A RELAÇÃO DA COX-2 E OS CARCINOMAS MAMÁRIOS EM CADELAS

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1 Revisão Clínica Médica de Pequenos Animais A RELAÇÃO DA COX-2 E OS CARCINOMAS MAMÁRIOS EM CADELAS The relationship of COX-2 and the mammary carcinomas in dogs MV MSc Rosana L. Salvador-Bernabé 1, Dr. Carlos E. Fonseca-Alves 2, Profa. Dra. Mirela Tinucci Costa 1, Profa. Dra. Renee Laufer-Amorim 2 * RESUMO As neoplasias mamárias são os tumores mais comuns em cadelas e as neoplasias malignas representam mais de 70% de subtipos histológicos de tumores mamários caninos no Brasil e cerca de 50% em outros países. O tratamento das neoplasias mamárias em cadelas é um desafio, e o procedimento cirúrgico constitui a melhor opção terapêutica para os tumores não metastáticos. A cicloxigenase (COX) é uma classe de enzimas responsável pela ciclooxigenação e peroxidação do ácido aracdônico proveniente da membrana celular, levando a formação de prostaglandinas. A COX-2 é expressa de forma constitutiva em poucos tecidos, mas pode ser induzida em condições patológicas específicas, tais como, processos inflamatórios e neoplásicos. Em cadelas, vários estudos demonstraram que a COX-2 está expressa em carcinomas mamários e que uma alta expressão proteica se relaciona com o aumento da angiogênese tumoral, grau de malignidade e pior prognóstico. A expressão da COX- 2 em neoplasias mamárias é considerada um fator preditivo em potencial, devido à possibilidade da associação de inibidores seletivos para COX-2 em tratamentos adjuvantes. Este trabalho buscou revisar a expressão de COX-2 em neoplasias mamárias caninas já descritas em pesquisas, visto que é crescente a evidência de estudos relacionados a este assunto visando à possibilidade de terapias-alvo. PALAVRAS-CHAVE: câncer, carcinoma, cicloxigenase-2, fator preditivo Universidade Estadual Paulista (Unesp), Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, Departamento de Clínica e Cirurgia Veterinária, Jaboticabal, SP, Brasil. 2. Universidade Estadual Paulista (Unesp), Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Departamento de Clínica Veterinária, Botucatu, São Paulo, Brasil. * renee@fmvz.unesp.br ABSTRACT Mammary tumors are the most common tumors in female dogs and malignant neoplasm represents more than 70% of histological subtypes of canine mammary tumors in Brazil and about 50% in other countries. The treatment of canine mammary tumors is a challenge and the surgical procedure is the best therapeutic option for non-metastatic tumors. Cyclooxygenase (COX) is a class of enzymes responsible for cyclooxygenation and peroxidation of arachidonic acid from the cell membrane, leading to the formation of prostaglandins. Constitutive COX-2 expression occurs in few tissues but can be induced under specific pathological conditions, such as inflammatory and neoplastic processes. In dogs, several studies have shown that COX-2 is expressed in mammary carcinomas and that a high protein expression is associated with the increase of tumor angiogenesis, the degree of malignancy and consequently worse prognosis. The expression of COX-2 in canine mammary tumors is considered a potential predictive factor, due to the possibility of the selective COX-2 inhibitors association in adjuvant treatments. This study aimed to review the expression of COX-2 in canine mammary tumors, since there is growing evidence of studies related to this subject aiming at the possibility of target therapies. KEY-WORDS: cancer, carcinoma, cyclooxygenase-2, predictive factor.

