USO DE ANTIOXIDANTES NO SÊMEN OVINO (Use of antioxidants on ram semen) Maria Madalena Pessoa GUERRA 1 ; Diogo Ribeiro CÂMARA 2 ; Ellen Cordeiro Bento da SILVA 1 ; Sildivane Valcácia SILVA 1 1 Laboratório de Andrologia (ANDROLAB), Departamento de Medicina Veterinária da Universidade Federal Rural de Pernambuco. 2 Universidade Federal de Alagoas. E-mail para correspondência: mpguerra@dmv.ufrpe.br RESUMO Diversos estudos têm relatado o papel dos oxidantes na fisiologia espermática, assim como a possibilidade de preservar a integridade destes gametas ao se adicionar substâncias antioxidantes aos diluentes de criopreservação. Na espécie ovina, o uso de antioxidantes enzimáticos e não enzimáticos tem a possibilidade de aumentar o conhecimento da fisiologia espermática e as taxas de prenhez após inseminação artificial com o sêmen criopreservado com antioxidantes. Este trabalho teve como objetivo sumarizar a ação de substâncias antioxidantes na criopreservação do sêmen ovino. Palavras-chave: Criopreservação, ROS, antioxidantes, sêmen, ovino. ABSTRACT Many studies has related the oxidant paper on the sperm physiology, as well as the possibility to preserve the integrity of these gametes when is added antioxidant substances to freezing diluents. On the ovine specie, the use of enzymatic and non enzymatic antioxidants has the possibility to increase the knowledge of sperm physiology and the pregnant taxes after artificial insemination with frozen semen. This paper had the objective to summary the action of antioxidant substances on the cryopreservation of ovine semen. 27 a 29 de junho de 2012. 354
Key words: Cryopreservation, ROS, antioxidants, semen, ovine. INTRODUÇÃO Os procedimentos convencionais de criopreservação de sêmen causam extensivos danos químicos e físicos às membranas espermáticas, os quais são atribuídos a alterações na transição da fase lipídica e/ou aumento na peroxidação lipídica (Purdy, 2006). Conhecimentos sobre os danos oxidativos causados às células espermáticas decorrentes do desequilíbrio entre as concentrações fisiológicas de oxidantes e antioxidantes, resultantes do aumento da produção de espécies reativas ao oxigênio (ROS) ou da redução da capacidade antioxidante total do sêmen, podem fornecer importantes informações para melhorar a viabilidade espermática pós-congelação (Guerra et al., 2004). A diluição do sêmen comumente utilizada nos processos de criopreservação promove a redução da concentração de antioxidantes, resultando no desequilíbrio entre oxidantes e antioxidantes, e, consequentemente, no estresse celular (Bilodeau et al., 2000). Visando reduzir os efeitos deste possível desequilíbrio, tem-se estudado o efeito da adição de antioxidantes aos diluidores de preparação, manutenção e criopreservação espermática (Mortimer, 2000). O termo antioxidante significa "impedir a oxidação de outras substâncias químicas (Stedman, 2003). A função dos antioxidantes é regenerar o substrato ou prevenir significativamente a oxidação do mesmo. A célula possui um sistema de defesa que pode atuar em duas linhas, uma como detoxificadora do agente oxirredutor antes que este cause a lesão celular, constituída por glutationa reduzida (GSH), superóxido dismutase (SOD), catalase, glutationa-peroxidase (GSH-Px) e vitamina E. A outra linha de defesa tem a função de reparar a lesão ocorrida, sendo constituída pelo ácido ascórbico (vitamina C), glutationa-redutase (GSH-Rd) e GSH-Px, entre outros (Ferreira & Matsubara, 1997). Apesar de o sêmen ovino conter as enzimas antioxidantes superóxido dismutase (SOD), glutationa peroxidase (GPx) e catalase (Mann & Lutwak-Mann, 1981), sua concentração pode ser consideravelmente reduzida pela diluição. Em virtude da conhecida ação das ROS sobre a célula espermática, faz-se necessária a identificação de antioxidantes que possam ser utilizados para equilibrar a ação dos oxidantes produzidos durante os procedimentos de conservação. Desta forma, 27 a 29 de junho de 2012. 355
