(21) PI 0809321-0 A2 [UI III II I 111111 3t;e1 },:iblins ederufi af11-: Erx.41 Sr:44~ c+ 4::,_,: -,141:: ::f2',14,7,1 :".r. :;Ni4,.,44, (22) Data de Depósito: 25/03/2008 (51)!M.a.: (43) Data da Publicação: 23/09/2014 CO7K 14/235 ( R P I 2281) C12N 9/16 (54) Título: POLIPEPTÍDEO, SEQUÊNCIA DE ÁCIDO (57) Resumo: NUCLEICO, CONSTRUÇÃO DE ÁCIDO NUCLEICO, VETOR DE EXPRESSÃO, VETOR DE INATIVAÇÃO, CÉLULA HOSPEDEIRA, LIPOPOLISSACARÍDEO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, E, USOS DA CÉLULA HOSPEDEIRA E/OU DO LIPOPOLISSACARÍDEO, E DO POLIPEPTÍDEO E/OU DA SEQUÊNCIA DE ÁCIDO NUCLEICO (30) Prioridade Unionista: 26/03/2007 EP 07104885.4 (73) Titular(es): De Staat Der Nederlanden, Vert. Door de Minister Van VWS (72) Inventor(es): Jeroen Johannes Gerardus Geurtsen, Johannes Petrus Maria Tommassen, Peter André Van Der Ley (74) Procurador(es): Momsen, Leonardos & CIA. (86) Pedido Internacional: PCT NL2008050169 de 25/03/2008 (87) Publicação Internacional: WO 2008/118015de 02/10/2008
1 "POLIPEPTÍDEO, SEQUÊNCIA DE ÁCIDO NUCLEICO, CONSTRUÇÃO DE ÁCIDO NUCLEICO, VETOR DE EXPRESSÃO, VETOR DE INATIVAÇÃO, CÉLULA HOSPEDEIRA, LIPOPOLISSACARtDEO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, E, USOS DA CÉLULA HOSPEDEIRA 5 E/OU DO LIPOPOLISSACARÍDEO, E DO POLIPEPTÍDEO E/OU DA SEQUÊNCIA DE ÁCIDO NUCLEICO" Campo da invenção A invenção diz respeito a uma vacina melhorada contra coqueluche que compreende mutantes de Bordetella pertussis tendo uma 10 molécula de LPS modificada e/ou as moléculas de LPS obteníveis destes mutantes. Estes mutantes e/ou as molécula de LPS obteníveis podem ser usadas ainda como um adjuvante. Fundamentos da invenção LPS é uma molécula anfifílica localizada no folíolo externo da 15 membrana externa de bactérias Gram negativas. LPS possui tanto atividade endotóxica quanto atividade adjuvante. Ambas as propriedades são fundamentadas no seu reconhecimento pelo complexo de receptor TLR4/MD- 2 hospedeiro (revisado em Palsson-McDermott e O'Neill, 2004; O'Neill, 2006). LPS consiste de três domínios estruturais distintos: Lipídeo A, o 20 núcleo, e o antígeno O. O Lipídeo A funciona como uma âncora de membrana hidrofóbica e forma o componente bioativo da molécula (Takada e Kotani, 1989). A região de núcleo consiste de um oligossacarídeo complexo, que, quando comparado com o antígeno O, mostra apenas variabilidade estrutural limitada. Em algumas bactérias, por exemplo, Enterobacteriaceae, o 25 oligossacarídeo de núcleo (OS de núcleo) pode ser dividido em um núcleo interno e um núcleo externo. O núcleo externo primariamente consiste de hexoses piranosídicas, por exemplo, D-glicose, D-galactose, e D-glicosamina, ao passo que o núcleo interno primariamente consiste de ácidos octulosônicos e heptopiranoses. Na vasta maioria das bactérias Gram-negativas, o domínio
2 de núcleo é conectado ao domínio do lipídeo A por um carboidrato específico, o ácido 2-ceto-3-desoxioctulosônico (Kdo) (Raetz e Whitfield, 2002). O antígeno O compreende a parte mais variável do LPS e confere especificidade sorotípica às bactérias. Este é composto de subunidades de repetição de 5 açúcar de um a oito açúcares. Cada cadeia O pode conter até 50 destas subunidades. O antígeno O foi implicado na fuga imune bacteriana, especialmente a fuga da lise mediada por complemento sérico (Raetz e Whitfield, 2002). Ao contrário dos LPS de Bordetella bronchiseptica e 10 Bordetella parapertussis, o LPS de Bordetella pertussis nunca contém um domínio do antígeno O (Peppler, 1984; Di Fabio et al., 1992). Portanto, o LPS da B. pertussis é frequentemente aludido como lipooligossacarídeo. A B. pertussis produz duas formas de LPS dominantes, LPS de faixa A e faixa B (Peppler, 1984). O LPS de faixa B é composta de lipídeo A e um 15 oligossacarídeo de núcleo consistindo de 9 carboidratos (Caroff et al., 2000). A adição de um trissacarídeo terminal, consistindo de N-acetil glicosamina, ácido 2,3-diacetamido-2,3-didesóxi-manurônico e 2-acetamido-4-N-metil-2,4- didesóxi-fucose, ao LPS da faixa B forma o LPS aludido como faixa A. Na Escherichia coli e Salmonella enterica sorovar 20 Typhimurium, o grupo de gene da biossíntese de OS de núcleo consiste de três operons, designados os operons gmhd, waaq e WaaA. O operon gmhd consiste de quatro genes, gmhd e waafcl, que estão envolvidos na síntese do núcleo interno (Schnaitman e Klena, 1993). Os genes gmhd, waaf e waac codificam proteínas envolvidas na biossíntese e transferência de Heptoses I e 25 II para Kdo 2-lipídeo A (Schnaitman e Klena, 1993), ao passo que o produto do gene waal é uma ligase que está envolvida na ligação do antígeno O (MacLachlan et al., 1991). O operon waaq é o maior dos três operons e codifica proteínas que estão envolvidas na biossíntese do núcleo externo e na modificação/decoração do núcleo OS. O número e tipos de genes presentes
