relatou o primeiro caso de leucemia em uma florista de 63 anos com quadro clínico de febre, de esplenomegalia e de hepatomegalia, que no sangue apresentava características diferentes, assemelhando-se em consistência e cor à levedura do vinho tinto (SCHUMACHER et al, 2002). Bennett em 1845 descreveu casos de pacientes que foram a óbito e apresentavam aumento do baço e sangue alterado. Virchow em 1856 criou o termo leucemia para descrever o aumento de glóbulos brancos em pacientes com estas síndromes. (SCHUMACHER et al, 2002). Ehrlich em 1877 desenvolveu uma coloração citológica que permitiu a distinção de glóbulos brancos normais e anormais. Ebstein em 1889 obeservou que as leucemias expressavam progressões diferenciadas com evoluções rapidamente fatais, denominando-as leucemias agudas. Naegel em 1900 confirmou a obsevação de Ehrlich, caracterizando o mieloblasto e dividindo a leucemia em mieloide e linfoide (SCHUMACHER et al, 2002). A leucemia é a uma neoplasia de células hematopoéticas da medula óssea que, na maioria dos casos, extravasam para o sangue periférico, podendo infiltrar o fígado, o baço, os linfonodos e outros órgãos, com predileção por tecidos mais vascularizados (HAMERSCHLAK, 2005; LORENZI, 2005; LIESNER et al, 1997). Geralmente estão associadas a fatores ambientais que atuam sobre indivíduos com maior suscetibilidade (CONKRITE et al, 1987). As radiações, a exposição ao benzeno, as substâncias tóxicas, as infecções principalmente virais, as condições sócio econômicas são consideradas fatores carcinogênicos. As alterações hereditárias e as influências do meio ambiente, podem também criar condições predisponentes para o desenvolvimento das leucemias (OLIVEIRA e NETO, 2004 a; LORENZI, 2005; SILVEIRA et al, 2008). A hematopoiese é controlada por genes estimuladores e inibidores em constante equilíbrio. Em determinadas situações pode haver a ruptura deste equilíbrio ocasionando duas rotas mutacionais que levam ao descontrole do crescimento das células hematopoiéticas: na primeira o gene está hiperativo e na segunda o gene supressor está inativo (VIDEIRA et al, 2002).

26 Os fatores carcinogênicos podem causar lesões nos cromossomos, como quebras, translocações, inversões ou perdas e muitas vezes alterações na sequência de aminoácidos, com perda do código genético normal. Consequentemente os genes apresentarão suas funções modificadas, promovendo crescimento celular anormal e dando origem às leucemias (OLIVEIRA e NETO, 2004 b; LORENZI, 2005). Elas são classificadas quanto ao tipo celular em mieloide e/ou linfoide e ao tempo de evolução em agudas e crônicas. Acometem crianças e adultos e são de progressões rápidas com predomínio de células imaturas, constituindo 20% ou mais da celularidade medular no diagnóstico, ocasionando anemia, neutropenia e trombocitopenia (SILVA et al, 2006; LORENZI, 2005). As leucemias agudas são classificadas em mieloides (LMA), linfoides (LLA) e bifenotípicas (BAL) (SILVA et al, 2006). A morfologia e citoquímica (Ácido Periódico de Shiff (PAS), Sudan Black (SBB), mieloperoxidase (MPO), esterase inespecífica e específica) do sangue periférico e medula óssea foram a base da classificação FAB (Franco Americano Britânico) em 1976, que reconheceu três tipos linfoides (L1,L2 e L3), e seis mieloides (M1 a M6) (BENNETTE et al, 1976, 1985, 1991; KRAUSE, 2000). Com o surgimento da imunofenotipagem, a classificação FAB foi revisada em 1985, incluindo os subtipos M0 e M7, até então não identificáveis (SILVA et al, 2006). Em 1986 e 1988 surgiu uma nova classificação denominada MIC (Morfologic, Immunologic e Cytogenetic), ressaltando as correlações morfológicas, imunológicas e citogenéticas, com grande valor clínico-prognóstico. (VAN DEN BERGHE, 1988; CATOVISK et al, 1991). Posteriormente, buscando maior uniformidade no diagnóstico e classificação, a WHO (World Health Organization Classification of Tumores) publicou em 2001 uma nova classificação (JAFFE et al 2001) que baseava em critérios morfológicos e na fundamentação biológica, incluindo a genética molecular, em especial informações clínicas (PAES et al,2002).

