ENSAIOS IMUNOENZIMÁTICOS (EIE) CURSO DE FARMÁCIA DISCILINA DE IMUNOLOGIA CLÍNICA rofa MsC. riscila. S. dos Santos ENSAIOS IMUNOENZIMÁTICOS EIE HOMOGÊNEOS HETEROGÊNEOS CROMÓGENOS SOLÚVEIS Todo em fase líquida EMIT e SLFIA Separação em fase sólida CROMÓGENOS INSOLÚVEIS (ELISA) (W. BLOTTING) ENSAIOS IMUNOENZIMÁTICOS HETEROGÊNEOS ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay
Uma retrospectiva da evolução da Sorologia Atividade anticorpos & Desenvolvimento Testes ELISA 7 Eva Engvall 8 0 8 7 0 4 2 5 6 6 7 7 eter erlmann TIOS DE FASE SÓLIDA Microplacas de poliestireno Microplacas de polivinil Microplacas de polipropileno Esferas ( artículas de agarose, poliacrilamida, dextran, poliestireno, etc.) Microesferas plásticas ou de celulose ANTÍGENOS Antígenos purificados por cromatografia de afinidade; eptídeos sintéticos; eptídeos obtidos a partir de tecnologia recombinante. Acetato de celulose
ANTICOROS oliclonais: Reconhecem múltiplos sítios de ligação do Ag Monoclonais: Reconhecem um único sítio de ligação do Ag ENZIMAS SUBSTRATOS 4- Nitrofenil fosfato Fosfatase Alcalina Fosfato de Bromocloroindol (BCI) Ac oliclonais Ac Monoclonais β-d-galactosidase eroxidase 2-Nitrofenil-β-D-Galactosidase H 2 O 2 e orto-fenileno-diamina (OD) H 2 O 2 e Tetrametil-benzidina (TMB) H 2 O 2 e 3-metil-2-benzotiazolinona (MBTH) Importância da esquisa de s ENSAIOS ARA ANTICOROS Elucidar processos patológicos confundíveis Diferenciar as fases de uma doença Diagnosticar uma doença congênita Selecionar doadores de sangue Selecionar doadores e receptores de órgãos Avaliar o prognóstico da doença Avaliar a eficácia terapêutica Avaliar imunidade adquirida ou induzida Avaliar o agravamento de uma patologia
MÉTODO INDIRETO: IgG ER MÉTODO INDIRETO: IgG H 2 O 2 /TMB ER ER H 2 SO 4 ositivo LEITOR ÓTICO LAVADORA AUTOMÁTICA
IETA MULTICANAL MÉTODO INDIRETO: IgM H 2 O 2 /TMB ER H 2 SO 4 ositivo INTERFERENTES DOS MÉTODOS INDIRETOS DE DETECÇÃO DE ANTICOROS IgM Altas concentrações de anticorpos IgG INTERFERENTES DOS MÉTODOS INDIRETOS DE DETECÇÃO DE ANTICOROS IgM resença de fator reumatóide Substrato incolor Substrato incolor Substrato incolor Substrato colorido Falso negativo Falso ositivo
MÉTODO DE CATURA ARA ANTICOROS IgM ELISA AVIDEZ DE IgG H 2 O 2 /TMB o Etapa: Elisa IgG indireto 2 o Etapa: Elisa IgG uréia Substrato incolor Substrato incolor ER H 2 SO 4 DO=,2 DO= 0,6 ositivo Fase sólida ELISA AVIDEZ DE IgG MÉTODO SANDWICH : IgG Avidez < 30% = Infecção aguda Avidez > 50% = Infecção crônica ER H 2 O 2 /TMB 30% < Avidez < 50% = Indeterminado H 2 SO 4 Fase sólida ositivo
Método Sandwich : s anti-hiv HIV- e/ou HIV-2 ENSAIOS ARA ANTÍGENOS Importância da esquisa de Antigenos MÉTODO CATURA SANDWICH : DETECÇÃO DE Ag Como critério de cura (ausência de antígeno) Definir a etiologia da doença Selecionar doadores de sangue Selecionar doadores e receptores de órgãos Em inquéritos epidemiológicos ER H 2 O 2 /OD H 2 SO 4 Fase sólida ositivo