2 INTRODUÇÂO Os tumores mamários são as neoplasias mais comuns em cadelas (SORENMO et al. 2013; CASSALI et al. 2014), com uma incidência estimada de mais de 70% de tumores mamários caninos malignos no Brasil (OLIVEIRA-FILHO et al. 2010) e cerca de 50% em outros países (SORENMO et al. 2013). Nos seres humanos, o câncer de mama é o mais prevalente e a quinta causa de morte relacionada ao câncer em mulheres em todo o mundo (FERLAY et al. 2015). Esses dados epidemiológicos são escassos para as cadelas. Em alguns estudos com cadelas com neoplasia mamária, os autores afirmam que 50% das pacientes morreram devido à neoplasia mamária (PEÑA et al. 1998; QUEIROGA et al. 2005; ARENAS et al. 2016). Nos últimos anos, as pesquisas sobre a associação da inflamação com a carcinogênese mamária aumentaram em ambas as espécies demonstrando um papel significativo entre o sistema imunológico associado às células tumorais e a progressão neoplásica (CARVALHO et al. 2016). A cicloxigenase (COX), conhecida também como prostaglandina-endoperóxido sintase (PGHS) é grupo de enzimas responsáveis pela ciclooxigenação e peroxidação do ácido aracdônico proveniente da membrana celular, levando a formação de prostaglandinas (HAYES, 2007). As enzimas COX podem ser categorizadas em três tipos: COX-1, COX-2 e COX-3, sendo as duas primeiras mais pesquisadas e a COX-3 descoberta posteriormente (ROUZER e MARNETT, 2009; DORE, 2011). A COX-1 é expressa constitutivamente em todos os tecidos e mantém a concentração basal de prostaglandina E2 (PGE2) para realizar funções biológicas básicas de homeostase, tais como, proteção da mucosa epitelial do trato gastrointestinal, perfusão renal, agregação plaquetária e no sistema nervoso central (MOHAMMED et al. 2004; CLIFFORD, 2005). A COX-2 pode ser expressa constitutivamente em situações fisiopatológicas tais como inflamação, ovulação, crescimento e diferenciação e carcinogênes (DORÉ et al. 2011). Em cadelas, vários estudos demonstraram a expressão proteica de COX-2 em carcinomas mamários, associada com angiogênese tumoral, aumento do grau de malignidade e consequentemente pior prognóstico (DORÉ et al. 2003; MOHAMMED et al. 2004; QUEIROGA et al. 2007; QUEIROGA et al. 2011). Alguns estudos sugerem ainda que cadelas que apresentam tumores com alta expressão de COX-2 podem se beneficiar com a terapia com os inibidores seletivos de COX-2 (SOUZA et al. 2009; LAVALE et al. 2012; ARENAS et al. 2016). A expressão da COX-2 em carcinomas mamários caninos é considerada um fator preditivo importante, visto que o uso de inibidores seletivos para COX-2 é uma possibilidade na rotina clínica para esta espécie. COX-2 E O CÂNCER Um grande número de evidências sugerem que as prostaglandinas derivadas da COX contribuem para a tumorigênese em seres humanos. O câncer colorretal foi a primeira neoplasia onde o papel da COX-2 e as prostaglandinas foram relacionadas, após estudos epidemiológicos que revelaram que pacientes que usaram antiinflamatórios não esteroidais para alívio da dor em casos de tumores gastrointestinais apresentaram regressão do tumor (HAYES, 2007). Esta observação foi seguida por uma série de estudos que demonstraram que a COX-2 está superexpressa no câncer 14 colorretal. Estudos de avaliação imuno-histoquímica revelaram que a COX-2 estava presente no epitélio do cólon e além disso, os níveis de PGE2, um dos principais metabólitos da COX-2 estavam elevados em tecidos colônicos neoplásicos em comparação com tecido normal (RIGAS et al. 1993; PUGH e THOMAS, 1994). Em outros estudos foi observada uma redução de 40-50% do risco de desenvolvimento de câncer de cólon e reto em pessoas que usavam regularmente antiinflamatórios não esteroidais (GROSCH et al. 2006; HAYES, 2007). Vários mecanismos foram propostos para explicar essa relação entre a expressão de COX-2, o aumento da produção de prostaglandinas nas células tumorais e o processo de carcinogênese. A COX-2 e seus produtos podem inibir a apoptose, estimular a angiogênese, diminuir a adesão celular e destruição da membrana basal favorecendo invasão, metástase e pode causar interferência na vigilância imunológica levando à imunossupressão e manutenção da resposta inflamatória (Figura 1) (WILLIAMS et al. 1999; MILLANTA et al. 2006; HAYES, 2007).