27 1.1 Leucemia Mieloide Aguda A leucemia mieloide aguda (LMA) é uma doença clonal do tecido hematopoiético que se caracteriza pela proliferação anormal de células progenitoras de linhagem mieloide (LOWENBERG et al, 1999; LIESNER et al, 1997). As manifestações clínicas decorrem da proliferação neoplásica de blastos na medula óssea, ocasionando anemia, neutropenia e trombocitopenia (SILVA et al, 2006). A maioria dos pacientes mostram-se sintomáticos ao diagnóstico. Em geral apresentam anemia normocítica normocrômica, as plaquetas e hemoglobina geralmente são baixas e a contagem de leucócitos pode variar de < 1000/µl á 200.000/µl (SILVA et al, 2006). Ocorrem na infância, na adolescência, nos adultos e nos idosos. Sua incidência varia de 1/150.000 na adolescência, 1/100.000 entre 30 e 40 anos e aos 70 chega a 1/10.000 (HAMERSCHLAK, 2005; LOWENBERG, 1999). O processo neoplásico pode ocorrer nas linhagens: eritrocítica, granulocítica, monocítica e megacariocítica. Nesta leucemia o bloqueio maturativo das células se dá em diferentes etapas, permitindo a classificação em subtipos (LIESNER et al, 1997; HAMERSCHLAK, 2005; OLIVEIRA e NETO, 2004 b). Estas leucemias são classificadas em 8 subtipos, cada qual com características peculiares, conforme grau de maturação. A seguir são descritos os diferentes tipos de leucemias mieloides agudas: LMA-M0 - Leucemia indiferenciada - blastos indiferenciados, cromatina frouxa e nucléolo evidente, citoplasma agranular, sem bastonete de Auer; sua morfologia é similar aos blastos linfoides L2. Citoquímica e marcadores imunológicos linfoides são negativos. O estudo imunofenotípico é positivo para CD13, CD33 e/ou CD11b. A mieloperoxidase (MPO) por método imunológico e quimioluminescência é positiva (BENNETT et al, 1976, BENNETT et al, 1981; OLIVEIRA e NETO, 2004b; OLIVEIRA e NETO, 2004c; KRAUSE, 2000; SILVA et al, 2008).

28 Figura 1: Distensão de medula óssea, Leucemia Mieloide Aguda -M0. Fonte: VIVAS, 2008. LMA-M1- Leucemia minimamente diferenciada - Os blastos são pouco diferenciados, cromatina frouxa e nucléolos proeminentes, os bastonetes de Auer são frequentes; menos de 10% amadurecem até ou além da fase de promielócitos; a mieloperoxidase e Sudan Black B são positivos em mais de 3% dos blastos. Apresentam positividade para HLA-DR, CD13, CD33, CD34 (BENNETT et al, 1976; BENNETT et al, 1981; KRAUSE, 2000; ABDUL-HAMIDE, SILVA et al, 2008). Figura 2: Distensão de medula óssea, Leucemia Mieloide Aguda M1 Fonte: Pathology outline.com.br LMA-M2 - Os blastos são de tamanhos variados, cromatina frouxa, relação núcleo citoplasma variada com grande quantidade de grânulos azurófilos, os bastonetes

29 de Auer são frequentes; a diferenciação pode ir até promielócitos; existem até 20% de células monocitoides; amieloperoxidase e o Sudan Black são fortemente positivos; a reação de cloroacetatoesterase é positiva. Os marcadores HLA-DR, CD13, CD33 e CD34 são positivos, o CD15 é positivo ou negativo (BENNETT et al, 1976; BENNETT et al, 1981; KRAUSE, 2000; OLIVEIRA e NETO 2004c; SILVA et al, 2006). Figura 3: Distensão de medula óssea, Leucemia Mieloide Aguda M2. Fonte: o próprio autor LMA-M3 - Leucemia Aguda Promielocítica - Os blastos apresentam núcleo excêntrico, reniforme ou bilobulado, citoplasma basofílico com intensa granulação e numerosos bastonetes de Auer. Na variante hipogranular, o núcleo é volumoso e o citoplasma possui uma granulação escassa; este subtipo é confirmado quando mais de 50% das células blásticas são hipogranulares. As reações de mieloperoxidase e Sudan Black B são fortemente positivas; a relação FSC/SSC no estudo imunofenotípico é alta; os CD13 e CD33 são positivos (BENNETT et al, 1976; BENNETT et al, 1981; KRAUSE, 2000; SILVA et al, 2006, LORENZI, 2005; BASI e REGO, 2012).

30 Figura 4: Distensão de medula óssea, Leucemia Mieloide Aguda M3. Fonte: o próprio autor LMA-M4 - Leucemia mielomonocítica - Os componentes granulocíticos e monocíticos estão presentes e pelo menos 20% dos blastos são precursores de monócitos que predominam no sangue periférico e os bastonetes de Auer podem estar presentes. A variante M4 Eo (eosinofílica) apresenta proliferação de eosinófilos em vários estágios de maturação, constituindo 5 a 30% das células medulares; a reações de mieloperoxidase e Sudan Black são positivas para a linhagem granulocítica, a esterase é positiva para os componentes butirato e cloroacetato. Os CD13, CD33, CD14, CD15 e CD11b geralmente são positivos e também pode ocorrer expressão anômala do antígeno linfoide CD2 (BENNETT et al, 1976; BENNETT et al, 1981; KRAUSE, 2000; MARTINS e FALCÃO, 2000). Figura 5: Distensão de medula óssea, Figura 6: Distensão de medula óssea,. Leucemia Mieloide Aguda M4 Leucemia Mieloide Aguda M4 - Eo Fonte: o próprio autor Fonte:VIVAS, 2008