este trabalho teve como objetivo de sumarizar a ação de substâncias antioxidantes na criopreservação do sêmen ovino. - Catalase (CAT) É uma enzima intracelular encontrada na maioria dos organismos, pertencente à subclasse das enzimas oxidorredutases, que usam o peróxido como receptor e doador de életrons (Barreiros et al., 2006). Os primeiros relatos da adição de CAT (100, 200, 400 e 800 U/mL) ao crioprotetor de refrigeração do sêmen ovino foram feitos por Maxwell e Stojanov (1996), onde observaram que concentrações acima de 200 U/mL foram tóxicas para o espermatozoide ovino. Da mesma forma, a adição de CAT ao meio quimicamente definido utilizado para refrigeração (15 C, 48h) do sêmen ovino evidenciou não haver alteração da motilidade espermática das alíquotas incubadas (38 C) por 1, 24 e 48 horas (Upreti et al., 1997). Concordando com estes autores, de Graaf et al. (2007) relataram que a adição desta enzima (CAT 100 UI/mL) ao diluente de congelação do sêmen ovino, seguida da sexagem em citômetro de fluxo, não alterou os parâmetros cinéticos dos espermatozóides. Todavia, Maia et al. (2009) observaram aumento no percentual de células espermáticas com membranas viáveis, ao adicionarem CAT ao diluente de congelação do sêmen ovino. Câmara et al. (2011a) também constataram ação benéfica da adição de CAT (100 e 200 U/mL) ao diluente Tris-gema, onde observaram redução dos efeitos deletérios da refrigeração na motilidade total dos espermatozóides ovinos mantidos a 5 C por 24 h, embora nenhum efeito tenha sido observado na funcionalidade das membranas espermáticas. -Superóxido dismutase (SOD) É a enzima mais abundante do organismo (Halliwell & Gutteridge, 1989), cuja função é catalisar a dismutação do ânion superóxido em oxigênio e H 2 O 2 (Nishikimi & Machlin, 1975). Nas células eucarióticas existem duas SODs principais, uma citoplasmática, que contém cobre e zinco, denominada de superóxido dismutase cobrezinco dependente - CuZnSOD, e outra localizada na matriz mitocondrial, que contêm Manganês, denominada Superóxido dismutase manganês dependente MnSOD (Halliwell & Gutteride, 1989). Na reprodução, a enzima SOD foi encontrada tanto na 27 a 29 de junho de 2012. 356
célula espermática quanto no plasma seminal de diferentes espécies mamíferas, cuja função é prevenir a peroxidação lipídica nos espermatozoides (Storey, 1997). Marti et al. (2008) observaram que a atividade da SOD nas amostras de sêmen ovino (fresco e resfriado) foi duas vezes maior do que nas amostras pós-descongelação, que por sua vez apresentou uma redução de 65%. De acordo com Maxwell e Stojanov (1996), a adição de 100, 200, 400 e 800 U/mL de SOD ao diluente de refrigeração de sêmen ovino preservou os gametas nas temperaturas de 25 e 5 ºC, por 12 dias. Todavia, o efeito benéfico deste antioxidante somente foi observado até o sexto dia de refrigeração. Na incubação (39 ºC) de amostras de sêmen ovino por cinco horas, Stefanov et al. (2004) observaram que nas concentrações de 60 e 120 U/mL, a adição de SOD foi eficaz na supressão da formação de H 2 O 2, fato não observado na dosagem de 30 U/mL. Enquanto Câmara et al. (2011a) não observaram efeito positivo na capacidade antioxidante total nem na qualidade dos espermatozoides congelados com SOD (5, 10 e 20 U/mL), associado a diferentes tempos de equilíbrio na criopreservação do sêmen ovino, Todavia, Silva et al. (2011) relataram que a adição de SOD (100 U ml) preservou o acrossoma de espermatozoides congelados de ovinos. Resultado positivo da ação deste antioxidante também foi observado no número de estruturas recuperadas e na taxa de fertilização, apesar de não haver diferença significativa. - Glutationa É um tripeptídeo (g-l-glutamil-l-cisteinil-glicina) que existe no organismo em suas formas reduzida (GSH) e oxidada (GSSG), atuando direta ou indiretamente em muitos processos biológicos importantes, incluindo a síntese de proteínas, metabolismo e proteção celular (Meister & Anderson, 1983). Quatro diferentes tipos de glutationa peroxidases são conhecidas, dentre as quais a fosfolipídeo hidroperóxido glutationa peroxidase (PHGSH-Px), que consegue promover a redução de hidroperóxidos a partir de complexos lipídicos como colesterol, mesmo quando os peróxidos estão presentes na membrana celular (Lehmann et al., 1998). Marti et al. (2008) evidenciaram que as GPx e Glutationa Redutase (GRd) estão em quantidade e atividade elevadas no ejaculado de carneiro, mesmo em amostras criopreservadas. Todavia, Bucak et al. (2008) revelaram que a adição de glutationa (5 mm) e glutationa reduzida (5 mm) ao diluente utilizado na criopreservação do sêmen ovino não melhorou o percentual de espermatozoides móveis, 27 a 29 de junho de 2012. 357
