Aplicações das técnicas moleculares

Aplicações das técnicas moleculares

Genética direta e reversa A abordagem tradicional para o estudo da função gênica começa com o isolamento de organismos mutantes. Por ex., busca de genes que afetam a função cardíaca nos mamíferos. Uma primeira etapa seria encontrar indivíduos, talvez camundongos, que tenham defeitos hereditários na função cardíaca.

Genética direta e reversa As mutações responsáveis pelos problemas cardíacos nos camundongos poderiam ser mapeadas e os genes envolvidos poderiam ser isolados e sequenciados. As proteínas produzidas pelos genes poderiam ser previstas a partir das sequências de genes e isoladas. A bioquímica das proteínas poderia ser estudada e seu papel na função cardíaca compreendido. Esta abordagem é chamada de genética direta.

Genética direta e reversa Uma abordagem alternativa é começar com um genótipo, uma sequência de DNA, e continuar com o fenótipo ao alterar a sequência ou inibir sua expressão. Pode começar com um gene de função desconhecida, induzir mutações nele e então observar que efeito estas mutações têm no fenótipo do organismo. Esta abordagem é chamada de genética reversa. Atualmente, ambas as abordagens de genética direta e reversa são muito usadas para análises de função dos genes. (PIERCE )

Criação de mutações aleatórias Mutações que surgiam naturalmente, são raras e podem ser detectadas apenas se forem examinados muitos organismos. A descoberta de agentes mutagênicos forneceu meios para aumentar o número de mutações nas populações experimentais. Um dos primeiros exemplos foi o uso de raios X por Hermann Muller em 1927 para induzir mutações ligadas ao X na Drosophila melanogaster. Ganhou o Nobel de Fisiologia em 1946

Criação de mutações aleatórias Atualmente, usam-se radiação, mutágenos químicos e elementos de transposição para criar mutações para análise genética. Para determinar todos os genes que poderiam afetar um fenótipo, é desejável criar mutações em tantos genes quanto possível, ou seja, saturar o genoma com mutações. (PIERCE)

Exemplo Para induzir mutações no fungo Aspergillus nidulans, esporos são submetidos à ação da luz ultravioleta e analisados para a detecção de mutantes morfológicos e mutantes revertentes para marcas auxotróficas. Mutante auxotrófico é aquele incapaz de crescer em Meio de Cultura contendo apenas uma fonte de carboidratos e sais minerais, portanto, sem adição de vitaminas, aminoácidos ou ácidos nucleicos.

Mutagênese sítio dirigida A genética reversa depende da capacidade de criar mutações, não aleatoriamente, mas em sequências de DNA específicas e depois estudar os efeitos destas mutações no organismo. As mutações são induzidas em locais específicos por meio de um processo chamado de mutagênese direcionada pelo sítio. Em bactérias, é possível cortar uma sequência curta de nucleotídios com enzimas de restrição e substituir com um oligonucleotídio curto sintético que tenha a sequência mutante desejada. O sucesso deste método depende da disponibilidade dos sítios de restrição flanqueadores da sequência a ser alterada.

Mutagênese sítio dirigida Pode ser usada a mutagênese direcionada por oligonucleotídio. Neste método, é produzido um oligonucleotídio de fita única diferente da sequência-alvo em uma ou algumas bases. Como eles diferem em apenas algumas bases, o DNA-alvo e o oligonucleotídio vão parear. Ao parear com o DNA-alvo, o oligonucleotídio pode agir como primer ao iniciar a síntese de DNA, que produz uma molécula de fita dupla com um pareamento errado na região do primer. (PIERCE)

Exemplo: Mutagênese sítio dirigida Objetivo: analisar o efeito de mutações em parâmetros da cinética enzimática.

Foi utilizado o vetor pgs, que contém a região codificadora do gene BCHE. As trocas de nucleotídeos detectadas nas variantes K12R, G75R, V294M, G333C e R470W foram introduzidas no vetor através de mutagênese sítio-dirigida. Para isso foi utilizada a metodologia de PCR em duas etapas.

A primeira PCR contou com um iniciador mutagênico, contendo a substituição em questão, e um outro iniciador que hibridava no início ou no final do gene BCHE, dependendo da localização da mutação. Essa PCR visava à produção de um fragmento, cujo tamanho variou de 200 a 412 pb entre as diferentes variantes, e que serviu como um mega iniciador para a segunda PCR.

1) vetor com a mutação 2) vetor sem a mutação

Animais transgênicos Outra forma que pode ser usada para analisar a função do gene é adicionar sequências de DNA de interesse ao genoma de um organismo que normalmente não tem tais sequências e então observar o efeito que a sequência introduzida tem sobre o fenótipo do organismo.

Aplicações: Doença de Alzheimer Fonte: Sasaguri et al. (2017)

Aplicações: Doença de Alzheimer Fonte: Sasaguri et al. (2017)

Aplicações: Doença de Alzheimer Fonte: Sasaguri et al. (2017)

Camundongos knockout Uma variante útil da abordagem transgênica é produzir camundongos nos quais um gene normal não sofreu apenas uma mutação, mas foi totalmente desativado. Estes animais, chamados de camundongos knockout, são particularmente úteis para determinar a função de um gene: um genótipo do camundongo knockout fornece uma boa indicação da função do gene ausente (PIERCE)

A superexpressão de BChE leva a baixos níveis de grelina na corrente sanguínea e reduz a agressão e o estresse social em camundongos

Brimijoin et al (2016)

Referências PIERCE, Benjamin A.. Genética - Um Enfoque Conceitual, 5ª edição. Guanabara Koogan, 04/2016. VitalBook file. Souza, Mikami, Maegawa, & Chautard-Freire-Maia. (2005). Four new mutations in the BCHE gene of human butyrylcholinesterase in a Brazilian blood donor sample. Molecular Genetics and Metabolism, 84(4), 349-353. Mikami, L. R., Wieseler, S. L., Souza, R. M., Schopfer, L. A., Lockridge, O., & Chautard-Freire-Maia, E. (2007). Expression of three naturally occurring genetic variants (G75R, E90D, I99M) of the BCHE gene of human butyrylcholinesterase. Pharmacogenetics and Genomics, 17(9), 681-685. Sasaguri, H., Nilsson, P., Hashimoto, S., Nagata, K., Saito, T., De Strooper, B.,... Saido, T. (2017). APP mouse models for Alzheimer's disease preclinical studies. EMBO Journal, 36(17), 2473-2487. Duysen, Li, Darvesh, & Lockridge. (2007). Sensitivity of butyrylcholinesterase knockout mice to ( )- huperzine A and donepezil suggests humans with butyrylcholinesterase deficiency may not tolerate these Alzheimer's disease drugs and indicates butyrylcholinesterase function in neurotransmission. Toxicology, 233(1), 60-69. Li, B., Duysen, E., Carlson, M., & Lockridge, O. (2008). The butyrylcholinesterase knockout mouse as a model for human butyrylcholinesterase deficiency. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 324(3), 1146-54. Brimijoin, Chen, Pang, Geng, & Gao. (2016). Physiological roles for butyrylcholinesterase: A BChEghrelin axis. Chemico-Biological Interactions,259(Pt B), 271-275.