31 LMA-M5-Leucemia monocítica - as células leucêmicas são predominantemente monoblastos (M5a) ou promonócitos (M5b); na M5a as células são grandes, o citoplasma é intensamente basofílico com finos grânulos azurófilos; o núcleo é redondo, com cromatina frouxa e nucléolos proeminentes; na M5b o núcleo é convoluto e irregular; o citoplasma é menos basofílico, podendo apresentar grânulos e vacúolos; A reação de esterase dupla somente é positiva para o componente butirato inibida pelo fluoreto. Os CD33, CD14 e CD15 são positivos, podendo ocorrer a expressão fraca de CD4 (BENNETT et al, 1976; KRAUSE, 2000; OLIVEIRA e NETO, 2004a; SILVA et al, 2006). Figura 7: Distensão de medula óssea, Leucemia Mieloide Aguda M5. Fonte: www.pathologyoutlines.com LMA-M6 Leucemia eritrocítica - Caracteriza-se por mais de 50% de eritroblastos com características morfológicas bizarras, de tamanhos grandes, multilobular ou multinucleados e mais de 30 % de mieloblastos tipo I (agranular) e tipo II (grânulos azurófilos). Outras características são: fragmentação, corpos de Howell Jolly, sideroblastos em anel, alterações megalobláticas e deseritropoese são comuns (PARK et al, 2002; ABDUL-HAMID,2011). As reações citoquímicas são as usuais para LMA e os mieloblastos podem apresentar bastonetes de Auer. O PAS pode ser difusamente positivo ou positivo em bloco. O CD13, CD33, glicoforina A, CD34,

32 CD117 e HLA-DR são positivos (LUSIS, 2000; KRAUSE, 2000; PARK et al 2002; SILVA et al, 2006). Figura 8: Distensão de medula óssea, Leucemia Mieloide aguda - M6. Fonte: o próprio autor LMA-M7 - Leucemia megacariocítica - Morfologia variada desde blastos L1 até muito grandes, indiferenciados, com citoplasma abundante e projeções citoplasmáticas. As reações citoquímicas são geralmente negativas e os antígenos CD41 e CD42 são frequentemente positivos; (BENNETT et al, 1976; BENNETT et al, 1981; KRAUSE, 2000; MARTINS e FALCÃO, 2000; SILVA et al, 2006; FARIAS e BIERMANN, 2007). Figura 9: Distensão de medula óssea, Leucemia Mieloide Aguda - M7. Fonte: o próprio autor

33 1.2 Leucemias Linfoide Aguda É uma proliferação das células linfoides indiferenciadas na medula óssea, timo e tecidos linfoides, com predomínio da linhagem B em 85% dos casos (BÉNÉ et al, 1995; FARIAS e CASTRO, 2004). Aproximadamente 70% destas leucemias ocorrem na infância, entre dois a quatro anos, diminuindo na adolescência, nos adultos jovens e aumentando a partir dos 40 anos, predominante no sexo masculino de cor branca (EMERECIANO et al, 2004; OLIVEIRA et al, 2004). O diagnóstico e classificação são realizados de acordo com as características citológicas, citoquímicas, fenotípicas e cariotípicas (EMERECIANO et al, 2004; FARIAS e CASTRO, 2004). O hemograma geralmente revela anemia, neutropenia e trombocitopenia. A contagem de leucócitos encontra-se habitualmente elevada com nítido predomíneo de blastos. A medula óssea apresenta-se com infiltração maciça de linfoblastos e intensa hipoplasia eritrocítica, granulocítica e megacariocítica (FARIAS e CASTRO, 2004) O grupo FAB distinguiu os subtipos de LLA em L1, L2, L3 (Figuras 10, 11, 12). A identificação da L3 tem maior importância devido ao seu pior prognóstico (LOFFLER et al, 1994). Na L1 predominam blastos pequenos, homogêneos, cromatina condensada, nucléolo visível ou pouco evidente, citoplasma moderadamente basofílico e raros vacúolos (Figura 10). Na L2 os blastos são maiores e heterogêneos, o núcleo é irregular com um ou mais nucléolos grandes e proeminentes, a relação núcleo-citoplasma é variável, podendo apresentar clivagem, dobras ou indentações, cromatina variável e o citoplasma é abundante e basofílico (Figura 11). O subtipo L3 predominam células grandes, núcleo regular, nucléolos proeminentes e cromatina nuclear fina, o citoplasma é abundante, vacuolizado e com intensa basofilia (Figura 12) (BENNETT et al,1976, 1981; ARROYO, et al, 1983, FARIAS e BIERMANN, 2007).

34 Figura 10: Distensão de medula, Linfoide Aguda L1. Leucemia Figura 11: Distensão de medula, Linfoide Aguda L2. Leucemia Fonte: o próprio autor Fonte: o próprio autor Figura 12: Distensão de medula, Aguda L3. Leucemia Linfoide Fonte:www.pathologyoutline.com.br Os linfoblastos geralmente apresentam reação citoquímica de PAS fortemente positiva, com evidente coloração granular em forma de anéis concêntricos, unipolar ou em blocos. Esta reação é mais frequentemente negativa em LLA -T do que na LLA -B (OLIVEIRA et al, 2004; FARIAS e CASTRO, 2004). Quanto à imunofenotipagem, 80% dos casos expressam marcadores de células B e 15% a 20% T.

