1.0 Objetivos e alcance Este método objetiva detectar e quantificar resíduos de As, Cd e Pb em rim bovino, equino e de ave empregando a Espectrometria de Massas com Plasma Indutivamente Acoplado (ICP-MS). As faixas de quantificação são de 153,6 a 2000 µg/kg, 6,1 a 2000 µg/kg e 38,5 a 1000 µg/kg para As, Cd e Pb, respectivamente. 2.0 Fundamentos O método fundamenta-se na digestão de uma pequena quantidade de amostra de rim bovino, equino ou de ave adicionada de ítrio como padrão interno em digestor de microondas com 6 ml de solução de HNO 3 10% v/v em água ultrapura. A digestão ocorre em vaso fechado, o que impede a perda de elementos por volatilização. As microondas promovem a elevação da pressão e da temperatura dentro do vaso de reação possibilitando uma digestão rápida e eficiente. O digerido é então transferido para um tubo graduado, avolumado para 15 ml e as leituras são feitas no equipamento de ICP-MS. 3.0 Reagentes, padrões, materiais e insumos 3.1 Reagentes - Ácido Nítrico (HNO 3 ) 65% ultra puro ou purificado em purificador subboiling - Água ultrapura (Resistividade > 18,2 MΩ.cm). 3.2 Padrões - Solução padrão estoque de Arsênio (As) para ICP (1000 mg/l) - Solução padrão estoque de Cádmio (Cd) para ICP (1000 mg/l) - Solução padrão estoque de Chumbo (Pb) para ICP (1000 mg/l) - Solução padrão estoque de Ítrio (Y) para ICP (10 000 mg/l) - Solução padrão multielementar 10 mg/l de Ba, Be, Ce, Co, In, Pb, Mg, Tl e Th para otimização do ICP- MS. Impresso por: Natanael Viana Lourenço Cópia não controlada Página 1/12
3.3 Materiais - Ponteiras de micropipetas - Balões volumétricos calibrados de polipropileno ou similar de 25,00 ml - Balão volumétrico de polipropileno ou similar de 250,00 ml - Balão volumétrico de polipropileno ou similar de 1000 ml - Proveta graduada de polipropileno ou similar de 250 ml - Tubos graduados de polipropileno ou similar de 15 ml - Barcas de teflon para pesagem de amostras - Amostra branca de rim bovino, equino ou de ave para As, Cd e Pb. 3.4 Insumos - Gás argônio analítico 5.0 pureza mínima de 99,999%. 4.0 Equipamentos - Balança analítica com precisão de ± 0,1 mg - Micropipetas automáticas com capacidade de, pelo menos, 200 μl a 1000 μl e de 70 μl a 200 μl devidamente calibradas e prontas para uso conforme POP/LEI/PL/010. - Câmara de exaustão ou capela - Espectrômetro de Massas com Plasma Indutivamente Acoplado Varian 820-MS - Autosampler SPS 3 - Digestor de microondas Anton Paar MW3000 com vasos de quartzo - Purificador de água, para produção de água ultrapura - Purificador de ácidos por sub-ebulição. 5.0 Precauções analíticas - Os balões utilizados no preparo de todas as soluções padrões devem ser de polipropileno ou de material similar; - A água utilizada deve ser ultrapura com resistividade maior que 18,2 MΩ.cm; Impresso por: Natanael Viana Lourenço Cópia não controlada Página 2/12