3 15 Figura 1. A COX-2 e seus produtos podem estimular a inibição da apoptose, aumento da angiogênese, diminuição da adesão celular e destruição da membrana basal favorecendo a invasão e metástase, imunossupressão e manutenção da resposta inflamatória. Fonte: Adaptada de Hayes (2007). A diminuição da apoptose devido ao aumento da expressão de COX-2 nas células neoplásicas favorece a sobrevivência dessas células e favorece o acúmulo de mutações genéticas sucessivas, contribuindo para a progressão do tumor (KANAOKA, 2007). A superexpressão de COX-2 também está relacionada com o aumento na expressão de fatores de crescimento do endotélio vascular (VEGF), e consequentemente com o processo de angiogênese, que é considerado um mecanismo fundamental para o desenvolvimento tumoral, uma vez que contribui para a nutrição das células neoplásicas e é uma importante via para disseminação metastática (GROOT, 2007; KANAOKA, 2007). Uma correlação positiva foi demonstrada entre a expressão de COX-2 e de VEGF em tumores de mama em humanos (GROOT, 2007) e em cadelas (QUEIROGA et al. 2011). Kanaoka et al. (2007) demonstraram que o aumento na expressão de COX-2 está relacionado ao aumento na atividade de determinadas proteínas, como as metaloproteinases, enzimas responsáveis pela digestão do colágeno na matriz intercelular, permitindo o rompimento das barreiras e permitindo a invasão tecidual (GROOT, 2007). Araújo et al. (2016) correlacionaram a alta expressão de COX-2 com a pesença de metástase nodal em cadelas com neoplasia mamária. Um dos principais mediadores da inflamação são as PGs biosintetizadas pela COX-2. Elas se acumulam rapidamente no local danificado e induzem uma resposta vascular responsável pelo início e manutenção do estado inflamatório. As PGs também participam do mecanismo de inflamação crônica. Um dos motivos da inflamação contribuir para carcinogênese é devido a formação local excessiva de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio que causam dano oxidativo e nitração do DNA levando ao acúmulo de mutações genéticas e desestabilização do genoma (SOBOLEWSKI et al. 2010). Além do dano ao DNA, a inflamação também facilita a liberação de fatores de crescimento no microambiente tumoral acelerando a proliferação neoplásica. Existem também muitas áreas de hipóxia e ácidas no tecido tumoral na qual ocorre a morte celular maciça. Este fenômeno constitui um sinal errôneo para o sistema imunológico do hospedeiro que imediatamente ativa as vias de sinalização responsáveis pelo reparo tecidual e regeneração, permitindo assim que as células tumorais sobrevivam. Células imunes que existem dentro do microambiente tumoral incluindo células dendríticas, linfócitos e macrófagos, liberaram várias citocinas pró-inflamatórias, como TNFa, IL1b, IL6 e IL8, induzindo inflamação secundária. Toda essa falha no sistema imunológico pode favorecer o desenvolvimento tumoral (SOBOLEWSKI et al. 2010; CARVALHO et al. 2016; REGULSKI et al. 2016). O sistema imune tem papel fundamental no controle do desenvolvimento de células neoplásicas. Em situações normais, o organismo é capaz de destruir clones de células transformadas ou combater células tumorais já formadas. A expressão de COX- 2 e consequente produção de prostaglandinas podem levar a supressão na produção de linfócitos B e T, diminuição na produção de linfocinas, formação de células Natural Killers e células dendríticas (KANAOKA, 2007). A COX-2 também reduz a síntese de TNFα e aumenta a atividade imunossupressora da interleucina-10 (IL-10). Essas anormalidades, por sua vez, inibem a eficiência da defesa do hospedeiro na detecção