DIFERENTES SOLUÇÕES DE TESTE HIPOSMÓTICO PARA SÊMEN OVINO ë DIFFERENT SOLUTIONS OF HYPOOSMOTIC TEST FOR RAM SEMEN

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1 DIFERENTES SOLUÇÕES DE TESTE HIPOSMÓTICO PARA SÊMEN OVINO ë DIFFERENT SOLUTIONS OF HYPOOSMOTIC TEST FOR RAM SEMEN Luís Cláudio Oliveira Moura 1, Maíra Corona da Silva 2 e Paola Pereira das Neves Snoeck 3 ABSTRACT. Moura L.C.O., Silva M.C. & Snoeck P.P. das N. [Different solutions of hypoosmotic test for ram semen]. Diferentes soluções de teste hiposmótico para sêmen ovino. Revista Brasileira de Medicina Veterinária, 32(3): , Departamento de Ciências Agrárias e Ambientais, Universidade Estadual de Santa Cruz, Rodovia Ilhéus-Itabuna, Km 16, Salobrinho, Ilhéus, BA , Brasil. paolasnoeck@uesc.br The hypoosmotic test (HOS) has even used to evaluate functional integrity of the sperm membrane of many domestic mammals species and is based on the fluids exchange from the intracellular with the extracellular medium until a balance is accomplished. The aim of this study was to compare two different solutions of HOS test for fresh and cooled ram semen, using the fructose-sodium citrate and sucrose solutions, both with 100 mosmol/l. Eight fresh semen samples and 128 cooled semen samples were evaluated. For each semen sample, two aliquots of 25 μl were taken. One aliquot was added in eppendorf, containing 200 μl fructose-sodium citrate and another was added to 200 ml sucrose solution. The two samples were incubated for thirty minutes at 37 o C in water bath and then fixed in 300 μl buffered formalin saline solution. The reactive form was observed in a phase-contrast microscope with oil immersion. The percentage of reactive forms, with functionally membrane, was evaluated after the counting of the coiled/bent tails and either after subtracted of the abnormal tails found before the test. To the fresh semen, the fructose-citrate sodium and the sucrose solution were similar (P>0.05), in the recognition of the reactive forms perceptual, when the count formula was applied. When the count formula was not use, was verified that the fructose-citrate sodium were better than the sucrose (P<0.05). The fructose-citrate sodium solution was better to identify maximal swelling spermatozoa than sucrose solution after HOS test in cooled ram semen (P<0.05). KEY WORDS. Solution, osmotic pressure, fructose-sodium citrate, sucrose, sheep. RESUMO. O teste hiposmótico (HO) vem sendo usado para avaliar a integridade funcional da membrana espermática de várias espécies de mamíferos domésticos e baseia-se na troca de fluido do meio intracelular com o meio extracelular até que haja um equilíbrio. O objetivo deste estudo foi comparar duas diferentes soluções de teste HO para sêmen ovino fresco e resfriado, utilizando as soluções de frutose-citrato de sódio e sacarose, ambas a 100mOsmol/L. Foram utilizadas 8 amostras de sêmen fresco e 128 amostras de sêmen * Recebido em 30 de novembro de 2009 Aceito em 22 de maio de Curso de Medicina Veterinária, Universidade Estadual de Santa Cruz (UESC), Rodovia Ilhéus-Itabuna, Km 16, Salobrinho, Ilhéus, BA , Brasil. lc_@hotmail.com 2 Curso de Pós-Graduação em Ciência Animal, Universidade Estadual de Santa Cruz, Rodovia Ilhéus-Itabuna, Km 16, Salobrinho, Ilhéus, BA maira_corona@hotmail.com 3 Médica-veterinária, D.Sc. Departamento de Ciências Agrárias e Ambientais, UESC, Rodovia Ilhéus-Itabuna, Km 16, Salobrinho, Ilhéus, BA paolasnoeck@uesc.br 146