35 O tipo B é classificado em: pró-b, pré-b e B maduro. Na LLA pró-b, as células expressam HLA-DR Terminal Desoxinucleotidil Transferase (TdT), CD34, CD19 e CD22. A LLA do tipo comum (Calla) expressa CD10, CD22, CD19, e/ou CD20 (OLIVEIRA et al, 2004; LORENZI, 2005). A pré-b expressa cadeia μ citoplasmática, CD19, CD20, e CD10 positivos.. O tipo B-maduro apresenta CD19, CD20, CD22 e CD24 intensamente positivos, expressão de cadeias leves de imunoglobulina na superfície da membrana (SmIg), que confirma o diagnóstico e o pior prognóstico (BENNETT et al, 1976, 1981; OLIVEIRA et al, 2004; FARIAS e CASTRO, 2004; FARIAS e BIERMANN, 2007). As LLAs T são classificadas em: pré-t, T - intermediária e T - maduro. Na pré-t expressam CD 3 no citoplasma, CD 7, CD 2, CD 5 e TdT. O tipo T intermediário é fortemente positivo para CD3c, CD2, CD1a, podendo co expressar CD4 e CD8. A LLA T maduro expressa CD2, CD5, CD7, CD3 e duplamente positiva para CD4 e CD8 (FARIAS e CASTRO, 2004). 1.3 Leucemia Aguda Bifenotípica/Híbrida Representa aproximadamente 7% das leucemias agudas, podendo ser de novo ou secundária a terapias citotóxicas (BATINIC et al, 2008). A clínica não difere das demais leucemias agudas, acomete em indivíduos nas diferentes faixas etárias, com maior incidência em adultos (BATINIC et al, 2008; KILLICK et al, 1999). Caracteriza-se por dupla população ou a co-expressão de marcadores linfoides e mieloides simultaneamente. A morfologia não fornece dados consistentes, podendo apresentar características tipicamente mieloide, como grânulos azurófilos e bastonetes de Auer sendo comum os subtipos M1 e M5, concomitante a linfoblatos indiferenciados (KILLIKC et al, 1999, KILLICK et al, 2002; BATINIC et al, 2008; ZHAO et al, 2010). O diagnóstico definitivo é possível somente através de estudos imunofenotípicos, citogenéticos e moleculares. (KILLIKC et al, 1999). O PAS é negativo para a linhagem linfoide aguda com marcador mieloide. A mieloperoxidase é negativa ou positiva em menos de três por cento dos blastos, onde poucos destes apresentam Sudam Black positivo para leucemia linfoide com marcador mieloide (ORNELLAS, 2002; SOUZA, 2006; YAMAMOTO, 2000c).

36 A partir de 2008, a OMS definiu uma nova classificação para leucemias bifenotípicas, categorizando-as como "leucemias de linhagem ambígua (BENÉ et al, 2012; WEIER et al, 2007; BATINIC et al, 2008; NAGHASHPOUR et al, 2010). Os principais marcadores da OMS 2008 são a mieloperoxidase, CD19 e CD3, sendo necessário um amplo painel para confirmação da co expressão de marcadores específicos de linhagem ambígua ou dupla população (KILLIKC et al, 1999, KILLICK et al, 2002; BATINIC et al, 2008; BENÉ et al, 2012)). O estudo citogenético e molecular definem a leucemia ambígua pela presença da t(9;22) envolvendo o gene BCR-ABL e alterações no gene MLL (NAGHASHPOUR et al 2010; BENÉ et al, 1995; BENÉ et al, 2012; ZHAO et al 2010). Figura 13: Distensão de medula, Leucemia Aguda Bifenotípica Fonte: o próprio autor 1.4 Diagnóstico 1.4.1 Morfologia e Citoquímica A Citologia, denominada na atualidade de Biologia Celular é um dos ramos das ciências naturais. Sua história está intimamente relacionada com o desenvolvimento das lentes ópticas e à combinação destas para construir o microscópio composto (do grego mikros, pequeno; skopein, ato de ver, examinar).

37 Atanásio Kircher em (1601-1680) foi o primeiro a usar a palavra microscopium. Muitos denotam a descoberta do microscópio a Galileu, mas a história relata que foi Antonie van Leeuwenhoenk em 1632 que aperfeiçoou o instrumento observando as primeiras células animais que são: os glóbulos vermelhos do sangue e constatando também a existência dos espermatozóides (BEHE, 1996). Robert Hooke, em 1665 fez a observação da primeira célula, descreveu o microscópio e a descoberta sobre a circulação nos peixes. Schwann e Matthias Jakob Schleiden em 1839 propuseram que todos os seres vivos eram formados de células e estas eram os blocos básicos construtores da vida. Rudolf Virchow, dando continuidade aos trabalhos de Schwann e Matthias, postulou que todas as células eram geradas por células pré-existentes. A teoria celular clássica foi aceita em 1858(BEHE, 1996). Anteriormente ao que havia sido proposto por Schwann, Schleiden e Virchow, a teoria celular moderna postulou que além de serem unidades estruturais, as células eram também unidades de reprodução, hereditariedade e função. Todas possuem a mesma composição química (BEHE, 1996). Em 1891, Ehrlich descreveu técnicas de coloração das células no sangue periférico, com intuito de classificar as leucemias. Posteriormente foram desenvolvidas técnicas de coloração baseadas na composição química destas células, propiciando a distinção de diferentes linhagens (PAS, Sudan Black, peroxidase, fosfatase ácida e esterases (HONRUBIA, 2001). ( Ver Tabela 1). Nos anos 20 foram utilizadas em amostras da medula óssea, nascendo a citoquímica, permitindo que suas composições químicas celulares específicas fossem evidenciadas sem alterar suas características morfológicas ( HONRUBIA, 2001). Tabela 1: Perfil citoquímico das leucemias agudas quanto à linhagem COLORAÇÕES LMA LLA PAS - + Peroxidase + - Sudan Black + - Fosfatase ácida - + Alfa-naftil-esterase - ou + (CD34) - Fonte: Adaptado de Teixeira. (2004).

