FERNANDA COSTA PRATES

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1 FERNANDA COSTA PRATES DESENVOLVIMENTO DE SUCO MISTO DE JUÇARA E MANGA ADICIONADO DE Lactobacillus rhamnosus GG SUBMETIDO AO ESTRESSE ÁCIDO E BÁRICO SUBLETAL RIO POMBA MINAS GERAIS BRASIL 2017

2 FERNANDA COSTA PRATES DESENVOLVIMENTO DE SUCO MISTO DE JUÇARA E MANGA ADICIONADO DE Lactobacillus rhamnosus GG SUBMETIDO AO ESTRESSE ÁCIDO E BÁRICO SUBLETAL Dissertação apresentada ao campus Rio Pomba, do Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Sudeste de Minas Gerais, como requisito parcial para a conclusão do curso de Pós-Graduação Stricto Sensu em Ciência e Tecnologia de Alimentos para a obtenção do título de Mestre. Orientador: MAURILIO LOPES MARTINS RIO POMBA MINAS GERAIS BRASIL 2017

3 Ficha Catalográfica elaborada pela Biblioteca Jofre Moreira IFET/RP Bibliotecária: Ana Carolina Souza Dutra CRB 6 / 2977 P912d Prates, Fernanda Costa. Desenvolvimento de suco misto de juçara e manga adicionado de Lactobacillus rhamnosus GG submetido ao estresse ácido e bárico subletal. / Fernanda Costa Prates. Rio Pomba, f. : il. Orientador: Profª. Maurílio Lopes Martins. Dissertação (Mestrado) - Mestrado Profissional Stricto Sensu em Cência e Tecnologia em Alimentos - Instituto Federal do Sudeste de Minas Gerais - Campus Rio Pomba. 1. Alimento funcional. 2. Frutas tropicais. 3. Probióticos. I. Martins, Maurílio Lopes. II. Título. CDD: 641.1

4 FERNANDA COSTA PRATES DESENVOLVIMENTO DE SUCO MISTO DE JUÇARA E MANGA ADICIONADO DE Lactobacillus rhamnosus GG SUBMETIDO AO ESTRESSE ÁCIDO E BÁRICO SUBLETAL Dissertação apresentada ao campus Rio Pomba, do Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Sudeste de Minas Gerais, como parte das exigências do curso de Pós-Graduação Stricto Sensu em Ciência e Tecnologia de Alimentos para a obtenção do título de Mestre. APROVADA: 23/08/2017 Prof a. Eliane Maurício Furtado Martins Coorientadora Prof. André Narvaes da Rocha Campos Coorientador Prof. Roselir Ribeiro da Silva Prof. Bruno Ricardo de Castro Leite Júnior Prof. Maurilio Lopes Martins Orientador ii

5 Todas as coisas que Deus faz são boas, a seu tempo. Ele nos deu o desejo de entender as coisas que já aconteceram e as que ainda vão acontecer, porém não nos deixa compreender completamente o que Ele faz......nesta vida tudo o que a pessoa pode fazer é procurar ser feliz e viver o melhor que puder. Todos nós devemos comer e beber e aproveitar bem aquilo que ganhamos com o nosso trabalho. Isto é um presente de Deus. (EC 3: 11-13) i

6 AGRADECIMENTOS A Deus, a quem confio todos os meus passos. Ao Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Sudeste de Minas Gerais, campus Rio Pomba, pela oportunidade e estrutura disponibilizada para a execução desse trabalho. Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG) pelo financiamento deste trabalho. Ao meu orientador, professor Maurilio Lopes Martins, pelo amor, dedicação e disciplina com que leciona, pela confiança depositada em mim, por ter mudado a direção da minha vida. À minha mãe, por ser a razão de tudo, me dar forças e me guiar até aqui. Às minhas irmãs Marina e Olívia pela paciência e amizade, por sempre acreditarem em mim. À minha família, pela confiança, admiração e apoio incondicional. Aos professores Eliane Maurício Furtado Martins, André Narvaes da Rocha Campos, Marcelo Cristianini, Roselir Ribeiro da Silva e Bruno Ricardo de Castro Leite Júnior pela valiosa contribuição na realização deste trabalho, sem os quais eu não teria conseguido chegar ao fim. Ao prof. Marcelo Cristianini por disponibilizar seu tempo, estrutura e equipamentos necessários para a realização deste trabalho. Aos técnicos responsáveis pelo laboratório e demais servidores, pela disponibilidade e amizade, em especial à Renata, por nunca hesitar em dividir seus conhecimentos, pela generosidade e disponibilidade. Às alunas envolvidas no projeto, Scarlet e Thaiza pelo apoio na execução das análises. À amiga e parceira Adriana, que suportou minhas ausências, pelo comprometimento e dedicação. Às amigas que fiz no mestrado, pelas noites estudando, pelas risadas, pela companhia no laboratório, especialmente à Gabriela, que me acolheu em sua casa, e Marcela, amigas que levarei comigo para sempre. Ao meu amigo e amor, Lindolpho, por acreditar em mim, compreender minhas ausências, pelas noites no laboratório, por não me deixar desistir. ii

7 SUMÁRIO RESUMO... ABSTRACT... LISTA DE FIGURAS... LISTA DE TABELAS... v vi vii ix 1. INTRODUÇÃO OBJETIVOS Objetivo geral Objetivos específicos REVISÃO DE LITERATURA Alimentos funcionais: microrganismos probióticos Lactobacillus rhamnosus GG Alimentos de origem vegetal adicionados de microrganismos probióticos Estudos da viabilidade in vitro de microrganismos probióticos carreados por frutas e hortaliças Alta pressão isostática Estresse subletal em microrganismos MATERIAL E MÉTODOS Preparo e caracterização das polpas de juçara e manga Obtenção e caracterização da polpa de juçara Elaboração e caracterização da polpa de manga Elaboração de suco misto de juçara e manga adicionado de L. rhamnosus GG submetido ou não ao estresse ácido subletal Preparo e caracterização de suco misto de juçara e manga e avaliação da influência do estresse ácido subletal na resistência in vitro de L. rhamnosus GG Análises físico-químicas Determinação de cor ph Acidez Titulável Sólidos solúveis Determinação ( Brix)... dos compostos bioativos Determinação de compostos fenólicos totais Determinação de antocianinas totais Determinação da capacidade antioxidante Avaliação da qualidade microbiológica das polpas e das amostras de suco Simulação in vitro da resistência de L. rhamnosus GG às condições gastrointestinais Aplicação de estresse bárico subletal em células de L. rhamnosus GG, sobrevivência em suco misto de juçara e manga e comparação com o estresse ácido subletal Análise estatística iii

8 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO Características gerais das polpas de juçara e manga Influência do estresse ácido subletal na sobrevivência de L. rhamnosus GG em suco misto de juçara e manga Características físico-químicas dos sucos mistos de juçara e manga Compostos fenólicos, antocianinas totais e capacidade antioxidante dos sucos Características microbiológicas dos sucos mistos de juçara e manga Resistência de L. rhamnosus GG às condições gastrointestinais simuladas in vitro Influência do estresse bárico subletal na sobrevivência de L. rhamnosus GG em suco misto de juçara e manga CONCLUSÕES REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS iv

9 RESUMO PRATES, Fernanda Costa, Mestrado Profissional, Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Sudeste de Minas Gerais, agosto de Desenvolvimento de suco misto de juçara e manga adicionado de Lactobacillus rhamnosus GG submetido ao estresse ácido e bárico subletal. Orientador: Maurilio Lopes Martins. Coorientadores: Eliane Maurício Furtado Martins e André Narvaes da Rocha Campos. Este trabalho avaliou a interferência do estresse subletal em ph ácido e por alta pressão isostática na sobrevivência de Lactobacillus rhamnosus GG em suco misto de juçara e manga com ph ajustado para 3,0 e 3,5 durante 90 dias de armazenamento. Foram avaliadas características físico-químicas (cor, ph, acidez titulável e sólidos solúveis), microbiológicas (mesófilos aeróbios, fungos filamentosos e levedura, coliformes a 30 C, Escherichia coli e Salmonella sp.), viabilidade de L. rhamnosus GG submetido previamente ao estresse ácido e adicionado em sucos mistos com ph 3,0 e 3,5, avaliação de compostos bioativos (antocianinas totais, capacidade antioxidante e compostos fenólicos) e resistência desta bactéria submetida ou não ao estresse ácido ao trato gastrointestinal simulado in vitro no dia do processamento e após 14 e 28 dias de armazenamento. Ao avaliar o efeito do estresse ácido em ph 4,0 previamente aplicado às células de L. rhamnosus GG, verificou-se que não houve diferença na sobrevivência da bactéria entre os sucos com ph 3,0 e 3,5, exceto aos 90 dias de análise, quando o tratamento em que as células de L. rhamnosus GG não foram submetidas a estresse em ph 4,0 e adicionadas em suco misto com ph 3,0 apresentou 70% da sobrevivência inicial. Houve redução do ph e aumento da acidez titulável durante o armazenamento, provavelmente devido a atividade fermentativa de L. rhamnosus GG e não houve diferença para sólidos solúveis, antocianinas, capacidade antioxidante e compostos fenólicos entre os sucos e durante o armazenamento. Os sucos apresentaram-se microbiologicamente seguros ao consumo e com viabilidade de L. rhamnosus GG superior a 7,91 Log UFC/mL, sem diferença entre os tratamentos e tempos de análise. Constatou-se que o estresse ácido previamente aplicado nas células de L. rhamnosus GG não aumentou sua resistência ao trato gastrointestinal simulado in vitro. Após a aplicação de diferentes níveis de pressão (0,1, 100, 200, 300, 400 e 500 MPa) em células de L. rhamnosus GG para verificar a sobrevivência da bactéria em sucos com ph 3,0 e 3,5, constatou-se que a pressão de 200 MPa/25 C/ 5 min, se mostrou o melhor tratamento de estresse por alta pressão para garantir a sobrevivência da bactéria nos sucos com ph 3,0 e 3,5 e que pressões superiores a 200 MPa provocaram redução na viabilidade da bactéria em meio ácido e pressões inferiores não exerceram efeito no aumento da sua sobrevivência durante 90 dias de armazenamento no suco misto. Palavras-chave: Frutas tropicais, alimento funcional, probiótico, estresse subletal, ensaio in vitro. v

