IDENTIFICAÇÃO DE RECEPTORES GABAÉRGICOS EM SÍTIOS NEURAIS ENVOLVIDOS NA INTOXICAÇÃO PELA FRUTA CARAMBOLA EM RATOS NEFROPATAS

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1 IDENTIFICAÇÃO DE RECEPTORES GABAÉRGICOS EM SÍTIOS NEURAIS ENVOLVIDOS NA INTOXICAÇÃO PELA FRUTA CARAMBOLA EM RATOS NEFROPATAS Aluna: Layla Alves Rodrigues da Silva Orientadora: Prof. Dr. Sandra Regina Mota Ortiz

2 INTRODUÇÃO Averrhoa carambola A intoxicação possui 3 níveis: leve, moderada ou grave

3 Fisiopatologia Caramboxina Ácido oxálico GABA (CAROLINO et al., 2005; FANG et al,. 2008)

4 GABA Inibição Gaba A: ionotrópico Gaba B: metabotrópico (BRADFORD, 1995) C-FOS Ferramenta para revelar variações do nível de intensidade de atividade celular c-fos primeiro proto-oncogene associado a crises epilépticas.

5 Células c-fos+ foram identificadas no Locus coeruleus (LC) e no Paraventricular do Hipotálamo (PVH) do encéfalo de ratos nefropatas que ingeriram suco de carambola. Imagem 1: Fotomicrografia de corte coronal do encéfalo de ratos nefropatas que ingeriram via intragastrica suco de carambola, imunorreagidos contra a proteína nuclear c-fos. Barra de escala: 100μm. FIG. A: Locus coeruleus. FIG. B: Paraventricular do Hipotálamo. (LINS et al., 2014)

6 OBJETIVOS Identificar o padrão de expressão de receptores GABA A e GABA B no Núcleo Paraventricular do hipotálamo (PVH) e no Locus coeruleus (LC) de ratos. Identificar a possível co-localização entre a imunorreatividade da proteína c-fos e dos receptores GABA A e GABA B no PVH e no LC.

7 MATERIAIS E MÉTODOS 10 ratos albinos (Rattus norvegicus, linhagem Wistar), machos e adultos. Grupos controles e experimentais. O quadro abaixo resume os procedimentos realizados nos grupos. Em todos os animais os encéfalos foram retirados e imunohistoquimicamente processados com anticorpo contra a proteína c-fos, GABA A e GABA B.

8 RESULTADOS Imagem 2: Fotomicrografias em campo claro do encéfalo de ratos do grupo BCO imunorreagidos com a proteína nuclear c-fos. Nas Figuras A - C os cortes verificados são do Locus coeruleus (LC). Nas Figuras D - F os cortes verificados são do núcleo Paraventricular do Hipotálamo (PVH). Fig.3A e 3D os cortes sofreram um aumento de 40x com barra de escala de 200μm. Fig.3B e 3E os cortes sofreram aumento de 100x com barra de escala de 100μm. Fig.3C e 3F os cortes sofreram aumento de 200x com barra de escala de 50μm.

9 Imagem 3: Fotomicrografias em campo claro do encéfalos de ratos do grupo NFC imunorreagidos com a proteína nuclear c-fos. Nas Figuras A - C os cortes verificados são do Locus coeruleus (LC). Nas Figuras D - F os cortes verificados são do núcleo Pavaventricular do Hipotálamo (PVH). Fig.4A e 4D os cortes sofreram um aumento de 40x com barra de escala de 200μm. Fig.4B e 4E os cortes sofreram aumento de 100x com barra de escala de 100μm. Fig.4C e 4F os cortes sofreram aumento de 200x com barra de escala de 50μm.

10 Imagem 4: Fotomicrografias da região do mesencéfalo em campo claro do encéfalo de rato do grupo BCO perfundido com paraformaldeído 2%. Todos os cortes sofreram aumento de 200x com barra de escala de 50μm. Nas Figuras A a C os cortes verificados foram imunorreagidos com o receptor GABA A. Nas Figuras D a F os cortes verificados foram imunorreagidos com o receptor GABA B. Fig.5A e 5D cortes com concentrações 1:250. Fig.5B e 5E cortes com concentrações 1:500. Fig.5C e 5F cortes com concentrações 1:1000

11 Imagem 5: Fotomicrografias da região do mesencéfalo em campo claro do encéfalo de rato do grupo BCO perfundido com paraformaldeído 4%. Todos os cortes sofreram aumento de 200x com barra de escala de 50μm. Nas Figuras A a C os cortes verificados foram imunorreagidos com o receptor GABA A. Nas Figuras D a F os cortes verificados foram imunorreagidos com o receptor GABA B. Fig.6A e 6D cortes com concentrações 1:250. Fig.6B e 6E cortes com concentrações 1:500. Fig.6C e 6F cortes com concentrações 1:1000

12 Imagem 6: Fotomicrografias em campo claro do encéfalo de rato do grupo NFC. Todos os cortes foram imunorreagidos com o receptor GABA A. Nas Figuras A e B é verificado o Locus coeruleus. Nas Figuras C e D é verificado o núcleo Paraventricular do Hipotálamo. Nas Figuras 7A e 7C os cortes verificados sofreram aumento de 40x com barra de escala de 200μm. Nas Figuras 7B e 7D os cortes verificados sofreram aumento de 200x com barra de escala de 50μm.