38 As citoquímicas que representam importância no diagnóstico das leucemias agudas são: mieloperoxidase (MPO), Sudan Black (SBB), reação de Ácido Periódico de Schif (PAS), esterases não específicas (NSE) (α natal acetato esterase, α- naftil butirato esterase) e específica α-naftil AS-D cloroacetato esterase. A mieloperoxidase é específica da linhagem mieloide, localiza-se em grânulos azurófilos primários de neutrófilos e monócitos (BELL et al, 1981; SCOTT et al 1993). As células granulocíticas expressam positividade crescente conforme maturação, enquanto as monocíticas expressam granulações menos intensas, apresentando grânulos finos, dispersos por toda célula. Pode também ser positiva em grânulos específicos de eosinófilos e basófilos (NAUSEEF et al, 1988; MATSUO et al, 2003). Os blastos da linhagem mieloide demonstram atividade em áreas como retículo endoplasmático e região de Golgi (BELL et al, 1981). A MPO promove a clivagem do peróxido de hidrogênio liberando oxigênio, que reage com a benzidina, formando um composto de cor castanho esverdeado (Figura 14) (BELL et al, 1981). Esta reação é útil na diferenciação entre leucemias mieloide e linfoide aguda que frequentemente acompanha o Sudan. BELL et al, 1981 (NAUSEEF et al, 1988) OLIVEIRA e NETO, 2004 a; OLIVEIRA e NETO, 2004 c). Figura 14: Distensão de medula óssea, reação de mieloperoxidase Fonte: o próprio autor

39 O Sudan Black (Figura 15) cora lipídios, gorduras neutras, fosfolipídios e ésteres. É específico para células mieloides, geralmente acompanha a MPO. (KLOBUSICKÁ, 1994; SCHUMACHER et al 2002). A partir dos promielócitos a coloração é fortemente positiva, aumentando com a maturação (OLIVEIRA e NETO, 2004 a; OLIVEIRA e NETO, 2004 c). Figura 15: Distensão de medula óssea, reação de sudan black B Fonte: o próprio autor O PAS (Figura 16) é importante na citoquímica de carboidratos, o ácido periódico oxida compostos com grupos hidroxilas livres vicinais que combinam com o reativo de Schiff obtendo a coloração rósea. Os mieloblastos possuem pouco glicogênio, aumentando seu teor a partir do promielócito e consequentemente sua positividade, evidenciando um padrão difuso em todo o citoplasma. Esta reação é intensamente positiva de 40 70% das LLAs, com formação de anéis, unipolar ou blocos (PEREZ CHACÓN et al, 1998; ; SCHUMACHER et al, 2002; OLIVEIRA e NETO, 2004 a; OLIVEIRA e NETO, 2004c).

40 Figura 16: Distensão de medula óssea, reação de PAS positiva (granular) Fonte: o próprio autor As esterases (Figura 17) são enzimas que hidrolisam ligações éster de álcoois, fenóis e naftóis. As reações positivas podem ser encontradas na linhagem granulocítica, nos promonócitos e nos monócitos maduros. As esterases não específicas são usadas para identificar células de origem monocitica, sendo inibida pelo fluoreto de sódio (LI et al, 1973; UPHOFF et al, 2000). A reação é fortemente positiva nos monócitos, negativa em monoblastos e fracamente positiva ou negativa nos granulócitos (UPHOFF et al, 2000; OLIVEIRA e NETO, 2004 a; OLIVEIRA e NETO, 2004 b). Figura 18: Distensão de medula óssea, reação de Esterase positiva Fonte: www.pathologyoutline.com.br