2 Diferentes soluções de teste hiposmótico para sêmen ovino resfriado. Para cada amostra de sêmen foram retiradas duas alíquotas de 25μL. Uma alíquota foi adicionada em um eppendorf 4 contendo 200μL de solução de frutose-citrato de sódio e a outra em eppendorf contendo 200μL de solução de sacarose. As duas amostras foram incubadas em banho-maria a 37 o C, por 30 minutos e posteriormente fixadas com 300μL de formol salina tamponada. A leitura das formas reativas foi realizada em microscopia de contraste de fase, com objetiva de imersão de 100X. O percentual de formas reativas, com membrana funcionalmente íntegra, foi avaliado após contagem dos espermatozóides com dobramento e/ou enrolamento de cauda e também após subtração das patologias de cauda encontradas antes do teste. Para o sêmen fresco, as soluções de frutose-citrato de sódio e sacarose foram semelhantes (P>0,05), na identificação do percentual de formas reativas, quando a fórmula de cálculo foi aplicada. Quando a fórmula não foi utilizada, verificou-se que a frutose-citrato de sódio foi superior a sacarose (P<0,05). As amostras de sêmen resfriado, antes e após submeter os dados à fórmula de cálculo reagiram diferentemente, dependendo da solução HO utilizada, sendo a frutose-citrato de sódio (P<0,05) a melhor solução para a realização deste teste HO em sêmen resfriado de ovino. PALAVRAS-CHAVE. Solução, pressão osmótica, frutose-citrato de sódio, sacarose, carneiro. INTRODUÇÃO O teste hiposmótico (HO) foi criado originalmente para avaliar a atividade bioquímica dos espermatozóides humanos (Jeyendran et al. 1984) e é atualmente utilizado na avaliação do sêmen de algumas das espécies de animais domésticos, como o bovino (Siqueira et al. 2007), o equino (Alves et al. 2005b), o asinino (Canisso et al. 2008), o cão (Bueno et al. 2001), o caprino (Ferreira et al. 2001) e o ovino (Oberst et al. 2003). Por se tratar de um teste fácil de ser realizado e por ser um método acessível a todos os técnicos que atuam na área de andrologia, vem sendo usado na rotina de laboratórios e no campo para a avaliação da integridade funcional da membrana espermática (Alves et al. 2005b, Melo et al. 2005a, Leal et al. 2006). Este teste baseia-se em submeter um espermatozóide ao estresse, ao ser colocado em uma solução com osmolaridade menor do que a encontrada em seu interior (Bittencourt 4 Tubo de microcentrífuga (pequeno, de base cônica, com 1,5ml de capacidade, usado para armazenar pequenos volumes de líquidos), Companhia de Biotecnologia em Hamburgo, Alemanha. et al. 2005). Ao ser submetido à condição hiposmótica, ocorrerá um influxo de água pela membrana para dentro da célula e consequentemente edema celular, na tentativa de realizar um balanço osmótico entre o meio intracelular e extracelular (Ferreira et al. 2001, Oberst et al. 2003, Borges et al. 2005a,b). Devido ao aumento de volume da célula ocorrerá dilatação da membrana espermática, levando ao dobramento ou enrolamento do flagelo no interior da membrana (Ferreira et al. 2001, Melo et al. 2005b). A reação de enrolamento e/ou dobramento da cauda é considerada como uma reação positiva ao teste, sendo característica de integridade funcional da membrana, que é de fundamental importância para o funcionamento da célula espermática, sendo um dos requisitos mínimos para o processo de fertilização (Ferreira et al. 2001, Oberst et al. 2003, Alves et al. 2005a, Borges et al. 2005a,b). Essas formas reativas são facilmente visualizadas através da microscopia de fase, na objetiva de imersão de 100X, sendo necessária a contagem de apenas 100 células para que o teste tenha validade (Melo & Henry 1999). A temperatura, o tempo de incubação, o tipo de solução hiposmótica e a osmolaridade usados no teste HO, irão variar de acordo com a espécie animal e isso ocorre devido às diferentes propriedades físico-químicas do sêmen de cada espécie (Ferreira et al. 2001, Melo et al. 2003). O presente estudo teve como objetivo comparar duas soluções para a realização do teste HO, para identificar