FOLHA DE DADOS TÉCNICOS MICROPLATE MUD / SF DETECÇÃO E ENUMERAÇÃO DE ENTEROCOCCOS EM ÁGUA 1 UTILIZAÇÃO Microplaca MUD / SF permite a identificação prática e enumeração de enterococos intestinais em água, de acordo com NF EN ISO 7899-1. O uso de placas de microtitulação, com poços contendo um meio desenvolvido especificamente, foi concebido para uso na análise de vários tipos de água, nomeadamente água balneares (doce ou salgada), água de superfície (paradas) e água de pós-tratamento. O método é aplicável a todas as amostras de água, incluindo aquelas ricas em matéria em suspensão. Para a enumeração de enterococos, a técnica de microplacas com MUD tem sido reconhecida como a mais específica, precisa e rápida de todos os métodos anteriormente utilizados. Esta técnica representa uma evolução importante no que diz respeito às tecnologias existentes para os enterococos, que de entre os microrganismos indicadores de contaminação fecal, este é de um interesse particular nos controlos da qualidade da água. 2 HISTÓRIA Entre os numerosos métodos utilizados para o isolamento e a enumeração dos estreptococos do Grupo D, o meio GTC, originalmente desenvolvido por Donnelly & Hartman em 1978, foi muito seletivo, mas não permitiu a separação de estreptococos fecais de estreptococos não fecais. A utilização de substratos fluorogénicos tem atraído numerosos estudos para a identificação de microrganismos através de procedimentos simples e rápidos. Em 1982, a Littel & Hartman selecionou, de entre numerosos substratos fluorogénicos, aquele permitiu a caracterização e diferenciação de estreptococos fecais de outros estreptococos. Eles demonstraram que o 4- metilumbeliferil-β-d-glucósido (MUD) foi hidrolisado por quase todos os estreptococos fecais com exceção de Streptococcus mitis. A técnica de microtitulação, bem como o método estatístico de interpretação dos resultados, foi utilizado e validado por Hernandez em 1988, com a ajuda de 5 laboratórios parceiros para um estudo comparativo entre os métodos atualmente utilizados e o novo método fluorogénico miniaturizado, nas águas do mar das costas Francesas. Verificou-se que o nível de recuperação era igual ou superior a outros métodos em tubos ou por filtração por membrana. Em particular, o método miniaturizado mostrou uma especificidade mais elevada do que o método de filtração por membrana. Este método pode, portanto, ser considerado como confiável para detetar enterococos em água.
3 PRINCÍPIOS Cada placa de microtitulação contém 96 poços (12 filas de 8 poços). O substrato que demonstra a atividade enzimática bacteriana em questão é o MUD (4- metilumbeliferil-p-d-glucósido). Este componente é incorporado num meio de cultura especialmente concebido para a deteção de enterococos. O meio de cultura é desidratado e fixado no fundo dos poços das microplacas. A reidratação do meio é conseguida quando a própria amostra de água é introduzida nos poços. Os enterococos eventualmente presentes no inóculo da amostra, hidrolisam o MUD em 4-metilumbeliferona e glucose. A produção de 4- metilumbeliferona, indicada por uma fluorescência azul, pode ser observada com a ajuda de uma lâmpada UV a 366 nm. Uma vez realizada a leitura dos poços, conta-se o número de poços fluorescentes para cada diluição. A partir de um número característico obtido, uma análise estatística baseada na lei de Poisson, permite o cálculo de enterococos na amostra analisada. A composição do meio, com elevado nível de peptona e galactose, permite uma excelente recuperação. Polissorbato, fosfato monopotássico e hidrogenocarbonato de sódio aumentam o desempenho do meio. O ácido nalidíxico bloqueia a replicação do DNA em que lhe são bactérias sensíveis e o acetato de tálio inibe quase toda a restante microflora contaminante. A incubação a 44 C foi estudada a fim de inibir o crescimento da maioria dos microrganismos contaminantes. 4 COMPOSIÇÃO TÍPICA Cada poço da placa de microtitulação é cheio com 100 μl de meio, cuja fórmula pode ser ajustada para obter um bom desempenho. Para 1 litro de meio: - Triptose... 40,0 g - Galactose... 2,0 g - Polissorbato (Tween 80)...1,5 ml - Fosfato monopotássico... 10,0 g - hidrogenocarbonato de sódio... 4,0 g - Ácido nalidíxico... 0,25 g - Acetato de tálio...2,0 g - cloreto de 2,3,5 trifeniltetrazólio (TTC).. 0,1 g - MUD... 0,15 g PH do meio pronto a utilizar a 25 C: 7,5 ± 0,2.