e destruição de células malignas, promovendo assim sua proliferação descontrolada. A hipótese da imunossupressão relacionada à COX-2 é sugerida por estudos publicados que mostram que a diminuição da expressão de COX-2 em células de câncer de mama resultou em aumento da infiltração do tecido por linfócitos T citotóxicos (CD8 +). Além disso, o uso dos inibidores seletivos de COX-2 em câncer de mama de mulheres induziu um recrutamento aprimorado de células imunes para o microambiente tumoral (RAKOFF-NAHOUM 2006; REGULSKI et al. 2016). Em neoplasias mamárias caninas existe um número limitado de estudos direcionados na relação entre a COX-2, células neoplásicas e células do sistema imune (CARVALHO et al. 2015; CARVALHO et al. 2016). Carvalho et al. (2015) demonstraram uma associação significativa da elevada imunoexpressão de COX-2 com linfócitos T CD3+ em neoplasias mamárias de cadelas. Já em 2016, o mesmo grupo de pesquisadores identificaram associação da alta expressão de COX-2 com macrófagos MAC387 (CARVALHO et al. 2016). Os tumores com alta expressão de COX-2/CD3+ e COX-2/MAC foram associados com variáveis de agressividade do tumor, tais como, grau histológico alto de malignidade, presença de embolia intravascular neoplásica, presença de metástase em linfonodos e menor sobrevida global dos animais. Esses achados sugeriram que de forma semelhante ao câncer de mama humano, os linfócitos T, macrófagos e COX-2 compartilham funções na carcinogênese mamária canina (CARVALHO et al. 2016). COX-2 em neoplasias mamárias de cadelas Em neoplasias mamárias de cadelas, a alta expressão de COX-2 está associada com a aumento da malignidade (DORÉ et al. 2003; MOHAMMED et al. 2004; QUEIROGA et al. 2007), com diminuição da sobrevida (LAVALLE et al. 2009), aumento dos níveis de VEGFA e angiogênese (QUEIROGA et al. 2011).

4 16 O primeiro artigo publicado que avaliou a expressão proteica de COX-2 em neoplasias mamárias de cadelas foi de Doré et al. (2003), os quais avaliaram 147 tumores mamários e 4 mamas normais. Neste estudo os autores observaram que a COX-2 não estava expressa na glândula mamária normal, mas foi detectada em 24% dos adenomas e em 56% dos adenocarcinomas. A distribuição e a intensidade da imunomarcação de COX-2 foram maiores em adenocarcinomas do que nos adenomas. Estes resultados demonstraram pela primeira vez que a expressão de COX-2 foi mais frequente e mais intensa em tumores malignos quando comparada aos benignos, sugerindo um papel potencial da COX-2 na carcinogênese mamária. Já Heller et al. (2005) investigaram pela primeira vez a associação direta entre níveis de expressão de COX-2 e subtipo histológico de carcinomas mamários em cadelas. Os autores relatam que a expressão de COX- 2 foi detectada em 28 de 50 (56%) amostras avaliadas e que os carcinomas anaplásicos apresentaram uma distribuição, intensidade e índice de coloração de COX-2 significativamente maior em comparação com adenocarcinomas. Com relação à sobrevida, a expressão elevada de COX- 2 foi associado com pior prognóstico, demonstrado por diferenças na sobrevida global, descrito por Millanta et al. (2006) em estudo realizado com 28 cadelas com neoplasia mamária. Queiroga et al. (2005), Queiroga et al. (2010) e Lavalle et al. (2009), também observaram que as cadelas com neoplasia mamária e com alta expressão de COX-2 apresentaram sobrevida e tempo livre de doença reduzidos. Outros estudos descrevem uma relação entre o aumento da imunomarcação da COX-2 em carcinomas mamários não metastáticos e metastáticos quando comparados com lesões benignas e mamas normais em cadelas (DIAS PEREIRA et al. 