Mapeamento de QTL s Microarranjos de DNA Combinando microarranjos de DNA com mapeamento de QTL s

Sumário 1 Mapeamento de QTL s Microarranjos de DNA Combinando microarranjos de DNA com mapeamento de QTL s 2 eqtl Exemplo: Jansen (2003) 3 Camundongos Milho Humanos 4 Desafios Atuais Perspectivas Softwares disponíveis 2 / 56

Mapeamento de QTL s Mapeamento de QTL s Microarranjos de DNA Combinando microarranjos de DNA com mapeamento de QTL s QTL s ( Quantitative Trait Loci ) são regiões cromossômicas que influenciam a variação de caracteres quantitativos. Mapeamento de QTL s: estimar número de locos, posição, efeitos e interação (epistasia) entre regiões. O conceito de mapeamento é relativamente antigo (Sax, 1923; Thoday, 1961), porém publicações sobre este tema tornaram-se mais freqüentes a partir de 1990. As principais razões para o aumento das publicações: Amplo desenvolvimento e utilização dos marcadores moleculares; Desenvolvimento de metodologias para construção de mapas de ligação (Lander e Green, 1987); Desenvolvimento de metodologias capazes de mapear QTL s eficientemente (Lander e Botstein, 1989); 3 / 56

Mapeamento de QTL s: Adaptado de Doerge (2002) Mapeamento de QTL s Microarranjos de DNA Combinando microarranjos de DNA com mapeamento de QTL s 4 / 56

Mapeamento de QTL s Mapeamento de QTL s Microarranjos de DNA Combinando microarranjos de DNA com mapeamento de QTL s Acreditava-se nesta época que a descoberta de QTL s levariam rapidamente ao descobrimento dos genes que envolvidos no controle genético de caracteres quantitativos de importância econômica. Contudo, esta expectativa não foi confirmada! Flint et al. (2005) citam que no banco de dados do NCBI apenas 20 genes candidatos foram identificados em roedores, enquanto havia 2750 QTL s. 5 / 56

Mapeamento de QTL s Mapeamento de QTL s Microarranjos de DNA Combinando microarranjos de DNA com mapeamento de QTL s Wayne e McIntyre (2002) comentam que a principal dificuldade em caminhar do nível de QTL para nível de genes deve-se a ausência de metodologias que permitam este tipo de estudo. O controle genético de caracteres quantitativos está associado a inúmeros locos, mas trabalhos de comprovação e validação somente são viáveis para um número reduzido de genes. Logo, necessitam-se avanços para a detecção de genes, e não para a detecção em QTL s (Flint et al., 2005). 6 / 56

Mapeamento de QTL s: Adaptado de Doerge (2002) Mapeamento de QTL s Microarranjos de DNA Combinando microarranjos de DNA com mapeamento de QTL s 7 / 56

Microarranjos de DNA Mapeamento de QTL s Microarranjos de DNA Combinando microarranjos de DNA com mapeamento de QTL s Os avanços obtidos nas áreas de genômica, permitiram o desenvolvimento da tecnologia de microarranjos de DNA. Um microarranjo de DNA (chip de DNA) consiste em um arranjo pré-definido de moléculas de DNA quimicamente ligadas à uma superfície sólida. Isto permite a detecção e quantificação de ácidos nucléicos (mrna na forma de cdna) quando hibridizadas com o DNA fixado no array (hibridação por complementariedade de bases). 8 / 56

Microarranjos de DNA Fonte: Karp (2005) Mapeamento de QTL s Microarranjos de DNA Combinando microarranjos de DNA com mapeamento de QTL s 9 / 56

Microarranjos de DNA Fonte: http://en.wikipedia.org/wiki/dna microarray Mapeamento de QTL s Microarranjos de DNA Combinando microarranjos de DNA com mapeamento de QTL s Exemplo de chip de DNA contendo a expressão de aproximadamente 40000 cdnas 10 / 56