- Todo o material utilizado, com exceção das ponteiras novas, deve ser lavado com detergente neutro, enxaguadas com água destilada, imersas em banho de ácido nítrico 5% v/v no mínimo por 4 horas e enxaguadas no mínimo três vezes com água ultrapura (Resistividade > 18,2 MΩ.cm) antes do uso. Lavagens que incluam mais de um banho ácido também podem ser utilizadas - Utilizar balanças com resolução de pelo menos 0,1 mg - Manipular soluções ácidas dentro de capelas para exaustão de fumos e vapores ácidos - A capela deve ser limpa sempre antes e após o uso. 6.0 Procedimentos Durante a análise, preencher o formulário FOR/LEI/PL/051 com todas as informações pertinentes, permitindo a rastreabilidade dos dados da análise como datas, identificação das amostras, massas, reagentes, padrões, equipamentos, condição de leitura e analistas. 6.1 Preparo de soluções reagentes As soluções reagentes devem ser preparadas conforme descrito abaixo e identificadas, armazenadas e registradas conforme descrito no POP/LEI/PL/006. As soluções reagentes têm validade de 6 meses a partir da data de seu preparo. As soluções podem ser preparadas em quantidades diferentes das descritas a seguir, em função do volume de análises, mantendo as proporções. 6.1.1. Ácido Nítrico 10% v/v Medir em uma proveta graduada de polipropileno de 1000 ml, 100 ml de ácido nítrico ultra puro ou purificado em purificador sub-ebulição, acrescentar água ultrapura (R >18,2 MΩ.cm). 6.2. Preparo de soluções padrão As soluções padrão devem ser preparadas conforme descrito a seguir, identificadas, armazenadas Impresso por: Natanael Viana Lourenço Cópia não controlada Página 3/12
e registradas conforme descrito no POP/LEI/PL/004. As soluções padrões devem ser utilizadas no dia de seu preparo. Se houver necessidade de guardá-las, acidificar a solução padrão com HNO 3 à 1% v/v, ou seja, adicionar 2500 µl de HNO3 10% v/v (item 6.1.1) durante o preparo no caso de balões de 25 ml. As soluções acidificadas com HNO 3 tem validade de 6 meses (Nota técnica nº 016/2011 LEI/LANAGRO/MG). 6.2.1. Solução padrão intermediária de As (50 mg/l), Cd (50 mg/l) e Pb (25 mg/l) (Pool). Pipetar exatamente 1250 μl da solução padrão estoque de arsênio de 1000 mg/l, 1250 μl da solução padrão estoque de cádmio de 1000 mg/l e 625 μl da solução padrão estoque de chumbo de 1000 mg/l e transferir para balão volumétrico calibrado de 25 ml e completar o volume com água ultrapura (R >18,2 MΩ.cm). Esta solução poderá ser feita com apenas um ou dois analitos, dependendo do que se quer analisar. 6.2.2. Solução padrão de adição de As (1000 g/l), Cd (1000 g/l) e Pb (500 g/l) (Pool). Pipetar exatamente 500 μl da solução padrão intermediária de As (50 mg/l), Cd (50 mg/l) e Pb (25 mg/l) (Pool) (item 6.2.1), transferir para balão volumétrico calibrado de 25 ml e completar o volume com água ultrapura (R >18,2 MΩ.cm). 6.2.3. Solução padrão intermediária de ítrio de 40 000,0 g/l Pipetar exatamente 100 μl da solução padrão estoque de ítrio de 10 000 mg/l e transferir para balão volumétrico calibrado de 25 ml e completar o volume com água ultrapura (R >18,2 MΩ.cm). 6.2.4. Solução padrão de adição de ítrio de 200,0 g/l Pipetar exatamente 125 μl da solução padrão intermediária de ítrio de 40 000,0 g/l, transferir para balão volumétrico calibrado de 25 ml e completar o volume com água ultrapura (R >18,2 MΩ.cm). Impresso por: Natanael Viana Lourenço Cópia não controlada Página 4/12