viáveis, reativos ao teste hiposmótico e com morfologia normal, nem interferiu na concentração de malonaldeído, parâmetro indicador de lipoperoxidação. Por outro lado, Bucak et al. (2009) relataram aumento no percentual de espermatozoides móveis e com membranas íntegras avaliadas pelo teste hiposmótico após a adição de glutamina (5 mm) ao diluente de congelação do sêmen ovino. No entanto, a produção de malonaldeído não foi influenciada pela adição da glutamina, reforçando informação anterior de que a lipoperoxidação não é preponderante para redução da qualidade espermática pós-descongelação. Câmara et al. (2009) observaram que a adição de diferentes concentrações de GSH (0,5; 1,0 e 2,0 mm) na criopreservação do sêmen de carneiros aumentou a capacidade antioxidante total, proporcional ao aumento da concentração, sem melhorar a cinética espermática. Resultados semelhantes foram observados por Câmara et al. (2011a), onde a suplementação com GSH 400 mm determinou efeitos negativos nos parâmetros de velocidade espermática (motilidade espermática, taxa de espermatozoides rápidos e velocidade curvilinear) durante o período de incubação. Por outro lado, Câmara et al. (2011b) constataram que o GSH (0.5, 1.0 e 2.0 mm), independente da concentração e do tempo de equilíbrio utilizados, não aumentou a capacidade antioxidante total, assim como não melhorou a qualidade espermática após a congelação. Apesar de Silva et al. (2011) terem constatado que a adição de GSH (2 e 5 mm) ao diluente de congelação do sêmen ovino preserva a integridade do acrossoma espermático, apesar de não melhorar o número de estruturas recuperadas e a taxa de fertilização in vivo. Vitamina E (tocoferol) É um antioxidante não enzimático (Maneesh & Jayalekshmi, 2006), lipossolúvel natural da membrana (Sikka, 2004) que pode proteger os espermatozoides contra danos oxidativos do DNA e da membrana (Sikka, 1996), em virtude de sua capacidade em prevenir a peroxidação lipídica e suprimir, por conseguinte, a produção de malonaldeido (Aitken & Clarkson, 1988). No entanto, este antioxidante pode ter sua função comprometida em casos de elevada concentração de ferro (Ferreira & Matsubara, 1997). Quando encontrada em elevadas concentrações no interior da célula, a vitamina E pode ter efeitos adversos sobre os processos fisiológicos (Sikka, 2004), uma vez que a sua atuação sofre interferência das condições de armazenamento, da composição lipídica 27 a 29 de junho de 2012. 358
das membranas e das concentrações de antioxidantes presentes no sêmen das diferentes espécies (Ball & Vo, 2002). Apesar desses relatos e dos variados resultados obtidos após adição da vitamina E para o armazenamento do sêmen, Kheradmand et al. (2006) observaram que o acetato de α-tocoferol protegeu a motilidade e a integridade de membrana de espermatozoides ovinos refrigerados a 5 ºC, após 48 horas. O efeito da adição da Trolox (análogo hidrossolúvel da Vitamina E) ao diluidor de congelação do sêmen ovino foi observado por Silva (2010), onde relatou que a adição de Trolox (60 e 120 µm) ao diluente Trisgema proporciona maior integridade estrutural e cinética de espermatozoides de carneiros pós-criopreservação. Vitamina C O ácido ascórbico ou vitamina C é comumente encontrado no organismo na forma de ascorbato, constituindo um antioxidante de notável atuação in vivo, uma vez que neutraliza as ROS por meio de reações de redução e a partir disto, atua inibindo a peroxidação lipídica (Barreiros et al., 2006). Isto se deve ao fato deste antioxidante atuar eficientemente sobre ROS como O 2 ˉ, H 2 O 2, hipoclorito (ClOˉ), OH e OOH (Vasconcelos et al., 2007). Em contrapartida, o ascorbato também pode atuar como próoxidante, o que ocorre quando presente em doses elevadas ou quando exposto a metais, fato que determina a lipoperoxidação (Ferreira & Matsubara, 1997), em virtude do estímulo à produção de H 2 O 2 e OH (Bianchi & Antunes, 1999). Objetivando avaliar o efeito do tempo de incubação pós-descongelação sobre a viabilidade de espermatozóides ovinos criopreservados em diluente Tris-Gema suplementado com vitamina C e Trolox (análogo hidrossolúvel da vitamina E), Peixoto et al. (2008) constataram que a vitamina C (600mM/L) determinou menor porcentual de espermatozóides com estresse oxidativo (P<0,05). Quercetina A quercetina é um polifenol flavonoide com efeito inibidor da peroxidação lipídica similar e sinérgico ao do resveratrol, sendo portanto, um antioxidante mais potente que as vitaminas E e C (Stojanović et al., 2001), em virtude de sua riqueza de grupos hidroxila em sua estrutura (Barreiros et al., 2006), sendo demonstrada sua 27 a 29 de junho de 2012. 359
