Diagnóstico Imunológico das Imunodeficiências Secundárias

Transcrição

1 Diagnóstico Imunológico das Imunodeficiências Secundárias

2 Dois tipos de imunodeficiências Primárias ou Congênitas Secundárias ou Adquiridas

3 Imunodeficiências Secundárias Principais causas de imunodeficiências adquiridas: Uso de drogas (citotóxicas e imunossupressoras) Má nutrição (causa mais comum no mundo) Desordens metabólicas (ex: doenças renais) Traumas ou cirurgias Infecção viral (HIV) Foto de Kevin Carter

4 Imunodeficiências Adquiridas Principais causas de imunodeficiências adquiridas: Uso de drogas (citotóxicas e imunossupressoras) Má nutrição (causa mais comum no mundo) Desordens metabólicas (ex: doenças renais) Traumas ou cirurgias Infecção viral (HIV) Image:

5 A AIDS é um dos maiores problemas de saúde pública

6 Controladores de Elite AIDS (Síndrome da Imunodeficiência adquirida) é causada pelo vírus HIV (Human Immunodeficiency Virus) Porém, nem toda pessoa infectada por HIV tem AIDS! (principalmente se você tem dinheiro) ~1 em 300 pessoas infectadas com HIV Nature Immunology 13, (2012)

7 HIV ataca vários tipos de células Patogênese do HIV

8 Patogênese do HIV

9 Como HIV infecta linfócitos T CD4+? Crédito: NIAID

10 Genoma do HIV Retrovírus esférico (80 a 130nm) Envelope: bicamada lipídica que veio da membrana da célula hospedeira; gp120; gp41 (HIV-2 gp36) Matriz protéica (core): p17 e capsídeo p24 Dentro: duas fitas de RNA (genoma), transcriptase reversa, integrase, protease Gen e LTR gag pol env vif vpr tat rev vpu nef Função Integração do DNA viral no genoma da célula do hospedeiro; sítio de ligação para os fatores de transcrição do hospedeiro Nucleocapsídeo Central e proteína da matrix Transcriptase reversa, protease, integrase e ribonuclease Proteínas do envoltório viral (gp120 e gp41) mediando a ligação ao receptor CD4 e quimiocina com membrana de fusão Aumenta a infectividade das partículas virais Promove o transporte nuclear do DNA viral; parada do ciclo celular G2 Necessário para o alongamento dos transcritos virais Promove a inclusão nuclear dos RNAs virais incompletamente processados ou não processados Regula negativamente a expressão de CD4 nas células do hospedeiro e facilita a liberação do vírus pelas células Idem a vpu; regula negativamente a expressão das moléculas do MHC de classe I

11 Tipos principais de HIV Vírus mais virulento Responsável pela epidemia global Severidade varia de pessoa para pessoa Grupo M Cepa pandêmica (90% das infecções mundiais) Encontrado na África Ocidental Transmissão é menos eficiente Genoma mais parecido com SIV de macaco do que HIV-1

12 Classificação em categorias (CDC 1993) Categorias clínicas (reflete o espectro clínico e a progressão da doença) A Infecção aguda Assintomática Linfoadenopatia generalizada e persistente Células CD4+/uL > <200 A1 A2 A3 B Sintomático, diferente das condições A e C B1 B2 B3 C Condições indicadoras da AIDS incluindo doença neurológica, infecção secundária ou neoplasias C1 C2 C3

13 Infecções oportunistas e neoplasias definidoras de AIDS Infecções Protozoários e helmintos Fungos Bactérias Vírus Neoplasias/ SNC Agentes Criptosporidiose ou isosporidiose enterites com duração > 1 mês Pneumocistose pneumonia ou infecção disseminada Toxoplasmose pneumonia ou infecção do SNC Candidíase (esôfago, traquéia e pulmões) Criptococose (SNC) Coccidiodomicose (disseminada) Histoplasmose (disseminada ou extrapulmonar) Micobacteriose (atípica, disseminada ou extrapulmonar), M. tuberculosis (pulmonar ou extra-pulmonar) Salmonela (disseminada) CMV (pulmonar, intestinal, retinite ou SNC) HSV ou varicela zoster (localizado duração > 1 mês ou disseminado) Leucoencefalopatia multifocal progressiva Sarcoma de Kaposi Linfoma de células B não-hodgkin Câncer invasivo cérvico-uterino invasivo Encefalopatia relacionada ao HIV Ref. Robins, 2004