6.2.5. Soluções padrões de uso para a curva de calibração de As, Cd e Pb Preparar 6 soluções padrões de 0 μg/l - 8,0 μg/l - 16,0 μg/l - 24,0 μg/l - 32,0 μg/l e 40,0 μg/l para As, 0 μg/l - 8,0 μg/l - 16,0 μg/l - 24,0 μg/l - 32,0 μg/l e 40,0 μg/l para Cd e 0 μg/l 4,0 μg/l 8,0 μg/l 12,0 μg/l 16,0 μg/l e 20,0 μg/l para Pb pipetando exatamente 0 μl, 200 μl, 400 μl, 600 μl, 800 μl e 1000 μl da Solução padrão de adição de As (1000 g/l), Cd (1000 g/l) e Pb (500 g/l) (Pool) (item 6.2.2) em balões volumétricos calibrados de 25 ml. Adicionar em cada balão 6 ml da solução de ácido nítrico 10% v/v e 125 μl da solução padrão de adição de ítrio de 200,0 g/l (item 6.2.4). Completar o volume com água ultrapura (R >18,2 MΩ.cm). 6.2.6. Solução tunning para otimização do ICP-MS Pipetar exatamente 70 µl da solução padrão multielementar de 10 mg/l de Ba, Be, Ce, Co, In, Pb, Mg, Tl e Th para otimização do ICP-MS e transferir para balão volumétrico de polipropileno de 250 ml. Para esta solução não há necessidade de valores exatos, basta que os valores mínimos de contagens por segundo para os analitos utilizados no alinhamento da tocha do plasma sejam atingidos. 6.3 Digestão das amostras 6.3.1. As amostras são preparadas de acordo com a IP/LEI/PL/001, e digeridas para análise conforme descrito abaixo. 6.3.2. Pesar, conforme IS/LEI/PL/015, em barquinhas de teflon uma massa entre 0,2990 g e 0,3010 g de amostra de rim bovino, equino ou de ave e colocar em tubos de quartzo do digestor de microondas; Impresso por: Natanael Viana Lourenço Cópia não controlada Página 5/12
6.3.3. Pesar duas alíquotas entre 0,2990 g e 0,3010 g de uma amostra branca da matriz em análise previamente selecionada pelo setor conforme POP/LEI/PL/005. Uma alíquota será utilizada como branco e a outra será utilizada como amostra fortificada para estimar a recuperação. 6.3.4. A recuperação deverá ser estimada em um dos três níveis conforme descrito no POP/LEI/PL/009. Verificar na PLN/LEI/PL/001 o nível estudado na batelada anterior e adotar um nível diferente para a análise em curso. As alíquotas devem ser adicionadas em acordo com o Quadro 1. As alíquotas devem ser pipetadas das soluções padrão de adição de As (1000 µg/l), Cd (1000 µg/l) e Pb (500 µg/l) (Pool) (item 6.2.2). Matriz Quadro 1: Valores das alíquotas para adição na recuperação para os diferentes níveis Analito Concentração Nível Inferior Nível Intermediário Nível Superior Alíquota (µl) Concentração Alíquota (µl) Concentração Alíquota (µl) Rim As 500,00 1000,00 1500,00 Bovino, Equino Cd 500,00 150 1000,00 300 1500,00 e de aves Pb 250,00 500,00 750,00 450 6.3.5. Adicionar em cada tubo de quartzo 75 μl da solução padrão de adição de ítrio de 200,0 g/l (item 6.2.4), inclusive nas amostras de recuperação, e 6 ml da solução de ácido nítrico 10% v/v em água ultrapura; 6.3.6. Proceder à digestão conforme IT/LEI/PL/027 seguindo o programa de digestão mostrado na tabela 1. Tabela 1 Programa de digestão para digestão de 0,30 g de rim bovino, equino e de ave utilizando 6 ml de solução de ácido nítrico 10% v/v Etapa Potência Rampa Permanência Exaustão (W) (min) (mim) 1 1280 10 20 1 2 0-15 3 Impresso por: Natanael Viana Lourenço Cópia não controlada Página 6/12
Importante: Os valores aqui descritos são para quando se utiliza 8 frascos de quartzo no digestor de microondas. No caso de se utilizar apenas 4 frascos os valores de potência são diminuídos pela metade e o tempo permanece o mesmo. Adicionar também no programa o valor de 0,4 bar/s para o p-rate. 6.3.7. Após a digestão transferir quantitativamente o digerido lavando bem o selo e o tubo de quartzo para tubos graduados de 15 ml com bastante cuidado para evitar perdas. 