2009; DE NARDI et al. 2013). Queiroga et al. (2007) avaliando 70 amostras de mama (4 mamas normais, 6 hiperplasias mamárias, 21 tumores benignos e 39 malignos) também descreveram que a expressão de COX-2 foi maior em tumores malignos do que em lesões benignas. Guimarães et al. (2013) realizaram um estudo com 43 tumores de mama em cadelas, observando que a imunomarcação de COX- 2 e EGFR estava correlacionada com o tamanho do tumor, índice mitótico, grau nuclear, grau histológico de malignidade e metástase nodal. Estes autores sugeriram ainda que a utilização combinada de inibidores seletivos da COX-2 e EGFR poderia ser uma abordagem útil para o tratamento dos tumores mamários malignos em cadelas, porém não fizeram avaliação terapêutica. Alguns estudos mostraram uma associação entre a expressão de COX-2 e VEGF em neoplasias mamárias (QUEIROGA et al. 2011; CLEMENTE et al. 2013). Clemente et al (2013) e Arenas et al. (2016) encontraram uma maior imunoexpressão de COX-2 em células neoplásicas isoladas de alto grau infiltradas no estroma da glândula mamária e em êmbolos de células neoplásicas em vasos linfáticos e os autores acreditam que isso poderia estar relacionados a possível influência da COX-2 na migração e mobilidade celular. Em estudo com linfonodos metastáticos de tumores mamários, Araújo et al. (2016) demonstraram que houve correlação entre a alta expressão de COX-2 nos carcinomas primários mamários com a sua metástase em linfonodo. Porém, a expressão de COX- 2 na metástase nodal não demonstrou relevância prognóstica na sobrevida dos pacientes. A expressão gênica de COX-2 foi relatada pela primeira vez por Clemente et al. (2013) que descreveram que os níveis de RNAm de COX-2 eram maiores em cadelas com carcinoma mamário inflamatório do que em tumores de alto grau e expressavam mais transcritos de COX-2 quando comparados às glândulas mamárias normais e carcinomas mamários não inflamatórios de alto grau de malignidade. Somente este estudo investigou os níveis de RNAm de COX-2 em tumores mamários caninos. Uso de inibidores seletivos de COX-2 em neoplasias mamárias de cadelas Um estudo realizado por Arenas et al. (2016), foram avaliadas 28 cadelas com neoplasia mamária em estágio IV e/ou grau III de malignidade, das quais 8 foram tratadas com quimioterapia adjuvante a base de mitoxantrona, 7 utilizaram firocoxibe e treze cadelas estavam no grupo controle, nas quais os tutores não aceitaram terapia adjuvante. Todas as cadelas foram acompanhados por dois anos ou até o óbito. O tempo livre de doença foi significativamente maior nas pacientes que receberam tratamento adjuvante (mitoxantrona ou firocoxibe) do que nas do grupo controle. As cadelas tratadas com firocoxibe apresentaram tempo livre de doença e sobrevida global significativamente maior do que as cadelas do grupo controle. O tempo livre de doença e a sobrevida global de cadelas tratadas com mitoxantrona não foram estatisticamente diferentes das pacientes do grupo controle. O achado mais importante deste estudo foi que o firocoxibe prolongou o tempo de sobrevida global e aumentou tempo livre de doença de cadelas com grau neoplasia mamária de grau III e que a maioria dos cães que desenvolveram metástases foram aqueles que não receberam mitoxantrona ou firocoxibe. Machado et al. (2014) realizaram um estudo avaliando a expressão de COX-2 em 19 cadelas com neoplasias mamárias, no qual, 10 cadelas foram incluídas no grupo de tratamento e 9 no grupo controle. As pacientes do grupo controle não receberam nenhum