14 Infecções oportunistas e neoplasias definidoras de AIDS Candidíase oral Pneumonite por CMV Sarcoma de Kaposi Linfoma

15 Onde e como age o coquetel de drogas contra o HIV?

16 Highly Active AntiRetroviral Therapy (HAART) ANÁLOGO DE NUCLEOSÍDEOS (INIBIDORES DA TRANSCRIPTASE REVERSA) Azitotimidina, 1987 (AZT, zidovudina e outros) Análogo sintético da timidina é incorporado ao DNA no lugar da timidina Outros análogos: didadosina (ddi), zacitabina (ddc), stavudina (d4t), lamivudina (3TC) ANÁLOGO NÃO NUCLEOSÍDICO DA TRANSCRIPTASE REVERSA Nevirapine, Liga-se à subunidade p66 da TR do HIV que tem uma região hidrofóbica que constitui o sítio de ligação com esses análogos INIBIDORES DE PROTEASE Saquinavir (age na clivagem de proteínas virais estruturais que forma o core maduro do vírus) Outros inibidores de protease: ritonavir, indinavir, nelfinavir, etc. Ref. Trabulsi & Alterthum, 2008

17 Indicação de tratamento anti-retroviral Pacientes sintomáticos infectados por HIV Assintomáticos com linfócitos T CD4+ abaixo de 200/mm3 Assintomático com linfócitos T CD4+: /mm3 considerando carga viral e características do paciente Gravidez e parto de mães infectadas: HAART pode reduzir a transmissão vertical em > 90% (AIDS Mar 27;26(6):757-63) Exposição ocupacional é uma emergência médica: iniciar o tratamento o mais breve possível, 2h até 72h

18 Diagnósticos imunológicos para detecção de infecção por HIV

19 Diagnósticos imunológicos para detecção de infecção por HIV Métodos principais: ELISA Imunofluorescência Indireta Western Blotting PCR Testes Rápidos Usado para detectar: Anticorpos Antígenos Ácido nucléico do vírus

20 ELISA anti-hiv-1-p24 HIV-1 p24 E S S S lavagens lavagens E E lavagens S E P E Anticorpos anti-hiv- 1-p24 adsorvidos Antígeno liga-se ao anticorpo Um segundo anticorpo, acoplado (biotinaestreptavidina) à uma enzima (peroxidase), liga-se ao complexo antígeno-anticorpo Substrato é adicionado e convertido pela enzima em um produto com uma determinada cor. A coloração é proporcional à quantidade de antígeno Também são usados anticorpos contra gp120, gp160 e gp41

21 ELISA indireto ELISA Antígenos virais obtidos do soro do paciente Primeiro teste sorológico desenvolvido para detectar infecção de HIV Pode ser usado para detectar a presença de anticorpos no soro do paciente (nesse caso, o antígeno do HIV é adsorvido na placa) Vantagens: Fácil de fazer Altamente adaptável para testar lotes Altamente sensível e específico Muito útil para: Triagem de produtos de sangue Monitorar e diagnosticar pacientes Pesquisa científica Existem diferentes tipos de ELISA (competitivo, indireto, sanduíche) Pode ocorrer falsos positivos (doenças autoimunes, alcolismo, sífilis, doenças imunoproliferativas) Mais inespecífico porque muitas outras proteínas do soro vão ser adsorvidas na placa

22 Imunofluorescência Indireta Para detectar anticorpos Antígeno do HIV (ou células infectadas por HIV) Anticorpo anti-ig humana marcado com fluoróforo Soro do paciente Detecção de fluorescência

23 Imunofluorescência Indireta Para detectar o vírus Células infectadas do paciente Anticorpo anti-ig humana marcado com fluoróforo Anticorpos anti-hiv Detecção de fluorescência

24 Western Blotting Antígenos do HIV Anticorpos anti-hiv presentes no soro de pacientes O aparecimento de bandas confirma a presença de anticorpos Para ser considerado positivo para HIV, são necessárias 2 bandas: p24 e gp41 ou gp120/160 (critério do CDC) Anticorpo anti-ig humana marcados com isótopos radioativos ou acoplados a enzimas

25 Western Blotting Controle negativo Controle positivo Amostra 1 Amostra 2 Amostra 3 Amostra 4 Amostra 5 Amostra 6 Amostra 7

26 Western Blotting

27 Western Blotting Anticorpos contra p24 e p55 aparecem primeiro mas diminuem depois ou se tornam indetectáveis Anticorpos contra gp41, gp120 e gp160 aparecem depois mas ficam presentes em todos os estágios da doença gp160 gp120 p68 p55 p53 gp41-45 p40 p34 p24 p18 p12 Início recente avançado 7d 14d 21d 2me 6me 1a 2a 3a +8a