6.4 Detecção e quantificação 6.4.1. Otimizar e calibrar o ICP-MS conforme IT/LEI/PL/023; 6.4.2 Após a otimização e calibração do ICP-MS anotar no FOR/LEI/PL/051 o valor de contagens por segundo (cps) de Pb, In e Th obtida no ponto máximo do sinal de Pb após o alinhamento da tocha. Para isto, dentro do software do equipamento selecionar Window / Instrument Setup / Plasma Align, clicar em Vertical (ou horizontal) no canto inferior esquerdo, posicionar e clicar com a seta do mouse no ponto mais alto do pico e olhar o valor de cps referente ao 208 Pb, 232 Th e 115 In que aparece na lista à esquerda. Estes valores devem ser da ordem de 1,0 X 10 5 para Pb, 1,0 x 10 4 para Th e 1,0 x 10 5 para In. Caso os valores encontrados sejam inferiores a estes, realizar uma troca das mangueiras de amostragem do autosampler e checar novamente os valores. Não é necessário realizar todo o procedimento de calibração novamente, basta selecionar Window Instrument Setup Plasma Align, clicar em Time no canto inferior esquerdo e depois em Start. Observar os valores de contagens por segundo para 208 Pb, 232 Th e 115 In e ir ajustando a pressão nas mangueiras de amostragem na bomba peristáltica até se obter os valores desejados. Caso estes valores não sejam alcançados, realizar a limpeza dos cones de amostragem e skimmer, da tocha de quartzo, do nebulizador e da câmara de nebulização, conforme IT/LEI/PL/023. Após a limpeza realizar o procedimento de otimização e calibração novamente. Impresso por: Natanael Viana Lourenço Cópia não controlada Página 7/12
6.4.3. Programar o equipamento para leitura de 75 As, 114 Cd, 206,207,208 Pb, considerando as especificações constantes na Tabela 2: Tabela 2 Condições ótimas para analise As, Cd e Pb em de rim bovino, equino ou de ave por ICP-MS Item de Controle Parâmetros Ajustes Gas flow (L min -1 ) Plasma flow Auxiliary flow Nebulizer flow Sheath flow 17.5 1.70 0.90 0.20 RF (kw) RF Power 1.45 Sample introduction Sampling depth (mm) Pump rate (rpm) Stabilization time (s) Spray chamber (ºC) 5.50 4 20 3 Ion optics (volts) Quadrupole scan 1 st Extraction lens 2 nd Extraction lens 3 rd Extraction lens Corner lens Mirror lens left Mirror lens right Mirror lens bottom Entrance lens Entrance plate Fringe bias Pole bias Scan mode Dwell time (ms) Points per peak Scans/replicate Replicates/sample -30-250 -294-280 35 20 40 4-40 -3.2 0 Peak hopping 1000 2 10 3 6.4.5. Programar o equipamento para realizar as leituras das soluções padrão de uso, preparadas para a construção da curva de calibração e das amostras. Impresso por: Natanael Viana Lourenço Cópia não controlada Página 8/12
6.5 Pontos críticos 6.5.1 Anotar o peso exato da amostra que será utilizado no cálculo das concentrações dos analitos. 6.5.2 Adição da solução padrão de ítrio de 200,0 µg/l em todas as amostras e padrões de uso para a curva de calibração, para que não seja necessário repetir a análise por conta da falta do padrão interno em alguma amostra ou padrão de uso. 6.5.3 Transferência quantitativa das amostras para os tubos graduados de 15mL, para não haver perdas no processo de transferência e conseqüentemente causar um erro na análise. 6.5.4 Cuidados no preparo das soluções padrões. 7.0 Resultados 7.1 Critérios de aceitabilidade dos resultados 7.1.1 Coeficiente de determinação (R 2 ) da curva de calibração: 0,99. 7.1.2 Recuperação é de 80 a 110%, conforme POP/LEI/PL/011. 