5 17 tratamento e as cadelas do grupo tratamento foram tratadas com Firocoxibe na dose de 5 mg/kg, a cada 24 horas durante 7 dias. Os autores coletaram fragmentos de biópsia (nos dois grupos) no dia 0 e após 7 dias realizaram mastectomia total unilaterial. Posteriormente avaliaram a expressão de COX-2 nas amostras da biópsia e da mastectomia nos dois grupos. Os autores não encontraram diferença de expressão de COX-2 entre os grupos, no entanto, a expressão de COX-2 aumentou no grupo controle. Outra achado encontrado pelos autores foi a diminuição das globulinas no grupo de animais tratados com firocoxibe. Lavalle et al. (2012) realizaram um importante estudo comparando o período de sobrevida global de 29 cadelas diagnosticadas com tumores mamários avançados, submetidas a quatro diferentes protocolos de tratamento, incluindo cirurgia, quimioterapia com carboplatina e inibidores de COX-2 (piroxicam ou firocoxibe). Neste estudo, a sobrevida global de pacientes com baixa espressão de COX-2 foi mais longa quando comparada aos pacientes com alta expressão de COX-2. Diferentes tratamentos adjuvantes propostos associados à cirurgia levaram a um aumento da sobrevida global quando comparado ao tratamento cirúrgico isolado. Os pacientes que foram submetidos apenas à cirurgia tiveram uma mediana de sobrevida de 63 dias; os que fizeram cirurgia e carboplatina adjuvante não atingiram a mediana, o grupo que realizou a cirurgia, carboplatina adjuvante e piroxicam tiveram uma mediana de sobrevida de 390 dias e os que usaram firocoxibe ao invés do piroxicam, 570 dias. Os autores afirmaram ainda que o firocoxibe foi considerado um ótimo anti-infamatório não esteroidal para uso prolongado em cães. Em um estudo desenvolvido por Souza et al. (2009), observouse melhoria da condição e estabilidade clínica de cadelas com carcinoma inflamatório mamário tratadas com piroxicam, com média e mediana de sobrevida livre de progressão da doença de 171 e 183 dias, respectivamente. O tempo médio de sobrevida de três cães tratados com protocolos com doxorrubicina foi de sete dias, o qual foi significativamente menor do que a dos cães tratados com o piroxicam (185 dias). Sonzogni-Desautels et al. (2010) estudaram o efeito de um inibidor seletivo de COX-2 (Deracoxibe) e um inibidor de COX-1 e 2 (piroxicam) em camundongos com tumores mamários caninos implantados de células originárias de cultivo celular. O volume tumoral, entre 14 e 21 dias após o tratamento, foi significativamente menor nos camundongos tratados com piroxicam em comparação com os do grupo controle. Esses resultados demonstram que a inibição da COX reduziu o crescimento do câncer de mama canino em camundongos, sugerindo que os inibidores de COX poderiam ter um efeito positivo em cães. Em outro estudo, observou-se que os inibidores seletivos de COX-2 meloxicam, etodolac e celecoxibe suprimiram o crescimento de células tumorais em uma linhagem celular de neoplasias mamárias caninas inibindo o crescimento celular e a proliferação, promovendo a diminuição da expressão da proteína COX-2 e induzindo a apoptose (SAITO et al. 2014). Há uma busca contínua para a elucidação dos mecanismos envolvidos no processo carcinogênese mamária canina e, também, para a identificação de fatores prognósticos e preditivos. Além dos tratamentos convencionais, a evolução na biologia molecular e ensaios de cultivo celular podem proporcionar o desenvolvimento de novos protocolos de tratamento dessas neoplasias. Dentre estas terapias, a utilização de fármacos alvo moleculares como os inibidores seletivos de COX- 2 podem ser amplamente estudados como marcadores preditivos e prognósticos na carcinogênese mamária.

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