3 dentro no operon waaq diferem por cepa, o que explica as diferenças específicas de cepa na composição do núcleo (Heinrichs et al., 1998). O operon WaaA frequentemente codifica apenas uma proteína, KdtA. Apenas na K-12 da E. coli, uma matriz de leitura aberta (ORF) não relacionada com o 5 LPS adicional está presente (Raetz e Whitfield, 2002). O gene kcita de Enterobacteriaceae codifica a Kdo transferase bifuncional que adiciona os dois resíduos Kdo na biossíntese de Kdo 2-lipídeo A (Clementz e Raetz, 1991). Embora o OS de núcleo de Bordetella e E. coli mostrem alguma semelhança, a composição e configuração exatas dos resíduos 10 demonstram diferenças acentuadas. Por exemplo, o OS de núcleo de Bordetella contém apenas um resíduo Kdo, ao invés dos dois ou três resíduos que são encontrados na maioria das outras bactérias Gram negativas, incluindo a E. coli. Recentemente, isto foi mostrado ser devido ao funcionamento de KdtA de Bordetella como uma Kdo transferase 15 monofuncional, ao invés de como uma bifuncional (Isobe et al., 1999). As enzimas responsáveis pela síntese da porção remanescente do OS de núcleo de Bordetella são correntemente desconhecidas e aguardam identificação adicional. Embora a sua parte de lipídeo A seja no geral observada como 20 o determinante principal para a atividade biológica do LPS através da ativação do complexo receptor TLR4/MD-2, a região de oligossacarídeo também pode desempenhar um papel importante na sua interação com as células que apresentam antígeno (APCs). Os receptores implicados neste tipo de reconhecimento de LPS incluem o receptor de complemento CR3 e o 25 receptor descontaminador SR-A (van Amersfoort et al., 2003; Pluddemann et al., 2006). Diversas vacinas de Bordetella pertussis já foram usadas. A introdução das vacinas contra a coqueluche (wp) de célula inteira nos idos de 1940 e 1950 e mais tarde das vacinas contra a coqueluche acelulares (ap) nos
4 idos de 1980 e 1990, levou a um declínio gradual na incidência da coqueluche e morbidez e mortalidade reduzida da doença em níveis baixos. A despeito da alta cobertura da vacinação, a doença da coqueluche tem permanecida endêmica e mantida mostrando um padrão cíclico com picos em incidência a 5 cada 2 a 5 anos. Durante as últimas duas décadas, diversos países, incluindo os Países Baixos, experimentaram aumentos nos números de casos de coqueluche relatados. De modo interessante, em algumas áreas, uma mudança na distribuição da idade também foi observada. Ao passo que na fase da prévacinação e vacina inicial os casos de coqueluche foram predominantemente 10 relatados em crianças jovens, adultos e adolescentes foram responsáveis por urna proporção crescente dos casos em anos recentes. Diversas razões para a re-emergência da coqueluche relatada foram propostas, incluindo: (1) mudanças genéticas nas cepas de B. pertussis circulantes que diminuíram a eficácia da vacina, (2) potência reduzida das vacinas contra a coqueluche, (3) 15 imunidade decrescente, (4) relatos aumentados de casos de coqueluche e (5) o diagnóstico melhorado de doença da coqueluche. Portanto, existe ainda uma necessidade quanto a novas vacinas contra Bordetella pertussis que não exiba todas as desvantagens das vacinas existentes. 20 Descrição da invenção A presente invenção está fundamentada na hipótese de que mutantes de B. pertussis com uma cadeia de oligossacarídeo alterada poderiam ser afetados na sua interação com as células dendríticas (DC)s. O alvejamento específico das células que apresentam antígeno (APC)s, tais 25 como DCs, de modo concebível afetaria a consequência da resposta imune contra uma vacina contra a coqueluche de célula inteira. Como uma primeira etapa para a melhora das vacinas de célula inteira por esta via, nós agora identificamos um grupo de genes envolvidos na biossíntese de oligossacarídeo de LPS em B. pertussis. Especialmente dois genes dentro
5 deste grupo quando inativados ou superexpressados dão mutantes tendo uma potencialidade melhorada para interagir com DC e ativá-la. Polipeptídeos Em um primeiro aspecto, a invenção fornece dois 5 polipeptídeos. O primeiro polipeptídeo é uma polissacarídeo desacetilase e tem uma sequência de aminoácido com pelo menos 50 % de identidade com a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 1. O segundo polipeptídeo é uma glicosil transferase e tem uma 10 sequência de aminoácido com pelo menos 50 % de identidade com a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 2. A atividade da polissacarídeo desacetilase respectivamente do polipeptídeo da glicosil transferase é preferivelmente avaliada pela super expressão respectivamente inativando o respectivo gene codificado em uma 15 cepa de Bordetella pertussis como mais tarde aqui definida e analisando o LPS obtenível. Quando o LPS produzido pela cepa de Bordetella pertussis transformada compreende pelo menos quantidades detectáveis do LPS da invenção como mais tarde aqui definido, a polissacarídeo desacetilase, respectivamente os polipeptídeos da glicosil transferase poderiam ser ditos 20 serem ativos e funcionais. Quantidades detectáveis de LPS são preferivelmente detectáveis como descrito nos exemplos: depois da isolação com a extração em fenol/água quentes (Westphal e Jann, 1965), a O- desacilação pela hidrólise branda (Hoist 2000) e a análise pela ESI-MS (Espectrometria de massa por eletropulverização-ionização) no modo de íon 25 negativo. De acordo com uma forma de realização ainda mais preferida, o polipeptídeo tem pelo menos 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 % ou 85 %, ainda mais preferivelmente pelo menos 90 %, 92 %, 95 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade com a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 1.