10 ABSTRACT PRATES, Fernanda Costa. Professional Master, Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Sudeste de Minas Gerais, August Development of mixed juçara and mango juice of Lactobacillus rhamnosus GG subjected to acid stress and high sublethal pressure. Advisor: Maurilio Lopes Martins. Coadvisors: Eliane Maurício Furtado Martins e André Narvaes da Rocha Campos. This work evaluated the interference of sub-lethal stress at acid ph values and due to high isostatic pressure on the survival of Lactobacillus rhamnosus GG during 90 days of storage in a mixed jussara and mango juice, with the ph value adjusted to 3.0 and 3.5. The physicochemical (color, ph value, titratable acidity and soluble solids), and microbiological (aerobic mesophylls, filamentous fungi, yeasts, coliforms at 30 ºC, Escherichia coli and Salmonella sp.) characteristics were evaluated. The viability of L. rhamnosus GG previously submitted to acid stress and then added to the mixed juices with ph values of 3.0 and 3.5 was also evaluated as well as the bioactive compounds (total anthocyanins, antioxidant capacity and phenolic compound content) and the resistance of the bacterium, submitted or not to acid stress in the in vitro simulated gastrointestinal tract on the day of processing and after 14 and 28 days of storage. On evaluating the effect of acid stress at ph 4.0, previously applied to the L. rhamnosus GG cells, it was found there was no difference in survival between the juices with ph values of 3.0 and 3.5, except after 90 days of storage, when the treatment in which the L. rhamnosus GG cells were not submitted to stress at ph 4.0 and added to the mixed juice at ph 3.0, presented 70% of the initial survival. There was a reduction in ph value and increase in titratable acidity during storage, probably due to the fermentative activity of L. rhamnosus GG, but there was no difference in the soluble solids, anthocyanins and phenolic compound contents or in the antioxidant capacities, between the juices during storage. The juices were shown to be microbiologically safe for consumption and with a L. rhamnosus GG viability greater than 7.91 log CFU/mL, with no difference between the treatments and times of analysis. It was shown that the acid stress previously applied to the L. rhamnosus GG cells did not increase its resistance to the simulated in vitro gastrointestinal tract. After the application of different pressure levels (0,1, 100, 200, 300, 400 and 500 MPa) to the L. rhamnosus GG cells to verify survival of the bacterium in juices with ph values of 3.0 and 3.5, it was shown that a pressure of 200 MPa/25 ºC/5 min was the best high pressure stress treatment to guarantee survival of the bacterium in juices with ph values of 3.0 and 3.5, and that pressures above 200 MPa caused a reduction in the viability of the bacterium in an acid medium, and that lower pressures did not exert an effect of increasing the survival during 90 days of storage of the mixed juice. Keywords: Tropical fruits, functional food, probiotic, sublethal stress, in vitro assay. vi

11 LISTA DE FIGURAS Figura 1 - Benefícios à saúde provenientes do consumo de probióticos... 4 Figura 2 - Fluxograma da ativação, aplicação de estresse ácido subletal em ph 4,0 em células de L. rhamnosus GG, obtenção dos sucos e determinação da contagem ao longo do tempo Figura 3 - Fluxograma de obtenção e caracterização das polpas e sucos adicionados de L. rhamnosus GG submetido ou não ao estresse ácido subletal Figura 4 - Fluxograma da aplicação de estresse por alta pressão isostática em células de L. rhamnosus GG Figura 5 - Sobrevivência de L. rhamnosus GG submetido ou não ao estresse ácido subletal em ph 4,0. Barras verticais indicam o intervalo de confiança ao nível de 95% Figura 6 - Resistência gastrointestinal simulada in vitro de L. rhamnosus GG submetido a estresse ácido subletal. Barras verticais indicam o intervalo de confiança ao nível de 95% Figura 7 - Resistência gastrointestinal de L. rhamnosus GG em cada fase da simulação in vitro. (FG): Fase gástrica. (FEI): Fase entérica I. (FEII): Fase entérica II. Barras verticais indicam o intervalo de confiança ao nível de 95% Figura 8 - Sobrevivência de L. rhamnosus GG submetidos a estresse bárico em sucos com ph ajustado para 3,0 (A) e 3,5 (B). Barras verticais indicam o intervalo de confiança ao nível de 95% Figura 9 - Sobrevivência de L. rhamnosus GG submetido ao estresse ácido (ph 4,0) ou bárico (200 MPa/25 C/5 min.) subletal adicionado em sucos com ph ajustado para 3,0 e 3,5. Barras verticais indicam o intervalo de confiança ao nível de 95% vii

12 LISTA DE TABELAS Tabela 1 - Microrganismos probióticos adicionados em matrizes vegetais... 9 Tabela 2 - Resultados médios ± desvio padrão da caracterização físicoquímica, *L, *a, *b, compostos bioativos, capacidade antioxidante e qualidade microbiológica das polpas de juçara e de manga Tabela 3 - Valores médios ± desvio padrão de *L, *a, *b, ph, acidez titulável e sólidos solúveis dos sucos Tabela 4 - Valores médios ± desvio padrão de antocianinas totais, capacidade antioxidante e compostos fenólicos dos sucos mistos de juçara e manga Tabela 5 - Médias ± desvio padrão das contagens de microrganismos mesófilos aeróbios, fungos filamentosos e leveduras, coliformes a 30 C, E. coli e Salmonella sp. nos sucos mistos de juçara e manga Tabela 6 - Médias ± desvio padrão das contagens de L. rhamnosus GG dos tratamentos controle e submetido ao estresse subletal em ph 4,0 e posteriormente adicionados em suco misto de juçara e manga com ph 3,0 e 3, viii

13 1. INTRODUÇÃO Devido ao grande número de estudos científicos que relacionam alimentação e saúde e à ampla divulgação dessas informações, os consumidores estão mais conscientes da necessidade de adotar uma alimentação saudável e equilibrada, por meio do consumo de alimentos funcionais, integrais e derivados de frutas e hortaliças. Entretanto, existe um conflito entre a necessidade do consumo desses alimentos e o ritmo de vida acelerado da população. Visando atender essa necessidade, sem perder a praticidade, as indústrias têm investido em novas tecnologias e novos alimentos que, embora sejam submetidos a processos de industrialização, sofram poucas alterações em sua estrutura e pouco ou nenhum acréscimo de aditivos químicos, açúcar e gordura, mantendo sua aparência e frescor. Os sucos de frutas integrais são ricos em nutrientes, vitaminas e minerais e, geralmente, possuem menor valor energético que as bebidas açucaradas, como os refrigerantes e néctares. Diversas frutas e hortaliças podem ser usadas em sua composição, inclusive em sucos mistos, de forma a reunir os benefícios de cada ingrediente e melhorar a palatabilidade e as características sensoriais do produto. Assim, a manga apresenta-se como um fruto de sabor agradável e elevada aceitação (MOREIRA et al., 2017) e a juçara tem se mostrado um fruto promissor para a utilização em sucos, devido, principalmente, ao seu elevado teor de antocianinas e elevada capacidade antioxidante (BORGES et al., 2013; SCHULZ et al., 2015; MOREIRA et al., 2017; PERON; FRAGA; ANTELO, 2017), além de ser objeto de estudo do grupo de pesquisa em Ciência e Tecnologia de Alimentos do Instituto Federal do Sudeste de Minas Gerais, campus Rio Pomba. Muitos estudos têm sido conduzidos para avaliar a viabilidade de adição de microrganismos probióticos em matrizes vegetais (OLIVEIRA et al., 2014; PERRICONE et al., 2014; MARTINS et al., 2015; MARTINS et al., 2016; OLIVEIRA et al., 2017), sua sobrevivência durante o armazenamento e em condições simuladas do trato gastrointestinal, testando sua resistência à acidez estomacal e aos sais biliares envolvidos no processo de digestão, existindo, assim, a possibilidade de agregar os dois benefícios em um único alimento: suco probiótico. Esse produto, além de ser considerado um alimento funcional, devido aos benefícios 1