7.1.2 Resíduos dos pontos da curva de calibração não devem diferir em 10% do valor medido. 7.2 Cálculo dos resultados Transcrever os dados de contagens por segundo e concentração das soluções padrão de uso e das amostras na planilha PLN/LEI/PL/001 (Cálculo de concentrações de As, Pb e Cd) conforme a IS/LEI/PL/008 Preenchimento da PLN/LEI/PL/001 - Cálculo das concentrações de As, Cd e Pb. Avaliar o resultado do coeficiente de correlação (entre x e y) da curva de calibração que deve ser maior que 0,99 e o teste de resíduos. Caso não esteja dentro do aceitável (R 2 >0,99) ou os resíduos forem diferirem de 10% do valor medido, repetir a leitura da curva de calibração utilizando os mesmos padrões e, se ainda assim o problema não for resolvido preparar novos padrões para construção de uma nova curva de calibração. Repetir as leituras das amostras com a nova curva. Se estiver adequado, terminar o preenchimento da planilha. A planilha ajusta os dados da curva pelo Método dos Mínimos Quadrados Ordinários (MMQO) ou Ponderados (MMQP), conforme os dados sejam homo ou heterocedásticos, calcula o fator de recuperação Impresso por: Natanael Viana Lourenço Cópia não controlada Página 9/12
do dia (caso o resultado da recuperação não esteja dentro do aceitável, entre 80 e 110%, deve-se repetir a análise, observando criteriosamente o método e os pontos críticos) e corrige o resultado de acordo com a porcentagem de recuperação do dia; para resultados menores que o limite de quantificação ela emite o resultado NQ (não quantificável). Além destes parâmetros a planilha calcula o valor de incerteza expandida (k=2) associado ao resultado da análise através da abordagem top-down e botton-up (conforme descrito no POP/LEI/PL/011 - Requisitos para validação de métodos de ensaio de elementos inorgânicos) e o valor de incerteza máximo aceitável de acordo com o POP/LEI/PL/011. De acordo com o POP/LEI/PL/002, os resultados são calculados mediante correção de diluições, massa de amostra e da recuperação através da planilha PLN/LEI/PL/001 e lançados no FOR/LEI/PL/014, e lançados no Sistema eletrônico SIGLA (Sistema de Informações Gerenciais para Laboratório de resíduos e contaminantes em Alimentos) conforme IS/LEI/P/017. No SIGLA não há a possibilidade de lançar resultados de incerteza, estas serão apenas calculadas e arquivadas. Os parâmetros de desempenho do método constantes no REL/LEI/PL/003 - Validação de método de análise de As, Cd e Pb em tecidos animal por ICP-MS, estão resumidos no Quadro 2 e os valores de incerteza do método no Quadro 3. Quadro 2 Parâmetros de desempenho para método de análise simultânea de As, Cd e Pb em de rim bovino, equino ou de ave por ICP-MS Analito (LMR) As (1000 µg/kg) Cd (1000 µg/kg) Pb (500 µg/kg) Nível investigado 0,5 x LMR 1,0 x LMR 1,5 x LMR HORRAT r * 0,14 0,16 0,23 HORRAT R * 0,50 0,15 0,19 Recuperação (n = 30, %) 103 ± 7 103 ± 3 103 ± 3 HORRAT r * 0,17 0,15 0,22 HORRAT R * 0,49 0,34 0,37 Recuperação (n = 30, %) 97 ± 7 96 ± 4 96 ± 5 HORRAT r * 0,33 0,24 0,20 HORRAT R * 0,47 0,15 0,18 Recuperação (n = 30, %) 87 ± 8 89 ± 4 89 ± 3 Limite de Detecção Limite de Quantificação CCα CCβ 46,1 153,6 1060,7 1121,4 1,8 6,1 1033,3 1066,6 11,55 38,5 515,6 531,2 Impresso por: Natanael Viana Lourenço Cópia não controlada Página 10/12