6 Em uma forma de realização mais preferida, a polissacarídeo desacetilase tem a SEQ ID NO: 1. Esta polissacarídeo desacetilase origina-se da Bordetella pertussis. A sequência de ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 1 é dada na SEQ ID NO: 3. 5 De acordo com uma outra forma de realização ainda mais preferida, o polipeptídeo tem pelo menos 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 % ou 85 %, ainda mais preferivelmente pelo menos 90 %, 92 %, 95 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade com a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 2. Em uma forma de realização preferida, a glicosil transferase tem a 10 SEQ ID NO: 2. Esta glicosil transferase origina-se da Bordetella pertussis. A sequência de ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 2 é dada na SEQ ID NO: 4. A porcentagem de identidade é calculada como o número de resíduos de aminoácido idênticos entre as sequências alinhadas dividido pelo 15 comprimento das sequências alinhadas menos o comprimento de todos os intervalos. O alinhamento de sequência múltipla foi realizado usando o programa de alinhamento ótimo DNAman 4.0 usando os ajustes de default. O alinhamento é usualmente realizado entre as sequências identificadas pela sua SEQ ID NO ou partes destas. Preferivelmente, o alinhamento é realizado 20 usando sequências identificadas pela sua SEQ ID NO. A pessoa habilitada entenderá que os polipeptídeos da presente invenção poderiam ser obtidos de outros organismos que não a Bordetella pertussis contanto que eles tenham a atividade e identidade requeridas. Em uma forma de realização preferida, cada polipeptídeo como identificado 25 acima é obtido de uma espécie de Bordetella tal como a pertussis, bronchiseptica, parapertussis. Mais preferivelmente, cada polipeptídeo como identificado acima é obtido de Bordetella pertussis. Uma única cepa de Bordetella pertussis ou várias cepas distintas de Bordetella pertussis podem ter diversos polipeptídeos homólogos de acordo com a presente invenção.
7 De acordo com uma outra forma de realização preferida, o polipeptídeo da invenção, é uma variante de qualquer uma das sequências de polipeptídeo como definidas antes. Um polipeptídeo variante pode ser uma forma que não ocorre naturalmente do polipeptídeo. Uma variante de 5 polipeptídeo pode diferir em algum modo engendrado do polipeptídeo isolado de sua fonte nativa. Uma variante pode ser fabricada pela mutagênese locodirigida partindo da sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 1 ou da SEQ ID NO: 2 ou da sequência de ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 1, que é a SEQ ID NO: 3, ou da sequência de 10 ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 2, que é a SEQ ID NO: 4. Preferivelmente, a variante de polipeptídeo contém mutações que não alteram a função biológica do polipeptídeo codificado. A função biológica ou a atividade da polissacarídeo desacetilase ou da glicosil transferase já foram aqui definidas. 15 Em um outro aspecto da invenção, é fornecido uma polissacarídeo desacetilase, respectivamente uma glicosil transferase como mais no princípio definidas ambas sendo para o uso na preparação de um medicamento. Preferivelmente o dito medicamento é uma vacina ou um adjuvante como mais tarde aqui definido. 20 Sequências de ácido nucleico Em um segundo aspecto da invenção, são fornecidos duas sequências de ácido nucleico. O primeiro codifica uma polissacarídeo desacetilase tendo uma sequência de aminoácido com pelo menos 50 % de identidade com a 25 sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 1, preferivelmente tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 1, e/ou originando de uma espécie de Bordetella, preferivelmente Bordetella pertussis. A primeira sequência de ácido nucleico é preferivelmente uma sequência de ácido nucleico tendo pelo menos 50 % de identidade com a
8 sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 3. Preferivelmente, a identidade é de pelo menos 55 %, mais preferivelmente pelo menos 60 %, mais preferivelmente pelo menos 65 %, mais preferivelmente pelo menos 70 %, mais preferivelmente pelo menos 75 %, mais preferivelmente pelo menos 80 5 %, mais preferivelmente pelo menos 85 %, mais preferivelmente pelo menos 90 %, ainda mais preferivelmente pelo menos 95 %, ainda mais preferivelmente pelo menos 98 % e ainda mais preferivelmente pelo menos 99 %. O mais preferivelmente, a sequência de ácido nucleico tem a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 3 corresponde a NP 8809668. 10 A segunda sequência de ácido nucleico codifica uma glicosil transferase tendo uma sequência de aminoácido com pelo menos 50 % de identidade com a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 2, preferivelmente tendo a sequência de aminoácido SEQ ID NO: 2, e/ou que se origina de uma espécie de Bordetella, preferivelmente Bordetella pertussis. 15 A segunda sequência de ácido nucleico é preferivelmente uma sequência de ácido nucleico tendo pelo menos 50 % de identidade com a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 4. Preferivelmente, a identidade é de pelo menos 55 %, mais preferivelmente pelo menos 60 %, mais preferivelmente pelo menos 65 %, mais preferivelmente pelo menos 70 %, 20 mais preferivelmente pelo menos 75 %, mais preferivelmente pelo menos 80 %, mais preferivelmente pelo menos 85 %, mais preferivelmente pelo menos 90 %, ainda mais preferivelmente pelo menos 95 %, ainda mais preferivelmente pelo menos 98 % e ainda mais preferivelmente pelo menos 99 %. O mais preferivelmente, a sequência de ácido nucleico tem a sequência 25 de ácido nucleico da SEQ ID NO: 4 corresponde a NP 8809669. A porcentagem de identidade foi determinada calculando-se a razão do número de nucleotídeos idênticos na sequência dividida pelo comprimento dos nucleotídeos totais menos os comprimentos de quaisquer intervalos. O alinhamento de sequência múltipla de DNA foi realizado usando