Microarranjos de DNA Mapeamento de QTL s Microarranjos de DNA Combinando microarranjos de DNA com mapeamento de QTL s A principal contribuição desta tecnologia é a possibilidade de estudar a expressão simultânea de milhares de genes. Wayne e McIntyre (2002) comentam que o estudo de expressão gênica combinada com marcadores moleculares trata-se de uma valiosa ferramenta que permitiriam o entendimento de caracteres quantitativo em nível gênico. 11 / 56

Microarranjos de DNA Fonte: http://en.wikipedia.org/wiki/dna microarray Mapeamento de QTL s Microarranjos de DNA Combinando microarranjos de DNA com mapeamento de QTL s cdna cor comp. de onda (µm) 1 verde 500 2 amarelo 565 3 verde 542 4 vermelho 700 5 vermelho 666 6 amarelo 587... 10000 verde 508 Resultado hipotético para um experimento de microarranjos de DNA: A expressão gênica é interpretada como variável quantitativa. 12 / 56

Combinação de microarranjos de DNA com mapeamento de QTL s Mapeamento de QTL s Microarranjos de DNA Combinando microarranjos de DNA com mapeamento de QTL s ind. cdna - comp. de onda (µm) 1 2 3 4 5 6... 10000 1 500 565 542 700 666 587... 508 2 605 618 627 613 692 526... 624 3 696 552 577 701 573 563... 563 4 577 600 595 612 664 624... 526........ n 616 594 562 502 544 617... 662 Representação de uma população segregante composta por n indivíduos e com fenotipagem através de m cdnas. 13 / 56

Combinando microarranjos de DNA com mapeamento de QTL s Mapeamento de QTL s Microarranjos de DNA Combinando microarranjos de DNA com mapeamento de QTL s ind. Fenótipos Marcadores Moleculares Alt.(cm) Prod.(g) NR T.Óleo (gkg 1 ) A B C... 1 113 55 17 48 aa BB Cc... 2 103 62 13 51 AA BB cc... 3 98 49 10 33 Aa bb cc... 4 127 67 15 69 Aa Bb cc........... 100 111 72 12 43 aa Bb CC... População para mapeamento de QTL s considerando algumas características fenotípicas (agrônomicas) e diversos marcadores moleculares. 14 / 56

Combinando microarranjos de DNA com mapeamento de QTL s Mapeamento de QTL s Microarranjos de DNA Combinando microarranjos de DNA com mapeamento de QTL s ind. cdna Marcadores Moleculares 1 2 3 4 A B C... 1 500 565 542 700 aa BB Cc... 2 605 618 627 613 AA BB cc... 3 696 552 577 701 Aa bb cc... 4 577 600 595 612 Aa Bb cc........... 100 616 594 562 502 aa Bb CC... População para mapeamento de QTL s considerando algumas características fenotípicas obtidas com microarranjos de DNA e diversos marcadores moleculares. 15 / 56

Combinando microarranjos de DNA com mapeamento de QTL s Mapeamento de QTL s Microarranjos de DNA Combinando microarranjos de DNA com mapeamento de QTL s ind. cdna Fenótipos Marcadores Moleculares 1 2 3 4 Alt.(cm) Prod.(g) NR T.Óleo A B C... 1 500 565 542 700 113 55 17 48 aa BB Cc... 2 605 618 627 613 103 62 13 51 AA BB cc... 3 696 552 577 701 98 49 10 33 Aa bb cc... 4 577 600 595 612 127 67 15 69 Aa Bb cc............... 100 616 594 562 502 111 72 12 43 aa Bb CC... População para mapeamento de QTL s considerando algumas características fenotípicas (agronômicas e microarranjos de DNA) e diversos marcadores moleculares. 16 / 56