13 Imagem 7: Fotomicrografias em campo claro do encéfalo de rato do grupo NFC. Todos os cortes foram imunorreagidos com o receptor GABA B. Nas Figuras A e B é verificado o Locus coeruleus. Nas Figuras C e D é verificado o núcleo Paraventricular do Hipotálamo. Nas Figuras 8A e 8C os cortes verificados sofreram aumento de 40x com barra de escala de 200μm. Nas Figuras 8B e 8D os cortes verificados sofreram aumento de 200x com barra de escala de 50μm.

14 Imagem 8: Fotomicrografias em campo claro do encéfalo de rato do grupo NFC. Todos os cortes foram imunorreagidos com a proteína nuclear c-fos da marca SANTA CRUZ. Nas Figuras A e B é verificado o núcleo Paraventricular do Hipotálamo e os cortes foram imunorreagidos com anticorpo primário (c-fos) pelo período de overnight. Nas Figuras C e D é verificado o Locus Coeruleus e os cortes foram imunorreagidos com a proteína nuclear c-fos por 72horas. Nas Figuras 9A e 9C os cortes verificados sofreram aumento de 40x com barra de escala de 200μm. Nas Figuras 9B e 9D os cortes verificados sofreram aumento de 200x com barra de escala de 50μm.

15 Imagem 9: Fotomicrografias em campo claro do encéfalo de rato do grupo NFC. Todos os cortes foram imunorreagidos com a proteína nuclear c-fos da marca CALBIOCHEM. Nas Figuras A e B é verificado o Locus coeruleus e os cortes foram imunorreagidos com anticorpo primário (c-fos) pelo período de overnight. Das Figuras C a F é verificado o núcleo Paraventricular do Hipotálamo. Nas Fig. 10C e 10D os cortes foram imunorreagidos na proteína c-fos pelo período de 12 horas. Nas Fig. 10E e 10F os cortes foram imunorreagidos na proteína c-fos pelo período de 72 horas. As Fig. 10A, 10C e 10E os cortes verificados sofreram aumento de 40x com barra de escala de 200μm. Nas Fig. 10B, 10D e 10F os cortes verificados sofreram aumento de 200x com barra de escala de 50μm.

16 É possível que as crises convulsivas geradas por conta da intoxicação pela fruta carambola acarrete em um desequilíbrio neuronal, gerando um bloqueio dos receptores GABAérgicos (inibindo os canais permeáveis de íons cloro, cálcio e potássio), que ocasiona um aumento da expressão de células c-fos+ por conta do aumento da excitabilidade cerebral. A expressão de receptores GABA em ratos nefropatas é intensa no PVH e no LC, mesmas áreas onde foi notado aumento da expressão de c-fos. Estes núcleos podem ser alvos diretos da ação tóxica provocada pela carambola, ou podem atuar em circuito de proteção envolvendo mediação GABAérgica frente a outras áreas em desequilíbrio neuroquímico-funcional. Por motivo de importação, os procedimentos não puderam ser finalizados, porém com os resultados positivos que obtivemos até o momento, uma nova aquisição será realizada para que os experimentos continuem.

17 CONCLUSÃO Com estudos envolvendo a maquinaria neuroquímica dos núcleos PVH e LC em intoxicações por carambola, é possível sugerir o envolvimento da neurotransmissão com o GABA (detectando receptores GABA A e GABA B em regiões c-fos+), ajudando a elucidar os processos que abrangem as manifestações clinicas e os distúrbios funcionais da carambola em nefropatas.

18 REFERÊNCIAS BRADFORD, H.F. Glutamate, GABA and Epilepsy. Progress in Neurohiology. Vol. 47.pp.477 to 51 I CAROLINO, R.O.; BELEBONI, R.O.; PIZZO, A.B.; VECCHIO, F.D.; CAIRASCO, N.G.; NETO, M.M, et al. Convulsant activity and neurochemical alterations induced by a fraction obtained from fruit Averrhoa carambola (Oxalidaceae: Geraniales). Neurochem Int FANG, H.C.; LEE, P.T.; LU, P.J.; CHEN, C.L.; CHANG, T.Y.; HSU, C.Y.; CHUNG, H.M.; CHOU, K.J. Mechanisms of star fruit-induced acute renal failure. Food and Chemical Toxicology. Volume 46, Issue 5, May 2008, Pages LINS, M.C.; ANTUNES, G. L.; DAMAS-GARCIA, R. P.; TSURUTA, M. M.; ACHAR, E. ; MOTA-ORTIZ, S.R.; BALLESTER, G.; TOLEDO, C. A.B. (in memorian); SANTANA, R. F. Identificação dos sítios neurais envolvidos em crises convulsivas após ingestão de suco de carambola em animais nefropatas. Anais do XXXVIII Congresso da Sociedade Brasileira de Neurociência e Comportamento (SBNEC 2014). Búzios, RJ, Brasil de setembro 2014.

19 AGRADECIMENTOS Professor Mestre Renato Figueiredo Santana Marcia Maria Tsuruta