9 DNAman versão 4.0 usando o programa Optimal Alignment (Fuil Alignment). O comprimento mínimo de uma sequência de DNA relevante que mostra nível de identidade de 50 % ou mais alto deve ser de 40 nucleotídeos ou mais longo. O alinhamento é usualmente realizado entre as sequências 5 identificadas pela sua SEQ ID NO ou partes destas. Preferivelmente, o alinhamento é realizado usando sequências identificadas pela sua SEQ ID NO. De acordo com uma outra forma de realização preferida, a sequência de ácido nucleico da invenção é uma variante de qualquer uma das 10 sequências de ácido nucleico como definido acima. As variantes de sequência de ácido nucleico podem ser usadas para preparar variantes de polipeptideo como definido mais no princípio. Uma variante de ácido nucleico pode ser um fragmento de qualquer uma das sequências de ácido nucleico como definido acima. Uma variante de ácido nucleico também pode ser uma sequência de 15 ácido nucleico que difere da SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4 em virtude da degenerescência do código genético. Uma variante de ácido nucleico também pode ser uma variante alélica da SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4. Uma variante alélica denota qualquer uma de duas ou mais formas alternativas de um gene que ocupa o mesmo local cromossoma. Uma variante de ácido 20 nucleico preferida é uma sequência de ácido nucleico, que contém mutação(ões) silenciosa(s). Alternativamente ou em combinação, uma variante de ácido nucleico também pode ser obtida pela introdução de substituições de nucleotídeo, que não dão origem a uma outra sequência de aminoácido do polipeptideo codificado pela sequência de ácido nucleico, mas 25 que corresponde ao uso de códon do organismo hospedeiro intencionado para a produção do polipeptideo da invenção. De acordo com uma forma de realização preferida, a variante de ácido nucleico codifica um polipeptideo que ainda exibe a sua função biológica como mais no princípio aqui definida. Mais preferivelmente, a variante da sequência de ácido nucleico codifica um
10 polipeptídeo que exibe a atividade de polissacarídeo desacetilase ou glicosil transferase respectivamente. As sequências de ácido nucleico que codificam um tal polipeptídeo pode ser isolado de qualquer microorganismo. Todas estas variantes podem ser obtidas usando técnicas 5 conhecidas pela pessoa habilitada, tal como a triagem de biblioteca pela hibridização (procedimentos de southern blotting) sob condições de hibridização de baixa para média para alta para a sequência de ácido nucleico SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4 ou um variante destas que podem ser usadas para planejar uma sonda. As condições de severidade baixa para média para 10 alta significa pré-hibridização e hibridização a 42 C em 5X SSPE, 0,3 % de SDS, 200 pg/ml de DNA de esperma de salmão cisalhado e desnaturado e 25 % 35 % ou 50 % de formamida para severidades baixa a média a alta respectivamente. Subsequentemente, a reação de hibridização é lavada três vezes por 30 minutos cada usando 2X SSC, 0,2 % de SDS e 55 C, 65 C ou 15 75 C para severidades de baixa a média a alta. A informação de sequência como aqui fornecida não deve ser tão estreitamente interpretada como para requerer a inclusão de bases erroneamente identificadas. A pessoa habilitada é capaz de identificar tais bases erroneamente identificadas e sabe como corrigir quanto a tais erros. 20 Em um outro aspecto da invenção, é fornecido um ácido nucleico que codifica uma polissacarídeo desacetilase, respectivamente uma glicosil transferase como mais no princípio definida ambos ácidos nucleicos sendo para o uso para preparar um medicamento. Preferivelmente o dito medicamento é uma vacina ou um adjuvante como mais tarde aqui definido. 25 Construção de ácido nucleico Em um outro aspecto, a invenção diz respeito a uma construção de ácido nucleico que compreende qualquer uma das sequências de ácido nucleico definidas na seção precedente, a dita sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo que exibe:
11 - atividade de polissacarídeo e tendo urna sequência de aminoácido que tem pelo menos 50 % de identidade com a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 1 ou - atividade de glicosil transferase e tendo uma sequência de 5 aminoácido que tem pelo menos 50 % de identidade com a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 2. Opcionalmente, a sequência de ácido nucleico presente na construção de ácido nucleico é operavelmente ligada a uma ou mais sequências de controle, que direcionam a produção do polipeptídeo em um 10 hospedeiro de expressão adequado. Operavelmente ligada é aqui definido como uma configuração em que uma sequência de controle é apropriadamente colocada em uma posição relativa à sequência de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo da invenção tal que a sequência de controle direciona a produção do polipeptídeo 15 da invenção. A expressão será entendida incluir qualquer etapa envolvida na produção do polipeptídeo incluindo, mas não limitada à transcrição, modificação pós-transcricional, tradução, modificação pós-translacional e secreção. 20 A construção de ácido nucleico é definida como uma molécula de ácido nucleico, que é isolada de um gene que ocorre naturalmente ou que foi modificado para conter segmentos de ácido nucleico que são combinados ou justapostos em uma maneira que de outro modo não existiria na natureza. Sequência de controle é aqui definida incluir todos os 25 componentes, que são necessários ou vantajosos para a expressão de um polipeptídeo. Em um mínimo, as sequências de controle incluem um promotor e sinais de parada de transcricional e translacional. Vetor de expressão A invenção diz respeito ainda a um vetor de expressão que
12 compreende uma construção de ácido nucleico que compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo que exibe a atividade da polissacarídeo desacetilase e tendo uma sequência de aminoácido que tem pelo menos 50 % de identidade com a sequência de aminoácido da 5 SEQ ID NO: 1 como definida na seção precedente. Preferivelmente, o vetor de expressão compreende a dita sequência de ácido nucleico, que é operavelmente ligada a uma ou mais sequências de controle, que direciona a produção do polipeptídeo codificado em um hospedeiro de expressão adequado. Em um mínimo as sequências de controle incluem um promotor e 10 sinais de parada transcricional e translacional. O vetor de expressão pode ser observado como um vetor de expressão recombinante. O vetor de expressão pode ser qualquer vetor (por exemplo, plasmático, viral), que possa ser convenientemente submetido aos procedimentos de DNA recombinante e possa realizar a expressão da sequência de ácido nucleico que codifica o 15 polipeptídeo. Dependendo da identidade do hospedeiro em que este vetor de expressão será introduzido e da origem da sequência de ácido nucleico da invenção, a pessoa habilitada saberá como escolher o vetor de expressão e as sequências de controle mais adequadas. As células hospedeiras mais preferidas são apresentadas na seção intitulada células hospedeiras. 20 No contexto da invenção, um vetor de expressão quando introduzido em uma célula hospedeira levará a uma célula tendo um nível de expressão aumentado da sequência de ácido nucleico presente no vetor de expressão, e/ou um nível de expressão aumentado do polipeptídeo codificado pela sequência de ácido nucleico presente no vetor de expressão e/ou um nível 25 de atividade aumentado do polipeptídeo codificado pela sequência de ácido nucleico presente no vetor de expressão. Neste contexto, o aumento é avaliado pela comparação com a célula hospedeira que não compreende o dito vetor de expressão e/ou com a célula hospedeira que não compreende um polipeptídeo endógeno tendo pelo menos 50 % de identidade com a SEQ ID