14 já comprovados das culturas probióticas (SONG; IBRAHIM; HAYEK, 2012; TRIPATHI; GIRI, 2014), também pode possibilitar seu consumo por pessoas intolerantes à lactose, alérgicas às proteínas do leite ou que não consomem lácteos por opção (MARTINS et al., 2013; MARTINS et al., 2015), uma vez que, tradicionalmente, a maioria dos produtos probióticos são derivados lácteos. Entre os probióticos mais utilizados em alimentos e mais estudados em matrizes vegetais está a bactéria Lactobacillus rhamnosus GG, devido sua elevada resistência aos processos digestivos (SHAH, 2007) e sua adaptabilidade em diferentes alimentos (SAXELIN; KAJANDER, 2009). No entanto, o maior desafio para a fabricação e inserção de produtos vegetais probióticos no mercado é a sobrevivência das culturas probióticas no armazenamento, devido à natureza ácida dos sucos de frutas, que pode causar a morte do microrganismo e a sua incapacidade de resistir ao trato gastrointestinal (TRIPATHI; GIRI, 2014; PERRICONE et al., 2015). Paralelamente, estudos conduzidos com microrganismos submetidos a condições de estresse subletal, têm mostrado a modificação da expressão gênica dos mesmos, o que possibilita o aumento da sua resistência às diferentes condições de estresse (PERRICONE et al., 2014; FERRANDO et al., 2015; REALE et al., 2015). Dessa forma, o microrganismo que foi submetido a uma condição que não provoque sua morte, poderá se tornar mais resistente às condições do processo digestório e melhorar sua resistência durante o armazenamento. 2

15 2. OBJETIVOS 2.1. Objetivo geral Induzir estresse bárico e ácido subletal em Lactobacillus rhamnosus GG e avaliar sua resistência ao longo da vida de prateleira em suco misto de juçara e manga, bem como ao trato gastrointestinal simulado in vitro quando veiculado por este alimento Objetivos específicos Elaborar suco misto de juçara e manga e analisar os produtos obtidos quanto às características microbiológicas e físico-químicas e aos compostos bioativos; Avaliar a interferência do estresse ácido subletal na sobrevivência de L. rhamnosus GG em condição de estresse ácido no suco misto de juçara e manga durante o armazenamento; Avaliar a interferência do estresse ácido subletal na sobrevivência de L. rhamnosus GG às condições gastrointestinais simuladas in vitro; Avaliar a interferência do estresse bárico subletal na sobrevivência de L. rhamnosus GG em condição de estresse ácido no suco misto de juçara e manga durante o armazenamento. 3

16 3. REVISÃO DE LITERATURA 3.1. Alimentos funcionais: microrganismos probióticos A alegação de propriedade funcional em um alimento se refere ao papel metabólico ou fisiológico que o nutriente ou não nutriente tem no crescimento, desenvolvimento, manutenção e outras funções normais do organismo humano (BRASIL, 1999). Tripathi; Giri (2014) afirmaram que a demanda por alimentos funcionais adicionados de probióticos está crescendo, pois, os consumidores estão se conscientizando sobre os benefícios à saúde obtidos com o consumo destes produtos. A definição usualmente aceita para probiótico é que estes são microrganismos vivos, que quando administrados em quantidades adequadas conferem benefícios à saúde do hospedeiro (FAO/OMS, 2001). No entanto, de acordo com Tripathi; Giri (2014), essa definição deve ser complementada, considerando os probióticos como ingredientes alimentares que proporcionam equilíbrio da microbiota intestinal ao consumidor e proporcionam diversos benefícios relacionados à preservação fisiológica das funções do trato gastrintestinal e do sistema imunológico, entre outros (Figura 1). Figura 1. Benefícios à saúde provenientes do consumo de probióticos. Para exercer efeito probiótico, esses microrganismos devem tolerar diferentes condições adversas, como meios ácidos, tensões osmóticas, térmicas e de 4

17 congelamento utilizadas nos processos industriais e durante o armazenamento dos alimentos (ESPÍRITO SANTO et al., 2011) e devem se manter viáveis durante o trânsito no trato gastrointestinal (RANADHEERA; BAINES; ADAMS, 2010; PERRICONE et al., 2015). Probióticos são geralmente comercializados liofilizados ou congelados a temperaturas muito baixas para serem adicionados aos alimentos, podendo ser consumidos em alimentos fermentados ou não, ou como suplementos alimentares (produtos em pó, cápsula ou comprimido), sendo mais comum o consumo de probiótico veiculado pelo alimento (HENNESSY, 2014). Esses microrganismos também têm sido usados como bioprotetores em alimentos, sendo os probióticos mais usados na indústria de alimentos os dos gêneros Lactobacillus e Bifidobacterium. Porém outros microrganismos, tais como a levedura Saccharomyces cerevisiae e algumas estirpes de Escherichia coli e espécies de Bacillus também são utilizados como probióticos (CAVALHEIRO et al., 2015). Para a seleção do probiótico adequado para uma finalidade específica, devem ser consideradas algumas características desejáveis como custo, viabilidade durante o processamento e armazenamento, facilidade de adição nos alimentos e a resistência às características físico-químicas dos alimentos (SONG; IBRAHIM; HAYEK, 2012). Os alimentos probióticos precisam ser seguros e devem conter os microrganismos em número suficiente no momento do consumo. Portanto, as estirpes probióticas selecionadas devem ser adequadas para a produção industrial e conservar sua funcionalidade durante a produção e armazenamento, além de resistir às operações de processamento dos alimentos (TRIPATHI; GIRI, 2014). Para um alimento ser considerado probiótico, é necessário que a contagem mínima da bactéria no produto seja de 10 6 UFC/mL (MADUREIRA et al., 2011; RATHORE; SALMERON; PANDIELLA, 2012; BANSAL et al., 2016). A legislação brasileira afirma que a quantidade mínima viável para os probióticos deve estar situada na faixa de 10 8 a 10 9 UFC na porção diária do produto pronto para o consumo, conforme indicação do fabricante. Além disso, para comprovar a funcionalidade de um alimento, deve-se apresentar laudo de análise com comprovação da quantidade mínima viável do microrganismo para exercer a 5

18 propriedade funcional no final do prazo de validade do produto nas condições de uso, armazenamento e distribuição (BRASIL, 1999). Assim, o principal desafio para a indústria de alimentos probióticos é a manutenção de um número adequado dos microrganismos no alimento durante o processamento e armazenamento, pois dosagens insuficientes deste no momento do consumo não irão proporcionar os benefícios pretendidos na saúde humana. Como possíveis soluções para este desafio, está a utilização da microencapsulação, de agentes de proteção de células probióticas, utilização de materiais de embalagem com barreira ao oxigênio, utilização de agentes antioxidantes e ainda, modificação dos ambientes de armazenamento, permitindo a estes microrganismos resistirem melhor em diversos processos e formulações (TRIPATHI; GIRI, 2014) Lactobacillus rhamnosus GG Estirpes de lactobacilos foram isoladas a partir de amostras fecais de voluntários humanos saudáveis e submetidas a uma série de testes. As estirpes mais resistentes ao ácido e aos sais biliares foram testadas quanto à adesão a células epiteliais intestinais humanas e, as estirpes que aderiram a essas células intestinais foram avaliadas para a produção de uma substância antimicrobiana contra diversas bactérias patogênicas. A taxa de crescimento dos isolados no intestino foi avaliada e a estirpe com maior taxa de crescimento foi selecionada em 1985 e nomeada L. rhamnosus GG (DORON; SNYDMAN; GORBACH, 2005). Enquanto L. rhamnosus GG (ATCC 53103) é caracterizado por resistir ao ácido estomacal e ao suco biliar do intestino e reconhecido por colonizar o trato digestivo e por equilibrar a microbiota intestinal, as evidências sugerem que outras estirpes de L. rhamnosus, provavelmente, sejam habitantes transientes, e não residentes do trato gastrintestinal humano (REALE et al., 2015). Independentemente disso, considera-se L. rhamnosus GG potencialmente útil para o tratamento de várias doenças cujos mecanismos moleculares envolvidos ainda não são conhecidos. Estudos demonstram sua ação benéfica no tratamento de diarréia, infecções respiratórias, dermatite atópica, doenças do trato urogenital, permeabilidade do trato intestinal, transporte gastrintestinal, ansiedade, e em processos de perda de peso (LAM et al., 2007). 6

19 Esta bactéria é usada em várias aplicações de produtos, incluindo aqueles à base de leite, como iogurtes, leites fermentados, leite pasteurizado, queijos, e alguns produtos não lácteos, tais como sucos e suplementos alimentares (cápsulas e comprimidos) e há pelo menos duas razões para se considerar o bom desempenho desta bactéria: a crescente investigação científica sobre este microrganismo e a boa sobrevivência da estirpe em produtos lácteos ou não lácteos e em suplementos alimentares (SAXELIN; KAJANDER, 2009). Sua temperatura ótima de crescimento varia de 35 C a 40 C, é tolerante a ácidos (ph ótimo entre 4,5 e 6,4), porém sua taxa de crescimento é frequentemente reduzida quando o ph está entre 3,6 e 4,0 (SHAH, 2007). L. rhamnosus GG possui efeito de equilíbrio no ecossistema intestinal, isto é, aumenta a contagem de lactobacilos e bifidobactérias, diminui a atividade das enzimas pró-carcinogênicas e auxilia o restabelecimento da mucosa intestinal (SAXELIN; KAJANDER, 2009). Esta bactéria foi patenteada (US A) e licenciada para Valio Ltda. que comercializa a cultura em todo o mundo (DORON; SNYDMAN; GORBACH, 2005) Alimentos de origem vegetal adicionados de microrganismos probióticos Martins et al. (2013), ao revisarem estudos relacionados às matrizes alimentares probióticas à base de frutas, afirmaram que os consumidores estão mais conscientes e preocupados com o estilo de vida, buscando o consumo de alimentos que promovam a saúde e bem-estar, como produtos funcionais probióticos. Produtos lácteos fermentados são boas matrizes veiculadoras de probióticos, mas o consumo desses produtos é limitado devido ao crescente vegetarianismo e ao grande número de indivíduos que são intolerantes à lactose ou adeptos de dietas para controle do colesterol (MARTINS et al., 2015). Além disso, os consumidores têm um interesse em bebidas funcionais a base de suco de frutas preparados com probióticos, pois oferecem sabores variados, são atraentes para todas as faixas etárias e são percebidos como saudáveis e refrescantes (ESPÍRITO SANTO et al., 2011). Sucos de frutas oferecem vantagens para veiculação de probióticos, pois são fonte de nutrientes e eliminam a necessidade do uso de cultura starter, não 7