5 INSTRUÇÕES DE USO Para proceder à análise de amostras de águas cloradas, bromadas ou ozonizadas, é necessário adicionar, por métodos estéreis, um excesso de tiossulfato de sódio no recipiente de recolha para neutralizar os oxidantes. Deste modo, pode ser obtida recuperação total dos microrganismos a serem detectados. Preparação e diluições Misturar a amostra no poço de modo a obter uma repartição homogénea dos microrganismos. Para água doce, água de balnear e outras águas superficiais (salinidade inferior a 30 g / Kg), utilizar tubos contendo 18 ml de diluente especial de microplaca (Sal de Mar Sintético - BR003 ou BM088) com ou sem azul de bromocresol e fazer uma primeira diluição de 1 : 10. Para água do mar com uma salinidade superior a 30g / Kg (medir com o auxílio de um refratómetro), utilize água destilada estéril (BM115) como diluente. Efetuar diluições sucessivas com sal marinho sintético. O número de diluições a inocular está relacionada com a natureza e o nível de contaminação da água. As diluições e os níveis de deteção para o número de microrganismos presentes em cada categoria de amostra estão listadas na seguinte tabela: Tipo amostra Nº de diluições Nº de poços / Diluição Intervalo de deteção Águas Balneares 2 64 poços a 1:2 32 poços a 1:20 1,5 x 10 1 a 3,5 x 10 4 24 poços a 1:2 Águas Superficiais 4 24 poços a 1:20 24 poços a 1:200 24 poços a 1:2000 4,0 x 10 1 a 3,2 x 10 6 16 poços a 1:2 Águas residuais e tratadas 6 até 16 poços a 1:200000 6,0 x 10 1 a 6,7 x 10 8 Inoculação da amostra Transferir a diluição inicial para um recipiente estéril apropriado. Usando uma pipeta multicanal (8 pontas estéreis), inocular 200μL em cada poço da Placa de microtitulação. Do mesmo modo, inocular as diluições subsequentes (1:20, 1: 200, 1: 2000, etc.) utilizando um novo recipiente e novas pontas de pipeta estéril. A inoculação do poço deve ser realizada com cuidado para evitar contaminação. Distribuição: 200 µl / poço Incubação: 36 a 72 h a 44 C Cubrir cada placa de microtitulação com uma tampa adesiva estéril fornecida no kit. Esta medida limita a desidratação dos meios nos poços e protege a placa da contaminação externa durante o período de incubação. Incubação: Incubar as placas de microtitulação a 44,0 ± 1,0 C durante 36 horas, não excedendo um máximo de 72 horas.