13 NO: I. Em um outro aspecto da invenção, é fornecido um vetor de expressão como mais no princípio definido sendo para o uso para preparar um medicamento. Preferivelmente o dito medicamento é uma vacina ou um 5 adjuvante como mais tarde aqui definidos. Vetor de inativação A invenção diz respeito ainda a um vetor de inativação que compreende uma construção de ácido nucleico que compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo que exibe atividade 10 de glicosil transferase e tendo uma sequência de aminoácido que tem pelo menos 50 % de identidade com a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 2 como definida na seção precedente. Um vetor de inativação é planejado para diminuir ou inativar a expressão da sequência de ácido nucleico que tem pelo menos 50 % de identidade com a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 2 15 em um dado hospedeiro. O vetor de inativação pode ser observado como um vetor de expressão recombinante. O vetor de inativação pode ser qualquer vetor (por exemplo, plasmático, viral), que possa ser convenientemente submetido aos processos de DNA recombinante e possa realizar a inativação da expressão da 20 sequência de ácido nucleico como definido acima. Dependendo da identidade do hospedeiro no qual este vetor de inativação será introduzido e da origem da sequência de ácido nucleico da invenção, a pessoa habilitada saberá como escolher o vetor de inativação mais adequado. As células hospedeiras mais preferidas são apresentadas na seção intitulada células hospedeiras. 25 No contexto da invenção, um vetor de inativação quando introduzido em uma célula hospedeira levará a uma célula tendo um nível de expressão diminuído (ou rebaixado) da sequência de ácido nucleico presente no vetor de expressão e/ou um nível de expressão diminuído do polipeptídeo codificado pela sequência de ácido nucleico presente no vetor de expressão
14 e/ou um nível de atividade diminuído do polipeptídeo codificado pela sequência de ácido nucleico presente no vetor de expressão. Neste contexto, a diminuição é preferivelmente avaliada pela comparação com a célula hospedeira que não compreende o dito vetor de inativação. 5 A diminuição do nível de expressão do polipeptídeo que exibe atividade de glicosil transferase e tendo uma sequência de aminoácido que tenha pelo menos 50 % de identidade com a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 2 e/ou o rebaixamento do seu nível de atividade pode ter sido obtido pelos métodos convencionais conhecidos na técnica, tais como pela inativação 10 ou regulagem negativa da expressão da sequência de ácido nucleico endógena que codifica a dita glicosil transferase no hospedeiro. Esta inativação ou regulagem negativa podem ter sido obtidas pela deleção de uma ou mais nucleotídeos na sequência de ácido nucleico que codifica o dito polipeptídeo. Em uma outra forma de realização, a invenção diz respeito a um hospedeiro, 15 preferivelmente uma Bordetella que tenha uma mutação na sua sequência de ácido nucleico que codifica a dita glicosil transferase. Preferivelmente para construir um hospedeiro tendo uma sequência de ácido nucleico inativada que codifique uma glicosil transferase, um vetor de substituição ou inativação é preparado e é subsequentemente introduzido no hospedeiro pela 20 transformação. A pessoa habilitada saberá como construir um tal vetor. Alternativamente ou em combinação com a inativação da sequência de ácido nucleico endógena que codifica a glicosil transferase, a expressão da sequência de ácido nucleico que codifica a glicosil transferase pode ser rebaixada fundindo-a a um promotor fraco adequado para a 25 expressão da proteína em nível baixo no organismo selecionado. Alternativamente ou em combinação com a inativação da sequência de ácido nucleico que codifica a glicosil transferase endógena, a expressão da sequência de ácido nucleico que codifica a glicosil transferase pode ser tornada indutível fundindo-a a um promotor indutível adequado para
15 a expressão de proteína de nível indutível no organismo selecionado. Alternativamente ou em combinação com as formas de realização preferidas anteriormente definidas, a inativação da sequência de ácido nucleico que codifica a glicosil transferase endógena é preferivelmente 5 obtida pelo uso de um vetor suicida. Mais preferivelmente, o vetor suicida é pss1129 (Stibitz et al, 1994). Em um outro aspecto da invenção, é fornecido um vetor de inativação como mais no princípio definido para o uso para preparar um medicamento. Preferivelmente o dito medicamento é uma vacina ou um 10 adjuvante como mais tarde aqui definido. Célula hospedeira Em um outro aspecto, a invenção fornece uma célula hospedeira que compreende o vetor de expressão da invenção e/ou o vetor de inativação da invenção ambos como definidos nas seções precedentes. A 15 escolha da célula hospedeira em uma grande proporção dependerá da fonte da sequência de ácido nucleico da invenção. Dependendo da identidade da célula hospedeira, a pessoa habilitada saberá como transformá-la com a construção ou vetor da invenção. A célula hospedeira pode ser qualquer célula microbiana, 20 procariótica ou eucariótica, que é adequado para a expressão do LPS da invenção. Em uma forma de realização preferida, a célula hospedeira é uma espécie de Bordetella como mais no princípio mencionado. Mais preferivelmente, a Bordetella é uma Bordetella pertussis. Os procedimentos adequados para a transformação de 25 Bordetella pode envolver um processo que compreende a conjugação em uma maneira conhecida pela pessoa habilitada. Os procedimentos de transformação adequados para Bordetella são descritos em Stibitz et al, 1994. De acordo com uma primeira forma de realização preferida, a célula hospedeira consequentemente obtida tem um nível de expressão