20 ocorrendo assim competição por nutrientes entre os microrganismos. Geralmente, são adicionados de acidulantes que podem aumentar o prazo de validade, além de proporcionar um ambiente com baixo potencial de oxirredução, que é desejável para culturas probióticas. Os sucos são ricos em açúcares que promovem a multiplicação de probióticos e ficam menos tempo no estômago, ocorrendo menor exposição dos probióticos às condições ácidas deste órgão (DING; SHAH, 2008). Diversos estudos foram conduzidos em matrizes vegetais adicionadas de microrganismos probióticos, com o objetivo de avaliar sua viabilidade no armazenamento, possíveis alterações sensoriais e físico-químicas e testes de resistência in vitro ao processo digestivo (Tabela 1). Segundo Martins et. al. (2013), produtos probióticos de frutas e hortaliças já estão disponíveis nos mercados americano e europeu. Os produtos comerciais incluem frutas e hortaliças fermentados e não fermentados, bebidas orgânicas probióticas e frutas secas enriquecidas com estes microrganismos. Estes produtos têm um apelo saudável, atraindo os consumidores. Alguns fatores podem limitar a sobrevivência do probiótico em sucos e podem ser divididos em: parâmetros alimentares (ph, acidez titulável, oxigênio molecular, atividade de água, presença de sal, açúcar, produtos químicos, bacteriocinas, agentes aromatizantes e corantes artificiais), parâmetros de processamento (tratamento térmico, temperatura de incubação, taxa de resfriamento, materiais de embalagem, métodos de armazenamento e concentração de oxigênio) e parâmetros microbiológicos (estirpes de probióticos e proporção de inoculação) (TRIPATHI; GIRI, 2014). As propriedades tecnológicas e funcionais e a viabilidade dos probióticos utilizados em produtos não lácteos são extremamente importantes para se obter uma vantagem competitiva no mercado mundial e, embora haja um grande potencial para o uso de sucos de frutas como veículos para probióticos, há poucos relatos sobre a sua preparação e produção destes alimentos, necessitando da ampliação das pesquisas nessa área (KUMAR; VIJAYENDRA; REDDY, 2015). Dentre as diversas espécies vegetais possíveis de serem utilizadas em sucos, inclusive enriquecidos com probióticos, está a palmeira juçara (MOREIRA et al., 2017) ou jussara (Euterpe edulis Martius), que produz um fruto arredondado de coloração violáceo-púrpuro. Esta palmeira é nativa da Mata Atlântica e produz 8

21 palmito de alta qualidade e com elevado valor econômico. A exploração dos frutos de juçara e sua comercialização como bebida, polpa ou ainda frutos tornou-se uma forma de conciliar proteção ambiental da espécie com valorização econômica, uma vez que a exploração inadequada quase causou sua extinção, pois o processo de extração do palmito acarreta na morte da planta (BORGES et al., 2013). Tabela 1. Microrganismos probióticos adicionados em matrizes vegetais Matriz Sucos de laranja, uva, groselha, abacaxi, romã, amora e limão Repolho processado Melão processado Sucos comerciais de maçã verde, abacaxi, laranja e frutas vermelhas Sobremesa de açaí Suco de laranja em pó Salada de frutas Bebida fermentada de cereais Salada de frutas Suco de jabuticaba Suco de juçara e manga (-) não avaliado. Espécie Lactobacillus plantarum NCIMB 8826 Lactobacillus acidophilus; L. rhamnosus L. rhamnosus HN001 Lactobacillus reuteri L. acidophilus La-5 e Bifidubacterium animalis L. plantarum 299v e P. acidilactic HA L. acidophilus LA5 L. acidophilus 8821, L. plantarum 8826 e L. reuteri L. rhamnosus HN001 L. rhamnosus GG L. rhamnosus GG Probiótico Características Sensoriais Sem alteração Viabilidade (UFC/g ou ml) Inviável nos sucos de romã e amora Referências Nualkaekul; Charalampopoulos (2011) Sem alteração 10 6 Silva et al. (2013a) Oliveira et al. (2014) Sem alteração Inviável no suco de frutas vermelhas Perricone et al. (2014) Sem alteração 10 6 Vasconcelos et al. (2014) 7 Barbosa; Borges; Teixeira - 10 (2015) Martins et al. (2015) 8 Salmerón; Thomas; - 10 Pandiella (2015) Sem alteração 10 8 Martins et al. (2016) Aceitação sensorial superior a 6 em escala hedônica Aceitação sensorial superior a 7 em escala hedônica 10 6 Oliveira et al. (2017) 10 8 Moreira et al. (2017) Frutos de juçara possuem elevados teores de compostos fenólicos totais e 9

22 elevada capacidade antioxidante, além de possuir efeito protetor sobre microrganismos submetidos ao estresse oxidativo e atuarem como aliados na prevenção contra os radicais livres relacionados ao envelhecimento celular, constituindo-se, assim, um alimento promissor para a indústria de alimentos (BORGES et al., 2013). Silva; Barretto; Serôdio (2004) realizaram um estudo de caracterização química das polpas dos frutos de juçara e de açaí nas condições ambientais da região Sul da Bahia e observaram que os frutos de juçara possuíam minerais em quantidades próximas ou superiores às do açaí, a exemplo do potássio, ferro e zinco. O teor de potássio nos frutos de juçara foi 65,7% superior ao encontrado no açaí e os teores de ferro e o zinco foram 70,3% e 20,8%, superiores, respectivamente. Os teores de fósforo e cobre foram, significativamente, maiores nos frutos de açaí, e cálcio, magnésio e manganês não apresentaram diferenças significativas entre estas frutas. Os teores de açúcares totais e lipídios foram superiores na polpa de juçara, resultando em maior valor energético para esta polpa. Os autores constataram ainda maior teor de antocianinas no fruto de juçara (1.347 mg/100 g de frutos frescos), em relação ao açaí, o qual apresentou 336 mg/100 g de frutos frescos. Entretanto, apesar da elevada concentração de compostos bioativos nos frutos de juçara, estes possuem sabor característico e pronunciado, o que compromete sua aceitação sensorial quando utilizados sem mistura com outras frutas (MOREIRA et al., 2017). Ainda segundo estes autores, a manga é uma fruta que possui sabor apreciável e grande potencial de mercado e quando utilizada em conjunto com juçara para a produção de suco misto adicionado de L. rhamnosus GG, os produtos obtidos apresentaram apelo funcional, uma vez que esta bactéria probiótica mostrou-se viável ao longo do armazenamento dos sucos, que apresentaram características funcionais relevantes e boa aceitabilidade Apesar de existirem alguns desafios a serem superados, como a sobrevivência dos probióticos no armazenamento e os efeitos nas características sensoriais, existe um futuro promissor para os sucos de frutas probióticos, podendose combinar o uso desta microbiota com alguns métodos, como encapsulação, uso de prebióticos, fortificação com outros ingredientes, entre outros (PERRICONE et al., 2015). 10

23 3.3. Estudos da viabilidade in vitro de microrganismos probióticos carreados por frutas e hortaliças Barbosa; Borges; Teixeira (2015) investigaram a influência de condições subletais de temperatura, ph e peróxido de hidrogênio na viabilidade de Pediococcus acidilactici HA e L. plantarum 299v após secagem por atomização de suco de laranja e seu armazenamento em diferentes condições, além de avaliaram a sobrevivência dos microrganismos às condições do trato gastrointestinal simulado após 180 dias. Os autores constataram que, para os microrganismos estudados, as condições subletais não melhoraram a viabilidade à passagem ao trato gastrointestinal simulado, mas ambos os microrganismos apresentaram viabilidade superior a 7,0 Log UFC/g no final do ensaio. Tuo et al. (2013) demonstraram que as estirpes de L. rhamnosus SB5L, J5L e IN1L resistiram aos testes gástricos simulados, enquanto a estirpe L. rhamnosus SB31L perdeu sua viabilidade quando exposta ao suco gástrico por três horas. Entretanto, as quatro estirpes apresentaram viabilidade em simulação intestinal. Pitino et al. (2010) estudaram os perfis de sobrevivência de seis estirpes de L. rhamnosus ao trato gastrointestinal in vitro usando um modelo dinâmico de digestão gástrica e concluíram que todas as estirpes testadas mostraram boa taxa de sobrevivência no trato gástrico e duodenal. Para todas as estirpes foi detectada alta produção de ácido lático, o que confirma sua elevada atividade durante a digestão. Por outro lado, Oliveira et al. (2017), ao avaliar a viabilidade de L. rhamnosus GG em sucos de jabuticaba e sua sobrevivência no trato gastrointestinal simulado (TGI) in vitro verificaram que, após 28 dias de armazenamento, a sobrevivência foi de 5,8 Log UFC/mL e < 1,0 Log UFC/mL para sucos com frutas não branqueadas e branqueadas, respectivamente. Após a simulação in vitro, a contagem da bactéria foi < 1,0 Log UFC/mL, o que demonstra a baixa resistência da estirpe às condições do TGI simuladas, em sucos de jabuticaba. Justifica-se, portanto, a necessidade da realização de ensaios in vitro com diferentes matrizes vegetais para comprovar a eficiência do alimento na veiculação da bactéria probiótica ao trato gastrointestinal humano. 11