* HORRAT r : indicador de repetitividade ; HORRAT R : indicador de precisão intermediária. Ambos os valores de HORRAT foram calculados com número de amostras n=18. De acordo com a legislação valores de HORRAT são aceitos até um valor de 2. Quanto mais próximo de zero, maior é a precisão do método. Quadro 3 Valores de incerteza calculados para a calibração e para a reprodutibilidade intra-laboratorial e no LMR para método de análise de As, Cd e Pb em de rim bovino, equino ou de ave por ICP-MS Reprodutibilidade LMR Calibração No LMR Matriz Analito intralaboratorial Rim As 1000 8,5 38,6 39,5 bovino, eqüino e Cd 1000 4,4 57,1 57,3 de ave Pb 500 3,8 17,8 18,2 8.0 Responsabilidades Cabe ao responsável pelo Laboratório de Elementos Inorgânicos LANAGRO/MG assegurar: - A elaboração, emissão, distribuição de cópias e, quando necessário, a revisão deste MET. - O devido treinamento para execução do referido MET. - A execução deste MET é de responsabilidade do analista, qualquer alteração ocorrida durante a análise, deve ser registrada a fim de garantir a rastreabilidade. - A responsabilidade por autorizar desvios no método cabe ao responsável técnico ou seu substituto. - A responsabilidade pela assinatura dos certificados oficiais de análise deve ser verificada na matriz de competências. 9.0 Referências REL/LEI/PL/003 V.1 Validação de métodos de análise de As, Cd e Pb em tecidos animal por ICP-MS. Nota técnica nº 016/2011 LEI/LANAGRO/MG Revisão bibliográfica Estabilidade de soluções reagentes e padrões. 10.0 Documentos referenciados Impresso por: Natanael Viana Lourenço Cópia não controlada Página 11/12
IP/LEI/PL/001-Preparo de amostras para análise do PNCRC IS/LEI/PL/008-Preenchimento da PLN/LEI/PL/001- Cálculo de concentrações As, Pb e Cd IS/LEI/PL/015-Procedimentos para pesagem de amostras de tecido animal e mel IS/LEI/PL/017-Instrução operacional de registro e inclusão de resultados no SIGLA IT/LEI/PL/023-Procedimento Operacional ICP-MS Varian 820-MS IT/LEI/PL/027-Operação do Digestor de Microondas Anton Paar Multiwave 3000 e Multiwave Pro POP/LEI/PL/002-Controle de amostras e emissão de resultados POP/LEI/PL/004-Controle de padrões e soluções padrão POP/LEI/PL/005-Controle de amostras brancas e amostras naturalmente contaminadas POP/LEI/PL/006-Controle de reagentes e soluções reagentes POP/LEI/PL/009-Garantia da qualidade de resultados de análise POP/LEI/PL/010-Controle de micropipetas POP/LEI/PL/011-Requisitos para validação de métodos de ensaio de elementos inorgânicos 11.0 Anexos referenciados FOR/LEI/PL/014-Registros de Amostras e Resultados de Análises do PNCR - Grupo 400 FOR/LEI/PL/051-Dados brutos de análises por ICP-MS PLN/LEI/PL/001-Cálculo de concentrações de As, Pb e Cd em ppb 12.0 Informações de registro Cálculo de concentrações de As, Pb e Cd em ppb (PLN/LEI/PL/001) Dados brutos de análises por ICP - MS (FOR/LEI/PL/051) Registro de Amostras e Resultados de Análises do PNCR - Grupo 400 (FOR/LEI/PL/014) 13.0 Arquivos anexados Não aplicável 14.0 Controle de alterações Item Alteração 6.3.3. Reformulado 6.3.4. Inclusão de item que descreve a preparação das amostras para estimativa de recuperação Inclusão do Quadro 1 6.3.5. Era o item 6.3.4. 6.3.6. Era o item 6.3.5. 6.3.7. Era o item 6.3.6 7.2 Quadro 1 foi alterado para Quadro 2 Quadro 2 foi alterado para Quadro 3 Impresso por: Natanael Viana Lourenço Cópia não controlada Página 12/12