16 aumentado da sequência de ácido nucleico presente no vetor de expressão, e/ou tem um nível de expressão aumentado do polipeptídeo codificado pela sequência de ácido nucleico presente no vetor de expressão e/ou tem um nível de atividade aumentado do polipeptídeo codificado pela sequência de ácido 5 nucleico presente no vetor de expressão. Nesta forma de realização, a sequência de ácido nucleico presente na construção de expressão codifica um polipeptídeo tendo pelo menos 50 % de identidade com a SEQ ID NO: 1. Neste contexto, o aumento é avaliado pela comparação com a célula hospedeira que não compreende o dito vetor de expressão e/ou com a célula 10 hospedeira que não compreende um polipeptídeo endógeno tendo pelo menos 50 % de identidade com a SEQ ID NO: 1 quando ambos cultivados e/ou ensaiados sob as mesmas condições. "Aumenta o nível de expressão do polipeptideo" é aqui preferivelmente definido como produzindo mais do polipeptídeo como mais 15 no principio definido do que a célula hospedeira precursora da qual a célula hospedeira transformada deriva produzirá quando ambos os tipos de células (células precursora e transformada) são cultivadas sob as mesmas condições. Preferivelmente, a célula hospedeira da invenção produz pelo menos 3 %, 6 %, 10 % ou 15 % mais do polipeptídeo da invenção tendo pelo menos 50 % 20 de identidade com a SEQ ID NO: 1 do que a célula hospedeira precursora da qual a célula hospedeira transformada deriva produzirá quando ambos os tipos de células (células precursora e transformada) são cultivadas sob as mesmas condições. Também hospedeiros que produzem pelo menos 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 % ou 150 % mais do dito polipeptídeo 25 do que a célula precursora são preferidos. De acordo com uma outra forma de realização preferida, o nível de produção deste polipeptídeo da célula hospedeira da invenção é comparado com o nível de produção da cepa B213 de Bordetella pertussis (Kasuga et al 1953, ver também a Tabela 1), que é tomada como controle. De acordo com uma forma de realização ainda mais
17 preferida, quando a célula hospedeira da invenção é uma cepa de Bordetella pertussis, o nível de produção do polipeptídeo da célula hospedeira da invenção é comparado com o nível de produção da cepa B213 como definido acima, que é tomada como controle. 5 A avaliação do nível de produção do polipeptídeo pode ser realizada ao nível de mrna pela realização de uma Northern Blot ou uma análise de série e/ou ao nível de polipeptídeo pela realização de uma Westem blot. Todos estes métodos são bem conhecidos pela pessoa habilitada. "Aumento na atividade de polipeptideo" é aqui definido como 10 exibindo uma atividade de polissacarídeo desacetilase mais alta do que aquela da célula hospedeira precursora da qual a célula hospedeira transformada deriva usando um ensaio específico para a dita atividade. Preferivelmente, o ensaio é aquele mencionado sob a seção polipeptídeos. Preferivelmente, a célula hospedeira da invenção exibe pelo menos 3 %, 6 %, 10 % ou 15 % 15 mais alto de atividade da polissacarídeo desacetilase do que a célula hospedeira precursora da qual a célula hospedeira transformada deriva exibirá como ensaiado usando um ensaio específico para a dita atividade, que é preferivelmente o ensaio mencionado sob a seção polipeptídeos. Também o hospedeiro que exibe pelo menos 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 20 %, 90 %, 100 % ou 150 % mais da dita atividade do que a célula precursora são preferidos. De acordo com uma outra forma de realização preferida, o nível da atividade da polissacarídeo desacetilase da célula hospedeira da invenção é comparada com a atividade correspondente da cepa B213 como definida antes, que é tomada como o controle. De acordo com uma forma de 25 realização mais preferida, quando a célula hospedeira da invenção é uma cepa de Bordetella pertussis, o nível de atividade da polissacarídeo desacetilase da célula hospedeira da invenção é comparada com a atividade correspondente da cepa B213 como definida antes, que é tomada como o controle. O aumento na expressão e/ou atividade de polipeptídeo pode
18 ter sido obtido pelos métodos convencionais conhecidos na técnica, tais como pela introdução de mais cópias da sequência de ácido nucleico que codifica a polissacarídeo desacetilase no hospedeiro, esteja ela em um carreador ou no cromossoma, além de naturalmente presente. Alternativamente, a sequência 5 de ácido nucleico que codifica a polissacarídeo desacetilase pode ser super expressada fundindo-a ao promotor altamente expressado ou forte adequado para a expressão de proteína de nível alto no organismo selecionado, ou combinação dos dois métodos. A pessoa habilitada saberá que o promotor forte é o mais apropriado dependendo da identidade da célula hospedeira. 10 Preferivelmente quando a célula hospedeira é uma cepa de Bordetella pertussis, o promotor forte é o promotor tac do vetor pmmb67eh (Methods for General and Molecular Bacteriology, Editores P. Gerhardt et al., American Society for Microbiology, Washington DC, 1994, p. 409-410). Alternativamente ou em combinação com a primeira forma de 15 realização preferida, a invenção fornece uma segunda forma de realização preferida, em que a célula hospedeira tem um nível de expressão diminuído da sequência de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo tendo pelo menos 50 % de identidade com a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 2, e/ou tem um nível de expressão diminuído do dito polipeptídeo e/ou tem um nível 20 de atividade aumentado do dito polipeptídeo, preferivelmente por intermédio do uso do vetor de inativação da invenção como mais no princípio aqui definido. Nesta forma de realização, a sequência de ácido nucleico presente no vetor de inativação codifica um polipeptídeo tendo pelo menos 50 % de identidade com a SEQ ID NO: 2. Neste contexto, a diminuição é avaliada pela 25 comparação com a célula hospedeira que não compreende o dito vetor de inativação quando ambos cultivados e/ou ensaiados sob as mesmas condições. "Nível de expressão diminuído do polipeptídeo" é aqui preferivelmente definido como produzindo menos do polipeptídeo como mais no princípio definido do que o que a célula hospedeira precursora da qual a
19 célula hospedeira transformada deriva produzirá quando ambos os tipos de células (células precursora e transformada) são cultivadas sob as mesmas condições. Preferivelmente, a célula hospedeira da invenção produz pelo menos 3 %, 6 %, 10 % ou 15 % menos do polipeptídeo da invenção tendo 5 pelo menos 50 % de identidade com a SEQ ID NO: 2 do que a célula hospedeira precursora da qual a célula hospedeira transformada deriva produzirá quando ambos os tipos de células (células precursora e transformada) são cultivadas sob as mesmas condições. Também hospedeiros que produzem pelo menos 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 10 100 % ou 150 % menos do dito polipeptídeo do que a célula precursora são preferidos. De acordo com uma outra forma de realização preferida, o nível de produção deste polipeptídeo da célula hospedeira da invenção é comparado com o nível de produção da cepa B213 como definida antes, que é tomada como o controle. De acordo com uma forma de realização ainda mais 15 preferida, quando a célula hospedeira da invenção é uma cepa de Bordetella pertussis, o nível de produção do polipeptídeo da célula hospedeira da invenção é comparada com o nível de produção da cepa B213 como definidas antes, que é tomada como o controle. A avaliação do nível de produção do polipeptídeo pode ser 20 realizado ao nível de mrna realizando-se uma Northern Blot ou uma análise de série e/ou ao nível do polipeptídeo realizando-se uma Western blot. Todos estes métodos são bem conhecidos pela pessoa habilitada. "Diminuição na atividade de polipeptídeo" é aqui definida como exibindo uma atividade mais baixa de glicosil transferase do que aquela 25 da célula hospedeira precursora da qual a célula hospedeira transformada deriva usando um ensaio específico para a dita atividade. Preferivelmente, o ensaio é aquele que já foi aqui descrito sob a seção polipeptídeos. Preferivelmente, a célula hospedeira da invenção exibe atividade de glicosil transferase pelo menos 3 %, 6 %, 10 % ou 15 % mais baixa do que a célula