41 1.4.2 Imunofenotipagem Moldavan em 1934 desenvolveu o primeiro contador automático com um capilar sob um microscópio dotado de um detector fotoelétrico de células. Crosland e Taylor em 1953 desenvolveram uma câmara de fluxo que permitia a passagem das células no centro da mesma, caracterizando importante avanço para o desenvolvimento da citometria de fluxo (BERTHO, 2004). Katmentsky em 1965 aprimorou a citometria de fluxo, fazendo o uso de espectrofotometria (luz absorvida) na quantificação de DNA e o uso da medida multiparamétrica de luz dispersada (BERTHO, 2004). Os citômetros foram descritos por Van Dila em 1967-69, usando a câmara descrita por Crosland e Taylor. Desde então várias técnicas foram desenvolvidas no aprimoramento da citometria de fluxo (MARTINS e FALCÃO, 2000; BERTHO, 2004; OLIVEIRA R. A. G, 2004). Os citômetros consistem no emprego de radiação a laser, do fluxo hidrodinâmico, da ótica, das substâncias fluorescentes e dos recursos de informática que permitem determinação das características estruturais e funcionais das células (MARTINS e FALCÃO, 2000; BERTHO, 2004). O princípio baseia-se na aspiração de células ou partículas de uma suspensão que passam por uma câmara especial (flow cell) e ficam centralizadas num fluxo contínuo de líquido (sheath fluid), saindo continuamente uma atrás da outra, onde uma única célula seja interceptada pelo laser ocorrendo dois tipos de fenômenos físicos que registram informações específicas das células (BERTHO, 2004). Ao ser interceptada pelo laser, uma parte da luz é espalhada (scatter) de acordo com as características morfológicas e estruturais das células. O forwad sacatter (FS) se relaciona com o tamanho e o side sacatter (SS) com a granularidade da célula ou partícula (MARTINS e FALCÃO, 2000; BERTHO, 2004; OLIVEIRA et al, 2004). Em um segundo momento as células coradas com fluorocromos, excitadas pelo laser, emitem luz compatíveis com seus aspectos bioquímicos, biofísicos e moleculares (MARTINS e FALCÃO, 2000; BERTHO,2004). A luz dispersa capitada por lentes é enviada para os tubos fotomultiplicadores (PMTs), convertendo o sinal luminoso em pulsos elétricos proporcionais à quantidade

42 de luz dispersada ou fluorescente, estes sinais posteriormente são selecionados por filtros óticos, passando somente a luz de comprimento de onda desejado (MARTINS e FALCÃO, 2000; BERTHO, 2004). Os sinais elétricos são amplificados e convertidos em sinais digitais enviados a um computador, onde através de softwares específicos é realizada a análise de seis parâmetros específicos como: tamanho celular (FS); granularidade interna das células; fluorescência verde (FL 1 ); fluorescência amarela (FL 2 ); fluorescência laranja (FL 3 ); fluorescência vermelha (FL 4 ); fluorescência roxa (FL 5 ) (BERTHO, 2004). As informações são armazenadas em formas de histogramas monoparamétricas (256 ou 1024 canais), biparamétricos (64X64) ou em List mode Na hematologia a citometria de fluxo é realizada com o objetivo voltado para a contagem celular, para a forma leucocitária, para a análise da medula óssea (BERTHO, 2004; OLIVEIRA et al, 2004), para as alterações de sínteses de linfócitos T e B, CD4 + e CD8 +, na seleção de doadores para transplante, para o monitoramento de transplantados e imprescindível para a classificação das leucemias (Tabelas 3 e 4) através de marcadores de superfícies específicos (BERTHO, 2004). Tabela 2: Perfil imunofenotípico das Leucemias Mieloides Agudas Marcadores LMA-M0/M1/M2 LMA-M3 LMA-M4/ M5a/M5b LMA-M6 LMA-M7 CD13/CD33 ++ ++ ++ + ++ CD65 ±/+/++ + ++ ± ± MPO -/+/++ ++ ++ + - CD11c - ou ± - ++ - - CD14 - - +/+/++ - - CD15 ±/±/++ ± - - - CD36 - - + ++ + Glicoforina A - - - + - CD41/CD61 - - - - ++ CD42 - - - - + CD34 ++/++/+ ±/+/± ±/+/± + ++

43 Marcadores LMA-M0/M1/M2 LMA-M3 LMA-M4/ M5a/M5b LMA-M6 LMA-M7 CD117 ++ + + + - HLA-DR ++/++/+ ++ ++ + ++ TdT + + + + ± -: <10% das leucemias são positivas; ±: 10% - 25% das leucemias são positivas; +: 25-75% das leucemias são positivas; ++: >75% das leucemias são positivas. Fonte: Silva et al (2006). Tabela 3: Perfil imunofenotípico das Leucemias Mieloides Agudas Linhagem B Linhagem T Marcador Pró-B Comum Pré-B B Pré-T Intermediário T HLA-DR + + + + +/- - - TdT + + + +/- + + + CD19 + + + + - - - CD22(c) -/+ + + + - - - CD10 - + + -/+ -/+ -/+ +/- CD20 - -/+ + + - - - Cµ - - + - - - - SmIg - - - + - - - CD7 - - - - + + + CD2 - - - - - + + CD3(c) - - - - +/- + + CD1a - - - - - +/- - CD3 - - - - - - + CD4/CD8 - - - - - +/- + TdT= Terminal desoxinucleotidil transferase; CD2(c)= CD22 intracitoplasmático; Cµ= cadeia µ citoplasmática; SmIg= imunoglobulina de superfície; +: expressão do antígeno; +/-: expressão variável, freqüentemente positiva; -: ausência de expressão do antígeno; -/+: expressão variável, freqüentemente negativa. Farias et AL (6). Fonte: Silva et al (2006). A imunofenotipagem é atualmente indispensável para o diagnóstico específico dos diferentes subtipos de LMA, principalmente as M0, M7 e bifenotípicas (LUSIS, 2000; YAMAMOTO, 2000). Nesta diferenciação de LMA os marcadores CD13 e CD33 são de grande importância, principalmente nas leucemias indiferenciadas, o CD41, CD42 e CD61 são marcadores megacariocíticos, o CD14 é específico para linhagem monocítica e o CD15 é expresso na maioria das leucemias M2 e M4 (BENÉ, 1999). A M3 pode co-expressar os antígenos CD9 e CD68. A pesquisa de mieloperoxidase associada aos CD13/CD33 (mieloide), ao CD79 e/ou CD19 (células B), e ao CD3 com CD7 (células T) podem identificar até 98% das leucemias agudas (SILVEIRA et al, 1998; REGO et al, 2009).