capacidade em inibir danos oxidativos induzidos pelo H 2 O 2 no DNA de linfócitos humanos (Bianchi & Antunes, 1999). Adicionando a quercetina ao diluente Tris-gema de ovo-glicerol, Silva et al. (2012) não observaram diferença (P<0,05) entre os grupos quanto a motilidade progressiva, vigor, acrossoma e membranas íntegras. Todavia, a percentagem de gametas com alto potencial de membrana mitocondrial foi maior (P<0,05) no grupo suplementado com quercetina 5 µg/ml do que naqueles tratados com 10, 15 ou 20 µg/ml de quercetina. Resveratrol O resveratrol (3, 5, 4 -trihidroxiistilbeno) é um polifenol (Stojanović et al., 2001) não flavonoide (Degáspari & Waszczynskyj, 2004), encontrado sobre as formas cis e trans. O cis-resveratrol é muito instável à ação da luz, enquanto que o transresveratrol consiste na forma mais estável, permanecendo por longo período quando protegido da luz e em uma faixa de ph entre 1 e 7 (Trela & Waterhouse, 1996). Na presença de trans-resveratrol, a peroxidação lipídica é inibida mais eficazmente do que com as vitaminas C e E, sem prejuízos a este processo com o incremento da dose empregada, demonstrando que o resveratrol possui melhores efeitos antioxidantes do que tais vitaminas (Stojanović et al., 2001). Sarlós et al. (2002) verificaram que o resveratrol provou ser um antioxidante altamente potente, inibindo a peroxidação lipídica com maior eficácia em baixas concentrações (15 µg/1 x 10 9 espermatozoides) nas temperaturas de 37 e 5 ºC. Enquanto Silva et al. (2012) observaram que as amostras de sêmen ovino congeladas com resveratrol (5, 10, 15 e 20 µg/ml) não melhoraram a motilidade progressiva, o vigor, o acrossoma e as membranas íntegras. Entretanto, a percentagem de gametas com alto potencial de membrana mitocondrial foi maior no grupo sem antioxidante do que no grupo criopreservado com resveratrol 20 µg/ml. CONSIDERAÇÕES GERAIS A criopreservação de sêmen ovino utilizando antioxidantes (enzimáticos e não enzimáticos) tem possibilitado a preservação de algumas estruturas espermáticas. Todavia, alguns estudos ainda devem ser realizados para avaliar o efeito da associação 27 a 29 de junho de 2012. 360
destas substâncias antioxidantes, com o objetivo de aumentar a taxa de fertilização de ovelhas inseminadas artificialmente com amostras de sêmen criopreservadas com antioxidantes. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS AITKEN, R.J.; CLARKSON, J.S. Significance of reactive oxygen species and antioxidants in defining the efficacy of sperm preparation techniques. Journal of Andrology, v. 6, n. 6, p. 367-376, 1988. BALL, B.B.; VO, A.T. Detection of lipid peroxidation in equine spermatozoa based upon the lipophilic fluorescent dye C11-BODIPY581/591. Journal of Andrology, v.23, p. 259-269, 2002. BARREIROS, A.L.B.S.; DAVID, J.M.; DAVID, J.P. Estresse oxidativo: relação entre geração de espécies reativas e defesa do organismo. Química Nova, v. 29, n. 1, p. 113-123, 2006. BIANCHI, M.L.P.; ANTUNES, L.M.G. Radicais livres e os principais antioxidantes da dieta. Revista de Nutrição, v. 12, n. 2, p. 123-130, 1999. BILODEAU, J.F.; CHATTERJEE, S.; SIRARD, M.A.; GAGNON, C. Levels of antioxidant defense are decreased in bovine spermatozoa after a cycle of freezing and thawing. Molecular, Reproduction and Development, v. 55, p. 282-288, 2000. BUCAK, M.N.; ATEŞŞAHIN, A.; YÜCE, A. Effect of anti-oxidants and oxidative stress parameters on ram semen after the freeze-thawing process. Small Ruminant Research, v.75, p.128-134, 2008. BUCAK, M.N.; TUNCER, P.B.; SARIÖZKAN, S.; ULUTAŞ, P.A. Comparison of the effects of glutamine and an amino acid solution on pot-thawed ram sperm parameters, lipid peroxidation and anti-oxidant activities. Small Ruminant Research, v.81, p.13-17, 2009. CÂMARA, D.R.; MELLO-PINTO, M.M.C.; PINTO, L.C.; BRASIL, O.O., NUNES, J. F.; GUERRA, M. M.P. Effects of reduced glutathione and catalase on the kinematics and membrane functionality during liquid storage of ram semen. Small Ruminant Research, v. 100, p. 44-49, 2011a. CÂMARA, D.R.; SILVA, S.V.; ALMEIDA, F.C., NUNES, J. F., GUERRA, M. M. P. Effect of the addition of antioxidants and different pre-freezing equilibration times on 27 a 29 de junho de 2012. 361
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