qual seria o melhor para avaliar a integridade funcional da membrana dos espermatozóides ovinos no sêmen fresco e no resfriado. MATERIAL E MÉTODOS Foram utilizadas oito amostras de sêmen fresco e 128 de sêmen resfriado, de oito carneiros da raça Santa Inês. As alíquotas de sêmen foram submetidas a duas soluções de incubação: frutose-citrato de sódio e sacarose, ambas com osmolaridade em torno de 100mOsmol/L. Para cada amostra de sêmen, foram retiradas duas alíquotas de 25μL. Uma alíquota foi adicionada em um eppendorf contendo 200μL de solução de frutose-citrato de sódio e a outra em um ependorf contendo 200μL de solução de sacarose. Em seguida, as amostras foram incubadas em banho-maria a 37 O C por 30 minutos e posteriormente foram fixadas com 300μL de formol salina tamponada para posterior leitura, sendo as mesmas armazenadas em refrigerador a 5 O C. A leitura das formas reativas foi realizada colocando-se uma gota da amostra de sêmen incubado na solu- 147

3 Luís Cláudio Oliveira Moura, Maíra Corona da Silva e Paola Pereira das Neves Snoeck ção hiposmótica e fixada em formol salina tamponada, sob lâmina e lamínula e avaliada em microscopia de contraste de fase com auxílio de objetiva de imersão de 100X. A porcentagem de formas reativas, com membrana funcionalmente íntegra, após o teste HO foi avaliada após a leitura no microscópio de fase, sem fórmula de cálculo e também usando a fórmula proposta por Melo & Henry (1999): HO(%) = (% de alterações na região da cauda após teste HO) (% de alterações na região da cauda antes do teste HO). O delineamento experimental foi inteiramente casualizado. Inicialmente foi feita análise descritiva (PROCUNIVARIATE) e posteriormente análise de variância (PROCGLM), sendo considerado o efeito do teste HO para P<0,05, como significativo, em função de dois modelos utilizados com e sem fórmula de cálculo do percentual de formas reativas. Toda a análise estatística foi feita com auxílio do pacote estatístico SAS 9.0. RESULTADOS E DISCUSSÃO Encontram-se na Tabela 1 os valores percentuais de espermatozóides com membrana funcionalmente íntegra, após o teste HO para sêmen fresco. Verificou-se que a solução de frutose-citrato de sódio foi semelhante à solução de sacarose (P>0,05) para identificar o percentual de espermatozóides reativos, após aplicação da fórmula de cálculo proposta por Melo & Henry (1999) para esta análise. Essa semelhança estatística entre as soluções HO, apesar da diferença numérica observada, pode ser atribuída ao alto desvio padrão e em decorrência do baixo número de repetições das amostras de sêmen fresco avaliadas. Quando às patologias de cauda observadas após a leitura da morfologia espermática, não foram subtraídas do número de dobramentos e/ou enrolamentos de cauda após o teste HO, nas amostras de sêmen fresco (Tabela 1); foi possível observar que o percentual de espermatozóides funcionalmente íntegros foi superior ao encontrado após o uso da fórmula de cálculo proposta por Melo & Henry (1999) e a solução de frutose-citrato de sódio identificou um percentual significativamente maior (P<0,05) de espermatozóides reativos do que a solução de sacarose. É possível observar que a solução frutosecitrato de sódio identificou de forma mais homogênea o percentual de espermatozóides reativos ao teste HO, provavelmente, traduzido pelo baixo desvio padrão. É importante salientar que os melhores resultados percentuais de espermatozóides reativos ao teste HO, aplicado ao sêmen fresco na espécie ovina, foram encontrados utilizando soluções com osmolaridade em torno de 100 a 150 mosmol/l (Oberst et al., 2003); essa condição de osmolaridade também foi utilizada no presente estudo, pois todas as soluções HO foram preparadas a 100mOsmol/L, sendo a