Mapeamento de QTL s Microarranjos de DNA Combinando microarranjos de DNA com mapeamento de QTL s Combinando microarranjos de DNA com mapeamento de QTL s Fonte: Schadt et al. 2003 17 / 56

eqtl Exemplo: Jansen (2003) foram os primeiros autores que reconheceram o potencial de aplicar mapeamento de QTL s em dados de microarrays. 18 / 56

eqtl Exemplo: Jansen (2003) propõem a reconstrução de rotas metabólicas ( networks ), a partir da associação entre marcadores e cdna. 19 / 56

eqtl Exemplo: Jansen (2003) 20 / 56

eqtl eqtl Exemplo: Jansen (2003) definiram o termo eqtl (QTL expresso). O mapeamento de eqtl s permite identificar regiões do genoma que controlam (regulam) a expressão gênica. Cada spot de um microarranjo de DNA é um caráter quantitativo. Os eqtl s podem atuar na regulação de um gene através de duas formas: Ação em cis Ação em trans 33 / 56

eqtl eqtl Exemplo: Jansen (2003) Ação em cis: O nível de transcrição é regulado por polimorfismo do DNA do próprio gene (eqtl e gene próximos). Ação em trans: O nível de transcrição é regulado por polimorfismo em uma região, a qual o gene não está fisicamente localizado. 34 / 56

eqtl eqtl Exemplo: Jansen (2003) Fatores de transcrição podem ter eqtl em cis, mas como estão envolvidos na expressão de outros genes, podem também ser detectados como eqtl s atuando em trans. eqtl s com maiores valores de LOD tendem a apresentar ação em cis. Por outro, lado eqtl s de efeito moderado tendem a indicar ação em trans. Variações de primeira ordem (devido ao próprio gene) são mais fáceis de se detectar, em relação a efeitos secundários (eqtl de um gene atuando na expressão de outros genes) (Schadt et al., 2003). 35 / 56

Exemplo: Jansen (2003) eqtl Exemplo: Jansen (2003) 36 / 56

Camundongos Milho Humanos Objetivo: realizar um estudo compreensivo para a expressão gênica, através de eqtl s, utilizando camundongos, plantas e humanos. 37 / 56

Camundongos Milho Humanos Camundongos: Quantos genes apresentavam expressão diferencial; Distribuição dos eqtl s ao longo do genoma; Explicação molecular para presença do eqtl; Combinação de expressão gênica com mapeamento; Milho: Visualização de epistasia; Humanos: Associação entre camundongos e seres humanos; Algumas análises em humanos (Potencial); 38 / 56

Camundongos Camundongos Milho Humanos População segregante: 111 indivíduos F 2 obtido através do cruzamento das linhagens C57BL/6J e DBA/2J: O mapa genético foi construído com marcadores microssatélites, cuja a densidade média era de 13 cm; Realizou-se Mapeamento por Intervalo; O chip de DNA disponível para camundongos continha (23574 genes); Avaliaram-se células do Tecido Hepático e Massa de Gordura na Pata (medida de obesidade); 39 / 56

Quantificação dos eqtl s Camundongos Milho Humanos Foram detectados: 11021 genes com LOD superior a 3; 3701 genes com LOD superior a 4,3; 965 genes com LOD superior a 7; Para os genes disponíveis no chip de DNA, 18460 (78%) podiam ser mapeados fisicamente: 34% dos eqtl s com LOD superior a 4,3 apresentavam ação em cis. 71% dos eqtl s com LOD superior a 7 apresentavam ação em cis. 40 / 56

Distribuição dos eqtl s Camundongos Milho Humanos Os autores dividiram o genoma de camundongos em 920 bins (2cM) e para cada posição calculou-se a freqüência de eqtl s presentes em cada bin. Os cromossomos 2, 6, 7, 9, 10, 12, 16 e 17 contém regiões com mais de 1% do número total de eqtl (hotspots). 41 / 56