44 A imunofenotipagem é importante não apenas no diagnóstico, mas também para o prognóstico, pois permite a identificação de leucemias de pior prognóstico como as indiferenciadas e bifenotípicas (DREXLER et al, 1988; BENÉ et al, 1999; REGO et al 2009).

OBJETIVO 45

46 2. OBJETIVOS 2.1 Objetivos Gerais Verificar a reprodutibilidade intra e interobservacional citológica e citoquímica frente à imunofenotipagem para diagnóstico das leucemias agudas. Realizar a análise da reprodutibilidade intra e interobservacional citológica, citoquímica e imunofenotípica para diagnóstico das leucemias agudas. 2.2 Objetivos Específicos 1. Descrever o perfil clínico epidemiológico e laboratorial dos pacientes com leucemia aguda diagnosticada no Hospital de Clínicas da UFTM. 2. Verificar o perfil de concordância intraobservacional das análises citológicas (com intervalo de 2 semanas: (Morfologia t 1 e Morfologia t 2 ) e morfologia/citoquímicas t 3 com a imunofenotipagem considerando a linhagem; 3. Comparar o grau de concordância citológica, citoquímica entre observadores A e B 4. Descrever o perfil dos subtipos segundo as análises citológicas (com intervalo de 2 semanas: Morfologia t 1 e Morfologia t 2 ), e morfologia/citoquímicas t 3 e imunofenotipagem,

JUSTIFICATIVA 47

48 3. JUSTIFICATIVA O diagnóstico das doenças hematológicas tem evoluído de forma a trazer grandes avanços na elucidação das leucemias agudas. A inclusão dos estudos imunológicos, citogenéticos e moleculares tem se tornado cada vez mais acessível, no entanto a morfologia e citoquímica, bases estas que direcionam para estes novos recursos, tem sido subestimadas ou mesmo vistas de forma pouco peculiar. Assim, acreditamos que a morfologia e a citoquímica ainda são métodos úteis, de baixo custo e que podem contribuir substancialmente na diferenciação entre as linhagens linfoide e mieloide, importantes para o diagnóstico, terapêutica e para o prognóstico destas doenças.

MATERIAIS E MÉTODOS 49

50 4. MATERIAL E MÉTODOS Foi realizado um estudo retrospectivo, prospectivo e observacional de 70 casos de leucemias agudas atendidos no Serviço de Hematologia/Hemoterapia da Universidade Federal do Triângulo Mineiro/UFTM. As análises citológicas e citoquímicas foram realizadas por dois hematologistas em tempos distintos. 4.1 Aspectos éticos O projeto de pesquisa foi aprovado pelo Comitê de Ética e Pesquisa (CEP) da UFTM, conforme parecer aprovado em reunião do dia 27 de agosto de 2010, protocolo 1696. (Anexo II) e os casos retrospectivos aprovados pelo comitê de ética do Centro Universitário de Araraquara, parecer 916/09 (AnexoIII). 4.2 Critérios de inclusão Todos os casos de leucemia aguda de novo, independente do tipo morfológico, gênero, idade e cor dos pacientes. Todos os participantes foram submetidos ao termo de consentimento livre e esclarecido. 4.3 Critérios de exclusão Os pacientes submetidos ao tratamento quimioterápico, com leucemia aguda secundária e em recaída. 4.4 Amostra populacional A amostra foi constituída de 70 pacientes de ambos os sexos com idade entre 0 a 99 anos, atendidos no Serviço de Hematologia da UFTM/Hemocentro Regional de Uberaba, sendo que destes, 19 eram casos retrospectivos.