28 Western Blotting É um dos testes confirmatórios (não de triagem) mais populares Especificidade > 99% se combinada com ELISA Relativamente caro, tecnicamente difícil, a interpretação é visual e faltam padronizações Resultados indeterminados (algumas bandas aparecem mas não o suficiente para ser considerado HIV positivo) podem ser devido: Transfusões de sangue anteriores (até de pessoas não infectadas) Infecções anteriores ou atuais de sífilis ou malária Doenças auto-imunes Infecção com outros retrovírus Segunda gravidez (ou posteriores)

29 PCR Amostras (sangue, saliva, urina) Purificação do DNA ou RNA+RT (para cdna) Altíssima sensibilidade Relativamente caro (pool de 8 a 24 amostras durante a triagem) Amplificação por PCR Pode medir carga viral (monitorar tratamento) Detecção de bandas Quantificação (PCR em tempo real)

30 Testes rápidos Uni-Gold Recombigen OraQuick Advance Ensaios qualitativos Extremamente rápidos (5 a 20 minutos) Relativamente baratos Não é um teste confirmativo Testes: OraQuick Rapid HIV-1 and ADVANCE Rapid HIV-1/2 Antibody Tests Uni-Gold Recombigen HIV test Reveal G2 Rapid HIV-1 Antibody Test Multispot HIV-1/HIV-2 Rapid Test Clearview HIV 1/2 Stat-Pack and COMPLETE 1/2 Test Kits INSTI HIV-1 Antibody Test

31 OraQuick Advance Encostando nas gengivas, colete fluido oral (não é saliva) Insira o dispositivo na solução Linhas nas zonas C (controle) e T é um resultado preliminar positivo

32 Interpretando os resultados dos testes rápidos Exemplo 1. Especificidade do teste = 99.6% (996 em 1000 serão verdadeiro negativos e 4 falso positivos) Se a prevalência de HIV na população for de 10%: Verdadeiro positivos: 100 (10% de 1000) Falso positivos: 4 (99.6% da especificidade do teste) Valor preditivo do teste: 100/104 = 96% Se o teste der positivo, há 96% de chance de o paciente ser positivo Sensibilidade: Probabilidade do teste = positivo, quando o paciente = positivo Especificidade: Probabilidade do teste = negativo, quando o paciente = negativo Valor preditivo do teste: Probabilidade do paciente = positivo, quando o teste = positivo Probabilidade do paciente = negativo, quando o teste = negativo

33 Interpretando os resultados dos testes rápidos Exemplo 1. Especificidade do teste = 99.6% (996 em 1000 serão verdadeiro negativos e 4 falso positivos) Se a prevalência de HIV na população for de 10%: Verdadeiro positivos: 100 (10% de 1000) Falso positivos: 4 (99.6% da especificidade do teste) Valor preditivo do teste: 100/104 = 96% Exemplo 2. Especificidade do teste = 99.6% (996 em 1000 serão verdadeiro negativos e 4 falso positivos) Se a prevalência de HIV na população for de 0,4%: Verdadeiro positivos: 4 (0.4% de 1000) Falso positivos: 4 (99.6% da especificidade do teste) Valor preditivo do teste: 4/8 = 50%

34 Interpretando os resultados dos testes rápidos Especificidade do teste 99,9% 99,1% 99,7% HIV Prevalence OraQuick Reveal Uni-Gold 10% 99% 92% 98% 5% 98% 85% 96% 2% 95% 69% 91% 1% 91% 53% 83% 0,5% 83% 36% 71% 0,3% 75% 25% 60% 0,1% 50% 10% 33% O valor preditivo de um teste vai depender da especificidade e vai variar de acordo com a prevalência da doença

35 Algoritmo para diagnóstico laboratorial IE = Imuno Ensaio IFI = Imunofluorescência indireta IB/WB = Imunoblot IC = inconclusivo I = Indeterminado (-) = Não reagente (+) = reagente Adaptado do ministério da saúde

36 Referências Vaz, A.; Takei, K e Bueno, EC (2007) Imunoensaios, fundamentos e aplicações.1a ed, Rio de Janeiro. Editora Guanabara-Koogan. Ferreira, AW e Ávila, SLM (2001) Diagnóstico Laboratorial das principais doenças infecciosas e auto-imnunes.2a ed, Rio de Janeiro. Editora Guanabara-Koogan. Kindt, TJ; Goldsby, RA e Osborne, BA (2008) Imunologia de Kuby. 6ª ed, Porto Alegre, Artmed.