solução de frutosecitrato de sódio, a 100mOsmol/L, anteriormente utilizada para avaliar a integridade de membrana espermática na espécie ovina por Oberst 5. Quando se trata da realização do teste HO para sêmen ovino fresco, pode-se utilizar tanto a frutose-citrato de sódio quanto a sacarose a 100 mosmol/l, pois Tabela 1. Comparação do teste hiposmótico para sêmen ovino fresco e resfriado. Sêmen Valores Com fórmula Sem fórmula Frutose-citrato de sódio Sacarose Frutose-citrato de sódio Sacarose Média (%) 71,8a 59,9a 95,8A 76,9B Desvio padrão 18,9 20,6 3,5 20,0 Fresco Mediana 78,5 58,0 96,5 83,0 Valor mínimo 40,0-90,0 33,0-85,0 88,0-100,0 51,0-100,0 e máximo Coeficiente 26,3 34,4 3,7 26,0 de variação Média (%) 57,4a 52,1b 81,1A 76,1B Desvio padrão 20,7 17,7 16,6 13,2 Resfriado Mediana 61,0 55,5 87,0 76,0 Valor mínimo 21,0-89,0 12,0-84,0 34,0-99,0 38,0-99,0 e máximo Coeficiente 36,0 33,9 20,4 17,3 de variação Letras minúsculas ou maiúsculas distintas indicam valores diferentes (P<0,05). Fórmula de cálculo percentual: HO(%) = (% de alterações na região da cauda após teste HO) - (% de alterações na região da cauda antes do teste HO) (Melo & Henry 1999). 5 Oberst, E. R. Comunicação Pessoal,

4 Diferentes soluções de teste hiposmótico para sêmen ovino ambas irão conferir resultados similares de reação positiva, quando o protocolo utilizado subtrair as patologias de cauda encontradas antes do teste. Apesar da sacarose ainda não ter sido testada como solução de teste HO, na espécie ovina, para sêmen fresco, resfriado e congelado, vem sendo utilizado com bons resultados na realização deste teste em outras espécies animais, a exemplo do eqüino (Melo et al,2003,2005b, Alves et al. 2005b) e asinino (Canisso et al. 2008). Pode-se salientar ainda, que o preparo da solução HO à base de sacarose é mais simples do que a preparação da solução frutose-citrato de sódio, pois só utiliza um soluto dissolvido em meio aquoso, o que poderia facilitar o seu uso na rotina de campo. Ao analisar os resultados do teste HO do sêmen fresco e compará-los aos do sêmen resfriado, nota-se que houve uma queda no número de células reativas (Tabela 1), o que indicou que a membrana plasmática dos espermatozóides de ovinos sofreu vários graus de lesão, durante a redução de temperatura, no processo de resfriamento do sêmen diluído, o que levou algumas células a não realizarem a troca de fluido entre os meios, intracelular e extracelular, quando submetidas ao teste HO. Ao se comparar as soluções HO, em amostras de sêmen resfriado, após o uso da fórmula de cálculo do percentual de formas reativas, foi possível verificar que a solução de frutose-citrato de sódio identificou um percentual de formas reativas, superior (P<0,05) a da solução de sacarose (Tabela 1). É interessante chamar atenção que para o sêmen de outras espécies, por exemplo, em equino, as soluções HO à base de açúcares são sempre melhores para identificar um maior percentual de espermatozóides reativos e com membrana funcionalmente íntegra que as soluções à base de eletrólitos. A associação entre açúcares e eletrólitos na mesma solução HO não parece ser vantajosa para avaliar espermatozóides frescos, resfriados e congelados de equinos, quando comparado ao uso de soluções formuladas com açúcares ou mesmo no teste HO com água destilada (Alves et al. 2004, Portela et al. 2004, Alves et al. 2005a,b, Melo et al. 2005a). Bittencourt et al. (2005) obtiveram resultados satisfatórios utilizando a solução de frutose-citrato de sódio a 125 mosmol/l, para a realização do teste HO no sêmen resfriado e criopreservado da espécie caprina. Percebe-se que a constituição da membrana plasmática de espermatozóides de diferentes espécies e também a composição do plasma seminal influenciam