Polimorfismo molecular Camundongos Milho Humanos Para a compreensão dos eqtl s buscou-se identificar as causas que levariam a detecção de eqtl s. Logo, 3 genes podem ser destacados. Gene C5: deleção em 2 pb na região codante para linhagem DBA que reduz rapidamente a transcrição em comparação com B6; Gene ALAD está duplicado em DBA; Gene St7 sofre splicing diferenciado: em B6 há splicing, enquanto não ocorre em DBA. 42 / 56

Combinando mapeamento e expressão gênica Camundongos Milho Humanos Os autores desejavam associar a expressão gênica com caracteres quantitativos (obesidade). Para isto selecionaram-se os 280 genes (pronunciada expressão diferencial), e realizaram-se agrupamento com os indivíduos de fenótipos extremos. Diferentemente do esperado houve a separação da população de mapeamento em 3 grupos: não obesos e 2 subgrupos de indivíduos obesos 43 / 56

Combinando mapeamento e expressão gênica Camundongos Milho Humanos 44 / 56

Combinando mapeamento e expressão gênica Camundongos Milho Humanos Ao realizar o mapeamento de QTL s com essas subpopulações verifica-se que nos cromossomos 2 e 19 os QTL s se expressam de forma diferencial dentro destes subgrupos, o que indica a complexidade de caracteres quantitativos como obesidade. 45 / 56

Milho Camundongos Milho Humanos Assim, utilizou-se uma população F 2:3 composta por 76 plantas provenientes do cruzamento de materiais de diferentes grupos heteróticos: stiff stalk e Lancaster. O mapa genético de milho foi construído com marcadores microsatélites cuja distância média era de 12 cm. Resultados: 6481 genes apresentavam ao menos 1 QTL s com LOD superior a 3. 7322 eqtl s foram detectados 80% dos eqtl s com LOD superior a 7 apresentavam ação em cis. 46 / 56

Epistasia Camundongos Milho Humanos Utilizando genes de cromossomos distintos e sem ação em trans espera-se ausência de correlação para a expressão gênica. No entanto, algumas interações foram identificadas - epistasia. Aproximadamente 10% dos genes apresentavam este tipo de interação. 47 / 56

Epistasia Camundongos Milho Humanos 48 / 56

Humanos Camundongos Milho Humanos Alguns resultados obtidos com camundongos podem ser extrapolados para seres humanos, uma vez que a região que contém o locos no cromossomo 2 de camundongos apresenta homeologia com o cromossomo humano 20q12-q13.12 (regiões associadas a obesidade). 49 / 56

Humanos Camundongos Milho Humanos Um estudo preliminar em humanos foi realizado com famílias de referências do CEPH (Centre d Etude du Polymorphisme Humain): 56 indivíduos oriundos de 4 famílias de referência; Informações de pais e avós; Chips de DNA para humanos (2726 genes com expressão diferencial) Células do sistema imune humano; O tamanho amostral é muito pequeno para realizar análises mais elaboradas. Acredita-se, no mímino 30% dos genes expressos podem ter eqtl s detectados. Estudos de expressão gênica em células do sistema imunológico em humanos podem ser alvos futuros para terapia gênica. 50 / 56

Desafios Atuais Desafios Atuais Perspectivas Softwares disponíveis Elevado volume de dados ainda compromete análises mais elaboradas. Como lidar com falsos positivos; Como validar eqtl s com ação em trans? (importância para estudo de epistasia, rotas metabólicas); Estudos consideram a possibilidade de utilizar FDR para estabelecer nível de significância, porém não há um consenso. 51 / 56

Desafios Atuais Desafios Atuais Perspectivas Softwares disponíveis Atualmente, há modelos que permitem realizar o mapeamento de QTL s para múltiplas características, mas não há modelos com a capacidade de absorver esse excessivo número de variáveis; Análises conjuntas x Análises individuais: tempo de processamento ainda é fator limitante; Opções em utilizar técnicas de análise multivariada (não há consenso); Estudos de rotas metabólicas: reconhecem que a abordagem proposta por eles é limitante para análise de conjunto de dados reais. 52 / 56