24 3.4. Alta pressão isostática O tratamento térmico é uma tecnologia de conservação amplamente utilizada na indústria de alimentos, pois garante a segurança por meio da inativação de microrganismos patogênicos e aumenta a vida de prateleira dos produtos. Entretanto, este tratamento, geralmente, provoca efeitos indesejáveis nas propriedades sensoriais, nutricionais e funcionais dos alimentos. Esta limitação, juntamente com a crescente demanda dos consumidores por alimentos frescos, tem despertado interesse crescente sobre a aplicação de métodos térmicos mínimos. Nesse contexto, surge a alta pressão isostática (API) como um processo não térmico promissor que pode inativar ou diminuir a contagem inicial de microrganismos contaminantes, assim como inativar enzimas e provocar mudanças sensoriais mínimas nos alimentos (LOPES et al., 2010). Mathias et al. (2010) definiram a API ou hidrostática (APH) como sendo uma tecnologia inovadora de processamento de alimentos utilizando pressões elevadas, com opções de tempo e temperatura, que conferem vantagens em relação às tecnologias térmicas convencionais, por manter as características sensoriais do alimento próximas do original, garantindo a segurança microbiológica e prolongando sua vida útil. O processamento por alta pressão pode ser feito de forma contínua ou descontínua, sendo esta a mais utilizada. Consiste na manutenção do alimento pronto e embalado em um saco plástico dentro de uma câmara de pressurização preenchida por um meio de transmissão de pressão, geralmente água. A pressão é aplicada de forma indireta pela injeção deste liquido de baixa compressibilidade por meio de uma bomba com deslocamento positivo acionada hidraulicamente e os níveis de pressão, ajuste de tempo e temperatura podem ser programados no equipamento, dependendo das características individuais do alimento (LOPES et al., 2010). Ao avaliar os atributos sensoriais da polpa de manga e suco de lichia submetidos a processos térmicos e alta pressão, Kaushik et al. (2015) constataram que as amostras submetidas a alta pressão apresentaram-se mais semelhantes ao produto fresco do que as amostras processadas termicamente. A avaliação sensorial para o atributo sabor do suco submetido à alta pressão foi semelhante ao suco de 12

25 lichia fresco, independentemente dos níveis de pressão e temperatura aplicados, enquanto os sucos submetidos aos tratamentos térmicos receberam notas inferiores para este atributo. O processamento por alta pressão tem se mostrado eficiente também na inativação de microrganismos e enzimas, e está sendo usado na indústria de alimentos com este objetivo, pois preserva as características sensoriais dos alimentos, especialmente o flavor de frutas tropicais, perdido no processo de pasteurização (LOPES et al., 2010). Buzrul et al. (2008), em estudo realizado com suco de abacaxi e kiwi, avaliaram a eficiência da eliminação dos microrganismos Escherichia coli e Listeria innocua, processados à alta pressão e relataram que o processo de 300 MPa/5min/20 C foi eficiente na eliminação dessas bactérias. Pilavtepe-Çelik (2013), ao avaliar a inativação de patógenos em sucos de frutas de baixa acidez, concluiu que o processamento por alta pressão é uma alternativa viável ao tratamento térmico, pois garante o frescor, valor nutricional e propriedades sensoriais de sucos de baixa acidez e é eficiente na inativação de patógenos. A retenção de qualidade no processamento por API é devida as diferentes combinações de tempo, temperatura e pressão causando apenas modificações químicas mínimas, principalmente em compostos de baixo peso molecular. Pigmentos e vitaminas não são perdidos, pois a ligação covalente das moléculas não é afetada pela pressão, rompendo apenas interações químicas fracas (LOPES et al., 2010). No entanto, o maior problema no uso da tecnologia de alta pressão hidrostática em escala industrial é o alto custo dos equipamentos e do processamento, se comparados aos tratamentos de conservação mais utilizados, como a pasteurização, liofilização e congelamento (MATHIAS et al., 2010). Moreira et al. (2017), ao estudarem a sobrevivência de L. rhamnosus GG em suco misto de juçara e manga submetido ao tratamento térmico e à API, concluíram que a utilização da API no suco demonstrou ser melhor que a pasteurização, pois além de inativar os microrganismos indesejáveis, contribuiu para a manutenção das características sensoriais e nutricionais do suco. Segundo os autores, o suco pode ser classificado como potencialmente probiótico, pois L. rhamnosus GG apresentou contagem superior a 10 8 UFC/mL, mostrando-se viável ao longo de seu 13

26 armazenamento. O estudo sugeriu ainda a necessidade da condução de ensaios in vitro e in vivo para comprovar a eficiência deste suco na veiculação da bactéria probiótica ao trato gastrointestinal humano Estresse subletal em microrganismos As bactérias do ácido láctico com função probiótica, têm sido adicionadas a uma ampla variedade de alimentos visando a melhoria da saúde. Entretanto, essas bactérias encontram várias condições de estresse inerentes ao processamento, armazenamento e no sistema gastrointestinal incluindo tratamentos físicos tais como calor, pressão, pulso elétrico, ondas ultra-sônicas, luz, radiação e choque osmótico; adição de produtos químicos como ácidos, sais e agentes oxidantes (MILLS et al., 2011). Portanto, as estirpes probióticas devem apresentar viabilidade durante o trânsito no trato gastrointestinal e devem tolerar ambientes ácidos, sais biliares e alta osmolaridade para sobreviverem no estômago e no intestino delgado (FRANZ; HOLZAPFEL, 2011). O termo estresse pode ser definido como qualquer transição de uma célula de uma condição para outra que afete negativamente o crescimento microbiano e sobrevivência. De acordo com essa definição, muitas condições de processamento dos alimentos promovem condições de estresse (YOUSEF; COURTNEY, 2003). A resposta ao estresse geralmente é caracterizada pela indução transitória de produção de proteínas específicas e mudanças fisiológicas, que possam resultar no aumento da capacidade da bactéria de suportar essas condições (SCHEYHING et al., 2004). Um dos estresses a que as bactérias do ácido lático são mais comumente submetidas é o estresse ácido, principalmente em alimentos fermentados, devido ao aumento da acidez resultante da produção de ácido, principal produto final da fermentação de açúcares e utilizado como agente antimicrobiano contra a microbiota competidora. Geralmente essas bactérias deixam de se multiplicar devido a autoacidificação em vez do esgotamento de nutrientes, pois a exposição à condições ácidas pode ocasionar a morte celular. O estresse ácido tem grande relevância para bactérias probióticas, pois, no trânsito gastrointestinal, o estômago possui valores de ph entre 2,0 e 4,0 devido a produção de ácido clorídrico (PAPADIMITRIOU et al., 14

27 2016). Em geral, a resistência ao estresse é maior quando as células são previamente expostas e adaptadas a um tratamento subletal com estresse semelhante (PAPADIMITRIOU et al., 2016). O estresse pode ser considerado como subletal, quando as células têm pouca ou nenhuma perda de viabilidade, ou grave, quando o nível de estresse é letal para as células, resultando na morte da maioria dos microrganismos da população (YOUSEF; COURTNEY, 2003). Em condições de estresse, as células respondem de formas distintas: podem alterar a fluidez da membrana, romper ribossomos, ou sofrer alteração nos ácidos nucleicos. A nível molecular, a resposta ao estresse inclui a transcrição levando à síntese de proteínas reguladoras que podem desencadear a síntese de outras proteínas que permitem a sobrevivência da bactéria mesmo em condição de estresse. A resposta microbiana ao estresse pode induzir a produção de proteínas que reparam danos, mantêm a homeostase celular ou eliminam o agente de estresse; podem provocar o aumento transitório da resistência ou tolerância a fatores deletérios; podem transformar células para um estado de latência, formar esporos ou passar para o estado viável não cultivável (VNC) (ANGELIS; GOBBETTI, 2011). Apesar do uso extensivo de estirpes de lactobacilos em alimentos e como probióticos comerciais, ainda existe escassez de informações sobre a resposta aos diferentes estresses nas espécies/estirpes deste gênero, sendo necessária a continuidade de pesquisas nesta área para elucidar o comportamento dos microrganismos pós-estresse e como os alimentos probióticos podem ser beneficiados com o tratamento por estresse subletal prévio. 15

28 4. MATERIAL E MÉTODOS O presente trabalho foi realizado no Departamento de Ciência e Tecnologia de Alimentos do Instituto Federal do Sudeste de Minas Gerais (IF Sudeste MG), campus Rio Pomba em parceria com o Laboratório de Tecnologias Emergentes do Departamento de Tecnologia de Alimentos, da Faculdade de Engenharia de Alimentos - FEA, da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) Preparo e caracterização das polpas de juçara e manga Obtenção e caracterização da polpa de juçara Foram adquiridos, aproximadamente, 15 kg de polpa de juçara congelada de um produtor local do município de Rio Pomba, MG, em embalagens de polietileno de baixa densidade. As polpas foram mantidas à -18 C e transportadas em caixas com isolamento térmico até o Departamento de Ciência e Tecnologia de Alimentos, para caracterização físico-química e microbiológica, onde foram armazenadas até o momento do preparo do suco. As polpas de juçara foram avaliadas previamente ao preparo dos sucos quanto as características físico-químicas de ph, acidez titulável e sólidos solúveis totais ( Brix) e cor. Também foi determinado o teor de compostos fenólicos, antocianinas e capacidade antioxidante, e realizadas análises microbiológicas de microrganismos mesófilos aeróbios, fungos filamentosos e leveduras, coliformes a 30 C, E. coli e Salmonella sp Elaboração e caracterização da polpa de manga Três lotes de polpa de manga foram preparados a partir da seleção de frutas que foram adquiridos no comércio local da cidade de Barbacena - MG. Foram selecionadas frutas maduras de manga da cultivar Palmer e levadas a unidade de processamento de vegetais do supermercado Ceolin, localizado em Barbacena, MG, onde a polpa foi processada. As frutas foram lavadas individualmente com água 16