na escolha do teste HO e da solução HO que será utilizada para identificação do percentual de células reativas (Caiza-de-La-Cueva et al. 1997). Sem o uso da fórmula de cálculo, a solução de frutose-citrato de sódio também teve maior potencial na identificação do percentual de espermatozóides funcionalmente íntegros quando comparada com a solução de sacarose (P<0,05), sendo observados 81,1% e 76,1% de células reativas, respectivamente (Tabela 1). Apesar da fórmula de cálculo para corrigir o percentual de espermatozóides reativos não ser utilizada por muitos pesquisadores (Ferreira et al. 2001, Oberst et al. 2003, Melo et al. 2003), sabe-se que quando a fórmula é aplicada os resultados são mais fidedignos, pois ocorre a subtração de alterações de cauda dos espermatozóides advindas de defeitos pré-existentes, antes da amostra de sêmen ser submetida ao teste HO. A diferença encontrada entre as duas soluções HO pode ocorrer pelo fato da constituição molecular das substâncias serem diferentes e em parte, também, em decorrência dos espermatozóides responderem de várias formas a ação do resfriamento, com diferentes graus de lesão na membrana, o que pode dificultar a troca osmótica entre o meio intracelular e o extracelular. A membrana plasmática é responsável pela manutenção da constância do meio intracelular e pela permeabilidade seletiva. As substâncias hidrofílicas penetram na célula com mais dificuldade, dependendo do tamanho da molécula e também de suas características químicas, isso devido à conformação lipoprotéica da membrana plasmática dos espermatozóides. Neste caso, a frutose-citrato de sódio foi superior a sacarose, possivelmente por possuir em sua constituição uma molécula de açúcar associada a uma molécula de sal de sódio, o que pode justificar o melhor resultado, associado também ao reduzido tamanho molecular desse soluto o que pode facilitar o seu transporte por meio da membrana. Ao contrário da sacarose que é constituída da união de duas moléculas de açúcar, por isso com um tamanho maior, o que pode dificultar o seu transporte pela membrana da célula (Marzzoco & Torres 1999, Junqueira & Carneiro 2005). CONCLUSÃO As soluções de frutose-citrato de sódio e sacarose a 100mOsmol/L podem ser utilizadas para avaliar a integridade funcional da membrana plasmática de espermatozóides fresco de ovinos quando a fórmula de cálculo do percentual de formas reativa for utilizada. Para avaliar o sêmen ovino resfriado, a solução de frutose-citrato de sódio foi melhor que a de sacarose para identificar um maior percentual de espermatozóides reativos, independente do uso ou não da fórmula de cálculo. A fórmula de cálculo do percentual de formas reativas 149

5 Luís Cláudio Oliveira Moura, Maíra Corona da Silva e Paola Pereira das Neves Snoeck deve ser aplicada para expressar um resultado mais consistente. REFERÊNCIAS BIBLIIOGRÁFICAS Alves S.G.G., Snoeck P.P.N., Ribeiro Filho A.L., Bittencourt R.F., Portela A.P.M., Melo M.I.V. & Henry M. Effects of solution, incubation time and sperm fixation on equine cryopreserved sperm cells submitted to the hypoosmotic swelling test. Anais do 15º International Congress on Animal Reproduction, Porto Seguro, p.508. Alves S.G.G., Ribeiro Filho A.L., Snoeck P.P.N., Chalhoub M., Bittencourt R. F., Portela A.P.M., Almeida A.K., Melo M.I.V. & Henry M. Efeito da solução, da fixação, em formol-salina e do tempo de incubação sobre os resultados do teste hiposmótico para sêmen eqüino congelado. Ci. Ani. Brasil., 6: , 2005a. Alves S.G.G., Almeida A.K., Bittencourt R.F., Portela A.P.M., Snoeck P.P.N. & Melo M. I.V. Teste hiposmótico em sêmen congelado eqüino: efeito da associação de soluções e da água destilada. 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