HBs Ag ELISA Exemplo HBs Ag ELISA Exemplo 2 Monoclonal HB07 HBsAg HBsAg A A Monoclonal HB05 Marcado com fosfatase alcalina Anti-HBs de cabra purificado HBsAg HBsAg monoclonal HB05 marcado com peroxidase monoclonal HB07 marcado com peroxidase TMB Azul Sensibilidade ~.5ng/ml Sensibilidade 0.3-0.5ng/ml TMB H 2 O 2 HBs Ag ELISA Exemplo 3 MÉTODO DE COMETIÇÃO COM ANTÍGENOS MARCADOS Com a imobilização do monoclonal HB05 monoclonal HB07 Monoclonal 2D3 HBsAg HBsAg Conjugado anti-hbs de cabra marcado com peroxidase Azul TMB Fase sólida Antígeno (amostra) Antígeno marcado Sensibilidade < 0,5 ng/ml TMB H 2 O 2 DO [ ] Ag DO - [ ] Ag
MÉTODO DE COMETIÇÃO COM ANTICORO MARCADOS ENSAIOS ARA ANTÍGENOS E ANTICOROS Fase sólida recoberta com Antígeno Antígeno (amostra) marcado DO [ ] Ag DO - [ ] Ag ENSAIO DE 4 a GERAÇÃO esquisa simultânea de antígenos e anticorpos. a Situação: resença de antígeno 24 2 a Situação: resença de anticorpo anti-hiv 3 a Situação: Ausência de antígeno 24 e anticorpos anti-hiv ENSAIO DE 4 a GERAÇÃO esquisa simultânea de antígenos e anticorpos. a Situação: resença de antígeno 24 2 a Situação: resença de anticorpo anti-hiv 3 a Situação: Ausência de antígeno 24 e anticorpos anti-hiv
ENSAIO DE 4 a GERAÇÃO esquisa simultânea de antígenos e anticorpos. a Situação: resença de antígeno 24 2 a Situação: resença de anticorpo anti-hiv 3 a Situação: Ausência de antígeno 24 e anticorpos anti-hiv ENSAIO DE 4 a GERAÇÃO esquisa simultânea de antígenos e anticorpos. a Situação: resença de antígeno 24 2 a Situação: resença de anticorpo anti-hiv 3 a Situação: Ausência de antígeno 24 e anticorpos anti-hiv ENSAIO DE 4 a GERAÇÃO esquisa simultânea de antígenos e anticorpos. a Situação: resença de antígeno 24 2 a Situação: resença de anticorpo anti-hiv 3 a Situação: Ausência de antígeno 24 e anticorpos anti-hiv
SISTEMA BIOTINA AVIDINA Vitamina roteína SISTEMA BIOTINA AVIDINA SISTEMA BIOTINA AVIDINA s Conjugados com biotina Usando Avidina marcada Avidina marcada s Conjugados com biotina Usando Biotina marcada em uma segunda etapa Avidina não marcada Biotina marcada
SISTEMA BIOTINA AVIDINA s Conjugados com biotina Usando Biotina marcada com enzima para fazer ponte com o de detecção Avidina não marcada VANTAGENS E DESVANTAGENS Uma das principais ferramentas diagnósticas disponíveis Diagnóstico precoce Quantificações em mui/ml, ng/dl Automação Falta de padronização das fases sólidas Água reagente Biotina ligada a enzima VANTAGENS E DESVANTAGENS reço compatível Grandes plataformas Multiparamétrico Reações cruzadas Necessidades de ensaios confirmatórios OBRIGADA!!!