29 potável e detergente neutro, com o objetivo de eliminar as sujidades provenientes do campo. Logo após, foram enxaguadas e sanitizadas em solução clorada sanificante para frutas (KITCHEN SANIT CLOR, registro ANVISA n ) conforme instrução do fabricante, para redução da contagem de microrganismos contaminantes a níveis seguros, e então foram enxaguadas em água potável. Em seguida, as frutas foram descascadas e cortadas, sendo o caroço removido e os cortes triturados em liquidificador industrial (LS-03MB-N 3L Inox Skymsen). A polpa obtida foi fracionada em embalagens de polietileno de baixa densidade contendo 100 ± 5 g e congelada a -18 C para caracterização e posterior preparo do suco. A polpa de manga dos três lotes foi caracterizada previamente ao preparo do suco quanto ao ph, acidez titulável, sólidos solúveis totais ( Brix) e cor, além da capacidade antioxidante. Foram realizadas análises microbiológicas de microrganismos mesófilos aeróbios, fungos filamentosos e leveduras, coliformes a 30 C, E. coli e Salmonella sp Elaboração de suco misto de juçara e manga adicionado de L. rhamnosus GG submetido ou não ao estresse ácido subletal Previamente à elaboração do suco, as polpas foram descongeladas em refrigeração por 6 horas. Em seguida, foram pesados 70 g de polpa de juçara, 30 g de polpa de manga e 7 g de sacarose para cada 100 g de suco a ser preparado, de forma que o produto final contivesse 7% de sacarose. As polpas descongeladas e o açúcar foram homogeneizados manualmente por três minutos, obtendo-se o suco misto, que foi acidificado para ph 3,0 e 3,5, conforme a amostra a ser preparada. Após acidificação, o suco misto não processado obtido foi envasado a frio em frascos de vidro estéreis de 100 ml (Schott ). Posteriormente, foi aplicado o tratamento térmico de pasteurização em banho-maria a 82 C por 1 minuto, sendo utilizado como controle um frasco contendo o suco e termômetro para checagem da temperatura. Em seguida, foi realizado o resfriamento até atingir temperatura ambiente, quando o produto foi armazenado a 6,0 C ± 0,5 C. Uma alçada da cápsula (Culturelle ) contendo a cultura de L. rhamnosus GG foi ativada em 5 ml de caldo deman Rogosa Sharpe (Merck, Darmstadt, Alemanha - MRS), o qual foi incubado a 37 C por 18 h. Posteriormente, foi transferido 0,2; 0,3 17

30 ou 0,4 ml da cultura para tubos contendo 10 ml de caldo MRS, os quais foram incubados nas mesmas condições até que atingissem a absorbância de 0,2 a 0,3 a 600 nm, em espectrofotômetro (BEL PHOTONICS, SP 2000UV). Posteriormente, o tubo que continha a cultura que alcançou este valor de absorbância foi diluído 100 vezes em quatro tubos Falcon com 45 ml de caldo MRS, sendo dois não acidificados para ph 4,0 (tratamento controle) e os outros dois acidificados para ph 4,0 (tratamento de estresse ácido subletal). Estes frascos foram incubados em jarra de anaerobiose por 1 hora a 37 C (Figura 2). Em seguida, o caldo MRS foi removido dos tubos por centrifugação a 8500 RPM a 5 ºC/15 minutos (Thermo Fisher Scientific, Sorvall TM Stratos TM Centrifuge Series, Alemanha) e as células ressuspendidas em 45 ml de suco com ph ajustado em 3,0 ou 3,5 para a obtenção de quatro tratamentos, sendo: 1) suco controle com ph 3,0 em que L. rhamnosus GG não passou pelo estresse subletal prévio em ph 4,0 por 1 hora a 37 C; 2) suco com ph 3,0 em que L. rhamnosus GG passou pelo estresse subletal prévio em ph 4,0 por 1 hora a 37 C; 3) suco controle com ph 3,5 em que L. rhamnosus GG não passou pelo estresse subletal prévio em ph 4,0 por 1 hora a 37 C e; 4) suco com ph 3,5 em que L. rhamnosus GG passou pelo estresse subletal prévio em ph 4,0 por 1 hora a 37 C (Figura 2). Os produtos obtidos foram transferidos para microtubos contendo 1 ml de amostra e foram armazenados a 6,0 C ± 0,5 C, sendo determinada a contagem de L. rhamnosus GG em plaqueamento por profundidade em placas de Petri contendo ágar MRS (Merck, Darmstadt, Alemanha - MRS) adicionado de púrpura de bromocresol (0,004%), carbonato de cálcio (0,03%) e Tween 80 (0,1%) e incubadas a 37 ± 1 C por 72 horas (RICHTER; VEDAMUTHU, 2001), nos tempos 0, 7, 14, 21, 28, 45 e 90 dias de armazenamento (Figura 2). Após o tempo de incubação, procedeu-se com a contagem das placas e converteu-se os valores encontrados para percentual de sobreviventes, sendo a contagem inicial (tempo 0) equivalente a 100% e os demais tempos calculados proporcionalmente à contagem inicial. 18

31 Figura 2. Fluxograma da ativação, aplicação de estresse ácido subletal em ph 4,0 em células de L. rhamnosus GG, obtenção dos sucos e determinação da contagem ao longo do tempo Preparo e caracterização de suco misto de juçara e manga e avaliação da influência do estresse ácido subletal na resistência in vitro de L. rhamnosus GG 19

32 Quatro frascos scott contendo 200 ml de caldo MRS foram adicionados de uma cápsula contendo células de L. rhamnosus GG e incubados em jarra de anaerobiose por 18 horas a 37 C. Posteriormente, foram centrifugados a 8500 RPM a 5 ºC/ 15 minutos e novamente ressuspendidos em caldo MRS, sendo dois frascos não acidificados para ph 4,0 (tratamento controle) e dois acidificados para ph 4,0 (tratamento de estresse ácido subletal). Os frascos foram incubados em jarra de anaerobiose por 1 hora a 37 C. Em seguida, o caldo MRS foi removido dos frascos por centrifugação a 8500 RPM a 5 ºC/15 minutos e o pellet de células obtido foi adicionado em 200 ml de suco misto de juçara e manga recém-preparado com ph ajustado para 3,0 ou 3,5, para se obter, aproximadamente, 10 8 UFC de L. rhamnosus GG por mililitro de suco (Figura 3). Preparo e caracterização da polpa de manga: análises físico-químicas, microbiológicas e capacidade antioxidante Aquisição e caracterização de polpa de juçara: análises físico-químicas, microbiológicas e compostos bioativos Preparo do inóculo: L. rhamnosus GG submetido ou não ao estresse ácido subletal em ph 4,0 por 1 hora a 37 C Preparo do suco misto de juçara (70%) e manga (30%) adoçado (7%) com ph 3,0 ou 3,5 pasteurizado a 82 C/1 min. Adição do pellet de células obtido por centrifugação a 8500 RPM /5 C/15 min. Tratamento C3: Suco misto com ph 3,0 adicionado de L. rhamnosus GG não submetido ao estresse ácido subletal Tratamento E3 Suco misto com ph 3,0 adicionado de L. rhamnosus GG submetido ao estresse ácido subletal Tratamento C3,5 Suco misto com ph 3,5 adicionado de L. rhamnosus GG não submetido ao estresse ácido subletal Tratamento E3,5 Suco misto com ph 3,5 adicionado de L. rhamnosus GG submetido ao estresse ácido subletal Caracterização físico-química (cor, ph, acidez, sólidos solúveis totais), antocianinas, capacidade antioxidante e compostos fenólicos no armazenamento (T0, T14 e T28) Caracterização microbiológica (mesófilos aeróbios, fungos filamentosos e leveduras, coliformes a 30 C, E. coli e Salmonella sp.) no armazenamento (T0 e T28) Análise in vitro da sobrevivência do probiótico ao trato gastrointestinal no armazenamento e viabilidade do probiótico (T0, T14 e T28) Figura 3. Fluxograma de obtenção e caracterização das polpas e dos sucos adicionados de L. rhamnosus GG submetido ou não ao estresse ácido subletal. 20