20 hospedeira precursora da qual a célula hospedeira transformada deriva exibirá como ensaiado usando um ensaio específico para a dita atividade, que é preferivelmente o ensaio descrito sob a seção polipeptídeos. Também o hospedeiro que exibe pelo menos 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 5 %, 90 %, 100 % ou 150 % mais da dita atividade do que a célula precursora são preferidos. De acordo com uma outra forma de realização preferida, o nível de atividade de glicosil transferase da célula hospedeira da invenção é comparada com a atividade correspondente da cepa B213 como definida antes, que é tomada como o controle. De acordo com uma forma de realização 10 mais preferida, quando a célula hospedeira da invenção é uma cepa de Bordetella pertussis, o nível da atividade da polissacarídeo desacetilase da célula hospedeira da invenção é comparada com a atividade correspondente da cepa B213 como definida antes, que é tomada como o controle. A diminuição na expressão e/ou atividade do polipeptídeo 15 pode ter sido obtida pelos métodos convencionais conhecidos na técnica, tais como pela introdução de mais cópias da sequência de ácido nucleico que codifica a polissacarídeo desacetilase no hospedeiro, esteja ela em um carreador ou no cromossoma, além de naturalmente presente. Alternativamente, a sequência de ácido nucleico que codifica a polissacarídeo 20 desacetilase pode ser super expressada fundindo-a ao promotor altamente expressado ou forte adequado para a expressão de proteína de nível alto no organismo selecionado, ou combinação dos dois métodos. A pessoa habilitada saberá que o promotor forte é o mais apropriado dependendo da identidade da célula hospedeira. Preferivelmente quando a célula hospedeira é uma cepa de 25 Bordetella pertussis, o promotor forte é o promotor tac do vetor pmmb67eh como definido antes. De acordo com um forma de realização mais preferida, a célula hospedeira não produz nenhuma quantidade detectável da glicosil transferase da invenção e/ou não exibe nenhuma atividade da
21 glicosiltransferase detectável. Preferivelmente, a célula hospedeira não produz ou não produz substancialmente nenhuma glicosil transferase. Alternativamente, de acordo com uma outra forma de realização mais preferida, a célula hospedeira produz uma quantidade 5 indutível da glicosil transferase da invenção e/ou exibe uma atividade indutível da glicosil transferase. A diminuição do nível de expressão da glicosil transferase da invenção e/ou a diminuição do seu nível de atividade pode ter sido obtido pelos métodos convencionais conhecidos na técnica, tal como pela inativação 10 ou regulagem negativa da sequência de ácido nucleico que codifica a glicosil transferase endógena do hospedeiro. Esta inativação ou regulagem negativa pode ter sido obtida pela deleção de um ou mais nucleotídeos no gene codificador. Em uma outra forma de realização, a invenção diz respeito a um hospedeiro, preferivelmente uma Bordetella pertussis que tem uma mutação 15 na sua sequência de ácido nucleico que codifica a glicosil transferase. Preferivelmente para construir um hospedeiro tendo uma sequência de ácido nucleico que codifica a glicosil transferase inativada, um vetor de substituição ou inativação é preparado e é subsequentemente introduzido no hospedeiro pela transformação. A pessoa habilitada saberá como construir um tal vetor. 20 Alternativamente ou em combinação com a inativação da sequência de ácido nucleico endógena, a expressão da sequência de ácido nucleico que codifica a glicosil transferase pode ser diminuída fundindo-a a um promotor fraco adequado para a expressão de proteína de nível baixo no organismo selecionado. 25 Alternativamente ou em combinação com a inativação da sequência de ácido nucleico endógena, a expressão da sequência de ácido nucleico que codifica a glicosil transferase pode ser tornada indutível fundindo-a a um promotor indutível adequado para a expressão de proteína de nível indutível no organismo selecionado. Preferivelmente quando a célula
22 hospedeira é uma cepa da Bordetella pertussis, o promotor indutível é o promotor tac do vetor pmmb67eh como definido antes. Surpreendentemente, a célula hospedeira da invenção tem propriedades atraentes, que a torna muito atraente para ser usada como uma 5 vacina contra a coqueluche integral ou como um adjuvante: potencialidade melhorada para interagir com DC e para induzir subsequentemente a sua maturação e induzir a produção de citocinas pró inflamatórias. Alternativamente ou em combinação, o LPS obtenível a partir destas células também é muito apropriado para ser usado como uma vacina ou como um 10 adjuvante como apresentado abaixo. Consequentemente, em um outro aspecto da invenção, é fornecida uma célula hospedeira como mais no princípio definida para o uso como um medicamento. Preferivelmente o dito medicamento é uma vacina ou um adjuvante como mais tarde aqui definido. 15 LPS obtenível pela célula hospedeira Em um outro aspecto, a invenção diz respeito ao LPS obtenível a partir da célula hospedeira da invenção como mais no princípio aqui definido. Preferivelmente, a célula hospedeira é uma espécie de Bordetella, mais preferivelmente uma Bordetella pertussis, ainda mais 20 preferivelmente uma Bordetella pertussis que carrega uma super expressão da polissacarídeo desacetilase da invenção e/ou uma inativação da glicosil transferase da invenção. Mais preferivelmente, o LPS da invenção é obtenível a partir do mutante 2331 como preparado nos exemplos. Ainda mais preferivelmente, quando analisado depois da isolação com extração com 25 fenol/água quentes (Westphal e Jann, 1965), 0-desacilação pela hidrólise branda (Hoist 2000) e análise por ESI-MS no modo de íon negativo, o espectro de ESI-MS do LPS da invenção é caracterizado por dar mais íons do que o espectro de ESI-MS correspondente do LPS derivado de uma Bordetella pertussis do tipo selvagem, o chamado LPS do tipo selvagem.