Perspectivas Desafios Atuais Perspectivas Softwares disponíveis Jansen (2003): Experimentos para perturbação de sistemas como knockout de genes, transgenia e mutagênese podem ser aplicados vários organismos, mas o conceito de genômica-genética (mapear eqtl s) é o único meio de realizar estudo em seres humanos; Darvasi (2003 e 2006): Esta abordagem aproxima-se cada vez mais na identificação e entendimento dos genes que controlam caracteres quantitativos (75% da variação genética). Espera-se que o entendimento da base genética das doenças traga muita contribuição para a medicina. 53 / 56

Perspectivas Desafios Atuais Perspectivas Softwares disponíveis Gibson e Weir (2005) destacam: Novas ferramentas estatísticas e modelos devem ser desenvolvidos para manipular transcritos com estruturas de covariâncias e não aditividade de transcritos; Estudos de eqtl s fornecem somente uma visão restrita, uma vez que não há estudos de comportamento de eqtl s em populações naturais. O conhecimento futuro de rotas metabólicas permitirão o estudo de epistasia em caracteres quantitativos de uma forma que atualmente não é possível. 54 / 56

Software disponíveis Desafios Atuais Perspectivas Softwares disponíveis Programas para construção de mapas de ligação e mapeamento de QTL s. Mapmaker/Exp e Mapmaker/QTL; JoinMap; QTL Cartographer; Rqtl (programa R); WebQTL; Programas que permitem manipular e avaliar dados de mapeamento de eqtl s. eqtl Viewer (Zou et al., 2007); eqtl explorer (Mueller et al., 2006) - integrado com o WebQTL e QTLexpress; WinQTLcart; MOM model (Kendziorski et al., 2006): scripts desenvolvidos para R. Mapeamento de eqtl via modelo de mistura com marcadores 55 / 56

Referências Desafios Atuais Perspectivas Softwares disponíveis DARVASI, A. Gene expression meets genetics. Nature, v.422, p.269-270, 2006. DARVASI, A. Closing in on complex traits. Nat. Genetics, v.38, p.861-862, 2006. DOERGE, RW. Mapping and analysis of quantitative trait loci in experimental populations. Nat. Rev. Genetics, v.3, p.43-52, 2002. FLINT, J; VALDAR, W; SHIFMAN, S; MOTT, R. Strategies for mapping and closing quantitative trait genes in rodents. Nat. Rev. Genetics, v.6, p.271-286, 2005. GIBSON, G; WEIR, B. The quantitative genetics of transcription. TRENDS in Genetics, v.21, p.616-623, 2005. JANSEN, RC; NAP, JP. Genetical Genomics: the added value from segregation. TRENDS in Genetics, v.17, p.399-391, 2001. JANSEN, RC. Studying complex biological systems using multifactorial perturbation. Nat. Rev. Genetics, v.4, p.145-151, 2003. KARP, G. Biologia celular e molecular: conceitos e experimentos, 3 a edição, Manole, p.786, 2005. KENDZIORSKI, C; CHEN, M; YUAN, M; LAN, H; ATTIE, AD. Statistical Methods for Expression Quantitative Trait Loci (eqtl) Mapping. Biometrics 62, 19-27, 2006 MUELLER, M; GOEL, A; Thimma, M; Dickens, NJ; Aitman, TJ; Mangion, J. eqtl Explorer: integrated mining of combined genetic linkage and expression experiments, Bioinformatics, v.22, p.509-511. 2006. SCHADT et al. Genetics of expression surveyed in mayze, mouse and man. Nature, v.422, p.297-302, 2003. WAYNE, ML; McINTYRE, LM. Combining mapping and arraying: An approach to candidate gene identification. Proc. Natl. Acad. Sci USA, v. 99, p.14903-14906, 2002. ZOU,W; AYLOR, DL; ZENG, ZB. eqtl Viewer: visualizing how sequence variation affects genome-wide transcription. BCM Bioinformatics, v.8, p.7, 2007 56 / 56