33 As características físico-químicas (cor, ph, acidez, sólidos solúveis), conteúdo de compostos bioativos (antocianinas e compostos fenólicos), capacidade antioxidante, características microbiológicas (mesófilos aeróbios, fungos filamentosos e leveduras, coliformes a 30 C, E. coli e Salmonella sp.), viabilidade de L. rhamnosus GG e resistência dessa bactéria ao trato gastrointestinal simulado in vitro quando veiculada pelos sucos foram determinadas após a obtenção (T0), 14 (T14) e 28 (T28) dias após o armazenamento dos produtos a 6,0 C ± 0,5 C (Figura 3) Análises físico-químicas Determinação de cor A cor superficial das polpas e dos sucos foi avaliada utilizando-se colorímetro Kônica Minolta (CR10 Tecnal, BR). A determinação de cor foi realizada pela leitura direta de reflectância das coordenadas L*, a*, b* empregando a escala CIELAB (padrão adotado pela Comissão Internacional de Iluminação). Os valores de L* variam do claro ao escuro, sendo o valor 100 correspondente à cor branca e o valor 0 (zero) à cor preta, e os valores de a* e b*, representam os níveis de tonalidade e saturação, com + a (indica vermelho), - a (indica verde), + b (indica amarelo) e b (indica azul) ph O potencial hidrogeniônico das amostras de polpa de juçara e manga e dos sucos foi determinado por medida direta de ph, utilizando um potenciômetro digital (Tecnopon mpa-210) calibrado com soluções tampão de ph 4,0 e 7,0 (ELLIS, 2016). Para a realização das análises, 10 g de cada amostra foram diluídas em 100 ml de água destilada e realizada a leitura do ph Acidez titulável Para a determinação da acidez titulável das polpas e dos sucos foram 21

34 pesadas 10 g de cada amostra em erlenmeyer de 125 ml e adicionados 100 ml de água destilada. A mistura foi homogeneizada e a determinação da acidez titulável foi realizada empregando-se volumetria potenciométrica, utilizando solução padrão de hidróxido de sódio 0,1 M até que o valor de ph da mistura alcançasse 8,2-8,4 (medido por leitura direta em potenciômetro), quando foi interrompida a titulação (CLARK, 2016) e anotado o volume gasto. Os resultados foram expressos em % de ácido cítrico (g/100 ml de produto) Sólidos solúveis totais Os sólidos solúveis totais das polpas e dos sucos foram determinados por meio do índice de refração ( Brix), utilizando refratômetro manual (RT-30ATC) de acordo com as instruções do fabricante e conforme metodologia descrita por Godshall (2016) Determinação dos compostos bioativos Determinação de compostos fenólicos totais A análise de compostos fenólicos totais foi realizada utilizando-se o reagente de Folin-Ciocalteu, segundo metodologia descrita por Singleton; Orthofer; Lamuela- Raventos (1999), com modificações. A leitura da absorbância da solução final (após 1 hora de estabilização da reação) foi realizada a 760 nm em espectrofotômetro, calibrado com água destilada e a quantidade de fenólicos totais foi calculada com base na curva padrão de ácido gálico P.A. variando entre 0 e 200 mg/l. Para se processar a reação, em tubos de ensaios foram adicionados: 0,6 ml da amostra diluída e 3 ml do reativo de Folin-Ciocalteu. Após este procedimento, os tubos foram agitados vigorosamente em vórtex e, em seguida, foram deixados em repouso por 3 minutos. Posteriormente, foram adicionados 2,4 ml de solução de carbonato de sódio, catalisador da reação. Os tubos permaneceram em repouso por 1 hora ao abrigo da luz e a temperatura ambiente (25 ºC). A curva padrão também seguiu o mesmo procedimento, sendo o volume da amostra substituído por 0,6 ml de cada concentração de ácido gálico previamente preparada em água destilada 22

35 NORATTO et al., 2010). O conteúdo fenólico total foi obtido por regressão linear dos padrões de ácido gálico e o valor final foi expresso em mg EAG (ácido gálico equivalente) por 100 g de produto (mg EAG/100g). A concentração de fenólicos totais foi obtida por meio da interpolação das absorbâncias em uma curva padrão de ácido gálico construída previamente, com R 2 = 0, Determinação de antocianinas totais A determinação de antocianinas foi realizada segundo Lees; Francis (1972) citado por Oliveira (2011), usando o coeficiente de absortividade de cianidina-3- glicosídeo. Uma alíquota do extrato foi diluída em etanol: HCl 1,5 N (85:15) v/v e a absorbância lida no comprimento de onda de 535 nm em espectrofotômetro. A diluição foi adotada de tal modo que se obtivesse um valor de absorbância entre 0,200-0,800, respeitando a Lei de Lambert-Beer. O espectrofotômetro foi calibrado com a solução de etanol e HCl 1,5 N (85:15). O teor de antocianinas foi obtido pela equação abaixo e o resultado final expresso em mg de antocianinas totais por 100 g de produto. Foi utilizado o coeficiente de extinção glicosídeo médio (ε = 98,2 L/cm/g), que corresponde a cianidina-3- glicosídeo. A = Ɛ lcm.b.c Onde: A = Absorbância a 535 nm ε lcm = Coeficiente de absortividade (98,2 L/cm/g) b = Espessura da cubeta (1 cm) c = Concentração (g/l) Determinação da capacidade antioxidante A capacidade antioxidante foi determinada segundo metodologia descrita por Re et al. (1999) e Silva et al. (2013b). O cátion ABTS (2,2 -azinobis-3-etil-benzotiazolina-6-sulfonado) foi formado a 23

36 partir da reação de soluções aquosas de 7 mm de ABTS e 2,45 mm de persulfato de potássio (1:1), incubada a temperatura ambiente (25 ºC) e na ausência de luz, por 16 horas. Transcorrido esse tempo, a solução foi diluída em etanol e água 80% (v/v) até obter uma solução com absorbância de 0,700 ± 0,02, a 734 nm. O espectrofotômetro foi calibrado utilizando álcool etílico e água 80% (v/v). Foi realizada a construção de uma curva analítica com o antioxidante padrão trolox variando de μm. Em abrigo da luz, foi transferida uma alíquota de 0,5 ml de cada solução de trolox para tubos de ensaio e adicionada à mesma 3,5 ml da solução do radical (ABTS). A mistura foi homogeneizada em agitador de tubos e mantida ao abrigo de luz até estabilização da reação em torno de 6 minutos, sendo em seguida realizada a determinação da absorbância a 734 nm. Para construção da curva da amostra, foram realizadas três diluições sequenciais de modo a obter, após reação, absorbância na faixa da curva analítica. Seguindo os mesmos procedimentos descritos para a construção da curva analítica, uma alíquota de 0,5 ml de cada diluição da amostra foi misturada com 3,5 ml da solução do radical (ABTS) e após estabilização da reação (6 minutos) a absorbância foi determinada a 734 nm. Foi construído um gráfico de amostra:concentração (g de amostra/l) vs absorbância. Para determinação da capacidade antioxidante equivalente ao trolox, foi obtida a absorbância equivalente a 50 μm/l (trolox 50 μm/l) na equação da curva padrão de trolox. O valor de trolox 50 μmol/l foi substituído na equação da reta da curva da amostra, sendo encontrada a massa de amostra (g) equivalente a 50 μm/l Avaliação da qualidade microbiológica das polpas e das amostras de suco A microbiota contaminante das polpas e dos sucos foi avaliada pela contagem padrão de mesófilos aeróbios, de fungos filamentosos e leveduras, de coliformes a 30 C e E. coli e pela avaliação de ocorrência de Salmonella sp. logo após o preparo do suco (T0), e após 28 dias (T28) de armazenamento refrigerado à 6,0 C. As análises foram efetuadas em porções de 25 g das polpas e de 25 ml dos sucos, que foram medidos assepticamente e homogeneizados com 225 ml de solução salina 0,85%. Posteriormente, diluições decimais foram realizadas para prosseguir com os plaqueamentos. 24

37 A contagem padrão de fungos filamentosos e leveduras foi realizada por meio de plaqueamento em superfície das diluições decimais em meio de cultura Ágar Dicloran Rosa Bengala Cloranfenicol Base (DRBC, Biolog, Belo Horizonte - MG, Brasil), sendo as placas incubadas em BOD a 25 C por 5 dias, quando efetuou-se a contagem das colônias. A contagem padrão de mesófilos aeróbios, coliformes a 30 C e E. coli foi realizada em Petrifilm, específico para cada grupo de microrganismo, seguindo as orientações do fabricante. Posteriormente, foi calculado o número de UFC (Unidades Formadoras de Colônias) por grama ou mililitro de polpa e suco, respectivamente. A determinação de Salmonella sp. foi feita em 25 g do produto homogeneizado com 225 ml de caldo lactosado (MicroMed/Isofar, Duque de Caxias, Rio de Janeiro, Brasil), seguindo a metodologia descrita por Andrews et al. (2001). A contagem de L. rhamnosus GG nas amostras foi obtida por plaqueamento em profundidade de 1 ml dos sucos em meio de cultura MRS, conforme descrito no item 4.2. As placas de Petri foram incubadas em jarras de anaerobiose à 37 C por 72 horas. Após a incubação, foi realizada a contagem padrão das placas para se determinar a população da bactéria no produto Simulação in vitro da resistência de L. rhamnosus GG às condições gastrointestinais A avaliação da resistência de L. rhamnosus GG foi conduzida empregando-se um modelo in vitro, por meio da simulação de sucos gástrico e entérico de acordo com metodologia proposta por Bedani; Rossi; Saad (2013). Nos tempos 0 (após inoculação) e aos 14 e 28 dias de armazenamento a 6,0 ºC, alíquotas de 10 ml da diluição 10-1 dos sucos processados conforme item 4.3, foram transferidas em triplicata para 3 frascos schott estéreis de 100 ml e o ph dos frascos foi ajustado para 2,0-2,5 com HCl (Impex, Diadema, São Paulo, Brasil) 1 N. Em seguida, adicionou-se pepsina proveniente da mucosa gástrica de suíno (Sigma- Aldrich) e lipase (Amano lipase G) isolada de Penicillium camemberti (Sigma-Aldrich) para alcançar uma concentração de 3 g/l e 0,9 mg/l, respectivamente. Incubou-se os frascos a 37 ºC por 2 horas sob agitação a 150 RPM em incubadora com agitação (Tecnal TE 424, Piracicaba, São Paulo, Brasil). 25