23 Preferivelmente a Bordetella pertussis tipo selvagem é a cepa B213 como definida antes. Sem desejar estar ligado por qualquer teoria, estes íons adicionais podem refletir pelo menos parcialmente a substituição aumentada dos grupos fosfato 1 ou 4' da parte de lipídeo A do LPS com resíduos de 5 hexosamina. Tipicamente o espectro de ESI-MS do LPS do tipo selvagem é caracterizado por dar 7 íons (ver a tabela 3), ao passo que o espectro de ESI- MS do LPS da invenção é caracterizado por dar mais do que 7 íons, pelo menos 8, pelo menos 10, pelo menos 12 e mais preferivelmente 14 íons. 10 Alternativamente ou em combinação com a forma de realização precedente, preferivelmente, o espectro de ESI-MS do LPS da invenção compreende mais íons que compreendem hexosamina do que o espectro de ESI-MS do LPS do tipo selvagem. Tipicamente, o espectro de ESI-MS do LPS do tipo selvagem dá dois íons com hexosamina (ver a tabela 15 3), ao passo que o espectro de ESI-MS do LPS da invenção é caracterizado por dar mais do que dois íons, pelo menos 4, pelo menos 6 e mais preferivelmente 8 íons. Composições farmacêuticas e usos médicos A invenção diz respeito ainda a uma composição farmacêutica 20 que compreende a célula hospedeira da invenção e/ou o LPS da invenção ambos como mais no princípio aqui definidos. A composição farmacêutica pode ser usada como uma vacina ou como um adjuvante. A vacina pode ser usada para a imunização (incitando uma resposta imune) ou vacinação de um mamífero. 25 Os adjuvantes são aqui definidos para incluir qualquer substância ou composto que, quando usado em combinação com um antígeno, para imunizar um mamífero, preferivelmente um ser humano, estimula o sistema imune, provocando, realçando ou facilitando deste modo a resposta imune contra o antígeno, preferivelmente sem gerar uma resposta imune
24 específica para o próprio adjuvante. Os adjuvantes preferidos realçam a resposta imune contra um dado antígeno por pelo menos um fator de 1,5, 2, 2,5, 5, 10 ou 20, quando comparada com a resposta imune gerada contra o antígeno sob as mesmas condições mas na ausência do adjuvante. Testes para 5 determinar o realce médio estatístico da resposta imune contra um dado antígeno como produzido por um adjuvante em um grupo de animais ou seres humanos em relação a um grupo de controle correspondente estão disponíveis na técnica. O adjuvante preferivelmente é capaz de realçar a resposta imune contra pelo menos dois antígenos diferentes. O adjuvante da invenção 10 usualmente será um composto que é estranho a um mamífero, excluindo desse modo compostos imunoestimulatórios que são endógenos para os mamíferos, tais como por exemplo, interleucinas, interferons e outros hormônios. Em uma forma de realização preferida, quando a composição farmacêutica é usada como um adjuvante, a composição compreende ainda 15 um antígeno. Quando a composição é usada como uma vacina, o antígeno está presente na superfície da célula hospedeira da invenção e/ou está presente dentro do LPS obtenível a partir de tais células. Neste caso a vacina é preferivelmente uma vacina contra o hospedeiro da invenção e/ou contra 20 qualquer hospedeiro capaz de expressar uma molécula de LPS relacionada. Quando a composição é usada como um adjuvante, preferivelmente um antígeno está presente. O antígeno é preferivelmente um antígeno de uma bactéria, um vírus, um fungo, um parasita, uma célula cancerosa ou um alérgeno ou produzido pelos mesmos como ainda definido 25 abaixo. O antígeno e a célula hospedeira da invenção e/ou o LPS obtenível por tais células são preferivelmente usados no tratamento e/ou prevenção de uma doença infecciosa causada pela bactéria, vírus, fungo, ou parasita, ou do tumor causado pela célula cancerosa, ou da alergia causada pelo alérgeno. Em uma outra forma de realização preferida, a composição
25 farmacêutica que compreende uma célula hospedeira da invenção e/ou um LPS obtenível a partir desta e opcionalmente um antígeno como aqui definido acima compreende ainda um carreador farmaceuticamente aceitável. As composições farmacêuticas podem compreender ainda agentes de 5 estabilização, agentes osmóticos, agentes de tampão, agentes de dispersão e outros farmaceuticamente aceitáveis. A forma preferida da composição farmacêutica depende do modo pretendido de administração e aplicação terapêutica. O carreador farmacêutico pode ser qualquer substância compatível, não tóxica adequada para liberar os ingredientes ativos, isto é, a 10 célula hospedeira da invenção e/ou o LPS obtenível desta célula hospedeira e opcionalmente o antígeno, ao paciente. Os carreadores farmaceuticamente aceitáveis para a liberação intranasal são exemplificados por água, soluções salinas tamponadas, glicerina, polissorbato 20, cremofor EL e uma mistura aquosa de glicerídeo caprílico/cáprico e pode ser tamponada para fornecer um 15 ambiente de ph neutro. Os carreadores farmaceuticamente aceitáveis para a liberação parenteral são exemplificados pelo NaC1 tamponado estéril a 0,9 % ou glicose a 5 % opcionalmente suplementada com uma albumina a 20 %. As preparações para a administração parenteral devem ser estéreis. A via parenteral para a administração dos ingredientes ativos está de acordo com os 20 métodos conhecidos, por exemplo, injeção ou infusão pelas vias subcutânea, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intraarterial ou intralesional. As composições da invenção são preferivelmente administradas pela injeção de bolo. Uma composição farmacêutica típica para a injeção intramuscular seria fabricada para conter, por exemplo, de 1 a 10 ml de solução salina tamponada 25 com fosfato e de 1 a 100 preferivelmente de 15 a 45 gg de antígeno e de 1 a 100 gg, preferivelmente de 15 a 45 gg da célula hospedeira e/ou LPS da invenção. Para a administração oral, o ingrediente ativo pode ser administrado nas formas de dosagem líquida, tais como elixires, xaropes e suspensões. As formas de dosagem líquidas para a administração oral podem conter corantes