51 4.5 Coleta das Amostras As amostras de sangue periférico foram coletadas em tubo vacutainer através da punção venosa, por técnicos do laboratório, sendo realizados os esfregaços secos ao ar e encaminhados para o setor técnico com a finalidade da realização das colorações de leishaman e citoquímica. As amostras de medula óssea foram coletadas por médicos hematologistas do serviço de hematologia da UFTM. O procedimento da coleta foi realizado com o paciente deitado ou sentado. A antissepsia foi realizada com álcool 70% no local escolhido para coleta, sendo porção superior do esterno, ou crista ilíaca superior posterior e ou face externa do terço superior da tíbia em crianças. Foi aplicado o anestésico (lidocaína 2%) no local da coleta. A agulha para a coleta do mielograma foi introduzida na pele até a perfuração do periósteo chegando à cavidade medular (menor consistência ao tato), quando atingido este local foi colocado uma seringa na parte posterior da agulha e foram aspirados de 0,5 a 1 ml do material para realização do mielograma. Após o procedimento foi realizado curativo compressivo e confecção dos esfregaços que foram secos ao ar imediatamente e encaminhados ao setor técnico, sendo realizadas as colorações de citoquímicas e Leishman. Todo o procedimento de coleta foi realizado com material descartável e esterilizado. Foi coletado ainda de 2 a 5 ml para imunofenotipagem com/edta, encaminhados para o laboratório de apoio da UFTM. 4.6. Materiais e Preparo dos Reagentes Tabela 4: Reagentes usados nas colorações citoquímicas Coloração Reagente Peroxidase Reagentes Kit Coloração Coloração de Leishman Sudan Fixador Vapor de formol 40% a 37º C Regente Solução estoque: Sudan Black B e metanol Contra colaração Safranina

52 Coloração Reagente PAS Fixador Solução formol:metanol (1:9) Reagentes Ácido períodico 1% Reatio de Shiff: Fuccina básica Contra coloração Leishman e água destilada (1:9) Esterase Reagente kit Alfa - Naphthyl Acetate (Non Specific Esterase) Sigma Aldrich Fonte: o próprio autor 4.6.1 Miloperoxidase (MPO) A mieloperoxidase foi realizada com o uso do kit DAB Líquido (DBS Cód. K047). O esfregaço foi fixado em álcool 70% por 10 minutos, seco ao ar e em seguida coberto com o reagente de DAB diluído 1:1(DAB+ Tampão) por 7 minutos, depois foi lavado em água deionizada, secado e contra corado com corante de leishman (a contra coloração foi realizada cobrindo o esfregaço com 20 gotas do corante por 4 minutos, foi acrescentada 20 gotas de água destilada e corada por 14 minutos), escorrido o corante, foi lavado em água corrente e secado em posição vertical. (Diagnostic Biosotems, Barcelona, 2009). 4.6.2 Coloração de Sudan Black (SBB) A técnica de Sudan Black B foi realizada pela técnica de Sheehan-Storey modificada, o esfregaço foi fixado em vapor de formol por 10 minutos e após evaporado foi incubado em solução de sudan previamente filtrada por uma hora, lavado em água corrente, secado ao ar e contracorado com safranina por 30 segundos. 4.6.3 Reação de Ácido Periódico de Schiff (PAS) A técnica foi realizada fixando o esfregaço por imersão em solução de etanolformaldeído (9:1) por 10 minutos, lavado rapidamente em água corrente e mantido imerso em ácido periódico a 1% por 10 minutos, na jarra de Coplin foi imerso a lâmina em Reativo de Schiff por 30 minutos, lavado em água sulfurosa por 2 a 3 minutos e

53 após em água corrente por 5 a 10 minutos e deixado secar, sendo realizada a contra coloração com hematoxilina por 10 minutos. A reação positiva é indicada por cor que varia de púrpura a magenta brilhante, nos sítios onde se encontram os carboidratos oxidáveis, seguindo os padrões de interpretação (BELL et al, 1981). 4.6.4 α-naftil Acetato Esterase (A-EST) A técnica foi realizada utilizando o kit Alfa - Naphthyl Acetate (Non Specific Esterase) Sigma Aldrich. O procedimento consistiu em fixar as lâminas em fixador de citrato, acetona e metanol durante 1 minuto à temperatura ambiente (18 26 C), lavada abundantemente com água desionizada e secada ao ar durante, pelo menos, 20 minutos, foi identificado dois erlenmeyer como (A e B), em cada um foi adicionado 50 ml de solução de tampão diluído TRIZMALTM 7,6 PRÉ-AQUECIDA A 37 C, mexido constantemente, o conteúdo de 1 cápsula de sal RR de azul permanente, N.º de Catálogo 91-7, foi dissolvido no tampão e adicionado 2 ml de solução de α-naftil acetato, quando a solução apresentou uma cor amarela e uma ligeira turvação continuou-se a homogeneização durante 15 a 20 segundos e em um dos frascos foi adicionado 2 ml de fluoreto de sódio (não foi filtrado), as amostras foram colocadas na solução de coloração do passo anterior e incubadas a 37 C durante 30 minutos; NOTA: PROTEGIDAS DA LUZ; as lâminas foram retiradas da solução de coloração, lavadas em água deionizada durante 3 minutos eliminando a solução de coloração sendo realizada a contra coloração com hematoxilina de Mayer. (SIGMA ALDRICH CHEMIE. Procedimento 90: Alemanha, 2005). 4.7 Estudo do sangue periférico e medula óssea O estudo citológico do sangue periférico e da medula óssea no tempo t 1 foi realizado por dois hematologistas a partir de esfregaços corados por Leishman sem o conhecimento prévio dos dados clínico-epidemiológicos. O diagnóstico de leucemia aguda foi confirmado pela presença de mais de 20% de blastos no sangue periférico e/ou na medula. A análise morfológica foi utilizada para classificar em LMA (M1 M2 M3 M4 M5 M6) e LLA (L1/ L2 e L3) e LA (leucemia aguda) para aqueles casos em