6 RESULTADOS Os poços que apresentam uma fluorescência azul sob luz UV de 366 nm são considerados positivos. A leitura deve ser realizada após o período mínimo de incubação, uma vez que a fluorescência não diminui ao longo do tempo. As placas de microtitulação opacas (BT003) foram desenvolvidas para leitura visual e contagem manual. Ver ANEXO 1: APOIO FOTOGRÁFICO. Determinar o número característico a partir do número de poços positivos para cada uma das diluições escolhidas. No caso em que mais de 3 diluições são inoculadas, um número característico composto por 3 algarismos (se possível terminando em 0) deve ser considerado. Consulte o quadro estatístico apresentado no anexo da norma NF EN ISO 9308-1. NOTA: Um arquivo Excel pode ser fornecido a pedido para determinar o NMP e os níveis de confiança. 7 CONTROLE DE QUALIDADE Fluorescência após incubação de 48 horas a 44 C: Análise Poço com Sal Marinho sintético Nível médio de fluorescência com Enterococcus faecalis WDCM 00176 Fertilidade / Microorganismo Enterococcus faecalis WDCM 00176 Enterococcus faecium WDCM 00178 Enterococcus hirae WDCM 00089 Aerococcus viridans WDCM 00061 Lactococcus lactis WDCM 00016 Staphylococcus epidermidis WDCM 00132 Resultado / Crescimento Ausência de poços positivos Poço <25 % fluorescência do limiar positivo Fluorescência maior que o dobro do valor Limiar positivo (variação <10%) Crescimento / Grau de recuperação 66 a 150% do valor alvo 66 a 150% do valor alvo 66 a 150% do valor alvo Fluorescência <25% do limiar positivo Fluorescência <25% do limiar positivo Fluorescência <25% do limiar positivo 8 ARMAZENAMENTO / VIDA ÚTIL Microplacas: 2-8 C. A data de validade indicada no rótulo. 9 EMBALAGENS Microplacas Brancas, opacas: 25 microplacas + 25 tampas adesivas transparentes estéreis... BT00308
10 BIBLIOGRAFIA Buehler, H.J., Katzman, P.A., and Doisey, E.A.. 1949. Bacterial glucuronidase. Federation Proceedings, 8 : 189. Cochran, W.G.. 1950. Estimation of bacterial densities by means of the "Most Probable Number". Biometrics, 6 : 105-116. de Man, J.C.. 1975. The probability of most probable numbers. European Journal of Applied Microbiology, 1 : 76-78. Kilian, M., and Bülow, P.. 1976. Rapid diagnosis of Enterobacteriaceae. I. Detection of bacterial glycosidases. Acta Pathologica et Microbiologica Scandinavica Section B, 84 : 245-251. Feng, P.C.S., and Hartman, P.A.. 1982. Fluorogenic assays for immediate confirmation of Escherichia coli. Applied Environmental Microbiology, 43 :1320-1329. Hurlley, M.A., and Roscoe, M.E.. 1983. Automated statistical analysis of microbial enumeration by dilution series. Journal of Applied Bacteriology, 55 : 159-164. Trepeta, R.W., and Edberg, S.C.. 1984. Methylumbelliferyl-β-D-glucuronide-based medium for rapid isolation and identification of Escherichia coli. Journal of Clinical Microbiology, 19 : 172-174. Hernandez, J.F., Guibert, J.M., Delattre, J.M., Oger, C., Charrière, C., Hugues, B., Serceau, R., and Sinegre, F.. 1991. Miniaturized fluorogenic assays for enumeration of E.coli and enterococci in marine water. Water Science and Technology, 24 : 137-141. NF EN ISO 7899-1. Mars 1999. Qualité de l eau. Recherche et dénombrement des entérocoques intestinaux dans les eaux de surface et résiduaires. Partie 1 : Méthode miniaturisée (nombre le plus probable) par ensemencement en milieu liquide. 11 INFORMAÇÕES ADICIONAIS As informações fornecidas nos rótulos têm precedência sobre as formulações ou instruções descritas neste documento e são suscetíveis de modificação a qualquer momento, sem aviso prévio. Código do documento: MICROPLATES MUD SF_ENv7. Data de criação: 02-2005 Atualizado: 10-2015 Origem da revisão: atualização geral
ANEXO 1: APOIO FOTOGRÁFICO Microplaca MUD / SF Deteção e enumeração de enterococos em água, segundo o método NF EN ISO 7899-1. Resultados: Crescimento obtido após 36 horas de incubação a 44 C. Características: Os poços que apresentam uma fluorescência azul sob luz UV a 366 nm são considerados positivos.