38 Após 2 horas, para simulação da condição entérica I, o ph foi aumentado para 4,5-5,0 utilizando-se uma solução alcalina ph 12,0 [150 ml de NaOH 1 mol/l (Vetec, Duque de Caxias, Rio de Janeiro, Brasil); 14 g de NaH 2 PO 4. 2H 2 O (Vetec, Duque de Caxias, Rio de Janeiro, Brasil)] contendo bile bovina (Sigma-Aldrich) e pancreatina proveniente de pâncreas de suíno (Sigma-Aldrich) na proporção de concentração de 10 g/l e de 1 g/l, respectivamente. Os frascos foram reincubados a 37 ºC por 2 horas sob agitação. Decorridas 4 horas de ensaio, simulou-se a fase entérica II. Para tanto, o ph foi elevado para 6,5-7,0 usando a mesma solução alcalina com bile bovina e pancreatina que foram adicionadas a fim de manter a concentração de 10 g/l e 1 g/l, respectivamente. Novamente as amostras foram incubadas a 37 ºC durante 2 horas sob agitação, totalizando 6 horas de ensaio. Ao término de cada fase (2 horas, 4 horas e 6 horas), alíquotas de 1 ml foram retiradas e submetidas a diluições seriadas em solução salina estéril (0,85% de NaCl). As diluições foram plaqueadas em ágar MRS e procedeu-se com a verificação da sobrevivência conforme descrito no item Aplicação de estresse bárico subletal em células de L. rhamnosus GG, sobrevivência em suco misto de juçara e manga e comparação com o estresse ácido subletal Uma cápsula (Culturelle ) contendo células de L. rhamnosus GG foi ativada em 10 ml de caldo MRS mantido a 37 C por 18 horas. Posteriormente, o caldo MRS foi removido por centrifugação a 8500 RPM a 5 ºC/15 minutos. O pellet de células obtido foi ressuspendido em 10 ml de solução salina (0,85% de NaCl) estéril e novamente centrifugado nas mesmas condições. O pellet obtido foi ressuspendido em 10 ml de solução tampão fosfato ph 7,0 (3,387 g de KH 2 PO 4 e 3,533 g de Na 2 HPO 4 em 1000 ml água destilada) e envasado em sacos de polietileno de baixa densidade selados com remoção do ar (Figura 4). Desta forma, foram obtidos 36 sacos de polietileno contendo 10 ml cada, que foram refrigerados a 2,0 C e transportados para o Laboratório de Tecnologias Emergentes do Departamento de Tecnologia de Alimentos, da Faculdade de Engenharia de Alimentos - FEA, da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) 26

39 para aplicação dos tratamentos por alta pressão isostática (0,1, 100, 200, 300, 400 e 500 MPa) por 5 minutos a 25 C. Esta etapa foi realizada utilizando o equipamento QFP 2L-700 (Avure Technologies Inc, EUA), o qual permite pressão máxima de operação de até 690 MPa, com controle de temperatura de 10 a 90 C e possui uma câmara de pressurização com capacidade para 2 litros. Figura 4. Fluxograma da aplicação de estresse por alta pressão isostática em células de L. rhamnosus GG. 27

40 Após a aplicação dos níveis de pressão, as amostras foram novamente refrigeradas a 2,0 C e retornadas ao Departamento de Ciência e Tecnologia de Alimentos do Instituto Federal do Sudeste de Minas Gerais (IF Sudeste MG), campus Rio Pomba e procedeu-se com a determinação da viabilidade de L. rhamnosus GG no inóculo, com o objetivo de verificar o número de células sobreviventes aos níveis de pressão aplicados. Logo após, 1 ml de amostra tratada por alta pressão foi adicionada em 9 ml de suco com ph ajustado para 3,0 e 3,5, para avaliação da sobrevivência da bactéria ao longo do tempo de armazenamento a 6,0 C ± 0,5 C. Os sucos foram fracionados em microtubos contendo 1 ml e o percentual de sobreviventes de L. rhamnosus GG foi avaliado nos tempos 0, 7, 14, 21, 28, 45 e 90 dias de armazenamento a 6,0 C ± 0,5 C, conforme descrito no item 4.2. Após a avaliação do percentual de sobreviventes de L. rhamnosus GG tratados por alta pressão e adicionados em sucos com ph 3,0 e 3,5, selecionou-se a pressão que garantiu maior sobrevivência aos 90 dias de análise e efetuou-se a comparação com os valores de percentual de sobreviventes obtidos após a aplicação de estresse ácido em ph 4,0 (item 4.2) para verificar qual dos estresses aplicados às células garantiu maior sobrevivência após 90 dias de armazenamento Análise estatística A análise dos percentuais de sobrevivência de L. rhamnosus GG submetido ao estresse subletal ácido foi avaliada utilizando delineamento inteiramente casualizado - DIC com esquema fatorial duplo (4x7), sendo 4 sucos (C3 - suco com ph 3,0 em que L. rhamnosus GG não passou pelo estresse subletal prévio em ph 4,0; E3 - suco com ph 3,0 em que L. rhamnosus GG passou pelo estresse subletal prévio em ph 4,0; C3,5 - suco com ph 3,5 em que L. rhamnosus GG não passou pelo estresse subletal prévio em ph 4,0 e E3,5 - suco com ph 3,5 em que L. rhamnosus GG passou pelo estresse subletal prévio em ph 4,0) e 7 tempos de análise (0, 7, 14, 21, 28, 45 e 90 dias). As características físico-químicas, compostos bioativos e viabilidade foram avaliadas utilizando DIC em esquema fatorial duplo (4x3), sendo quatro tratamentos: suco C3, suco E3, suco C3,5, suco E3,5 e três tempos de armazenamento (0 e 14 e 28

41 28 dias) e análises microbiológicas foram avaliadas usando um DIC em esquema fatorial duplo (4x2), sendo dois tempos de análise e os quatro tratamentos. A resistência gastrointestinal simulada in vitro foi avaliada utilizando DIC em esquema fatorial triplo (4x3x3), sendo quatro tratamentos: suco C3, suco E3, suco C3,5, suco E3,5, três fases e três tempos de armazenamento (0 e 14 e 28 dias). A análise dos percentuais de sobrevivência de L. rhamnosus GG submetido ao estresse bárico foi avaliado utilizando DIC com esquema fatorial triplo (2x5x7), sendo dois sucos (suco com ph 3,0 e suco com ph 3,5), cinco níveis de pressão (0,1, 100, 200, 300, 400 MPa) aplicados nas células de L. rhamnosus GG e 7 tempos de análise (0, 7, 14, 21, 28, 45 e 90 dias). Para avaliar a sobrevivência de L. rhamnosus GG comparando o estresse subletal por alta pressão isostática e o estresse ácido subletal em ph 4,0, utilizou-se DIC com esquema fatorial duplo (4x7), sendo quatro tratamentos: S3 - suco com ph 3,0 adicionado de L. rhamnosus GG submetido ao estresse subletal a 200 MPa/5min; S3,5 - suco com ph 3,5 adicionado de L. rhamnosus GG submetido ao estresse subletal a 200 MPa/5min; E3 suco com ph 3,0 adicionado de L. rhamnosus GG submetido a estresse subletal em ph 4,0 e E3,5 - suco com ph 3,5 adicionado de L. rhamnosus GG submetido a estresse subletal em ph 4,0 e 7 tempos de análise (0, 7, 14, 21, 28, 45 e 90 dias). Os resultados obtidos foram analisados por meio da análise de variância e teste de Tukey para comparações entre as médias, ao nível de 5% de significância. Todos os experimentos foram realizados em três repetições. As análises estatísticas foram realizadas utilizando o pacote ExpDes (FERREIRA, 2011) no ambiente R (R Core Team, 2014) e Statística 13.0 (StatSoft, Inc., Tulsa, OK, USA). 29

42 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO 5.1. Características gerais das polpas de juçara e manga A polpa de juçara, matéria prima utilizada na produção dos sucos, se enquadrou na categoria de polpa de açaí fino e atendeu aos valores mínimos exigidos pela legislação brasileira, uma vez que não há padrão na legislação para polpa de juçara (Tabela 2). Tabela 2. Resultados médios ± desvio padrão da caracterização físico-química, *L, *a, *b, compostos bioativos, capacidade antioxidante e qualidade microbiológica das polpas de juçara e de manga Características Juçara Manga ph 4,91 ± 0,04 5,17 ± 0,39 Acidez total expressa em ácido cítrico (g/100g) 0,25 ± 0,02 0,20 ± 0,06 Sólidos solúveis ( Brix) 3,74 ± 0,10 8,87 ± 3,60 L* 15,96 ± 0,83 35,97 ± 3,17 a* 2,89 ± 0,57 7,99 ± 0,79 b* -0,74 ± 1,05 32,10 ± 3,05 Compostos fenólicos totais (mg EAG/100g) 3981,12 ± 340,13 - Antocianinas totais (mg/100g) 626,27 ± 18,5 - Capacidade antioxidante (µm trolox/g) 138,86 ± 21,27 858,67 ± 45,74 Mesófilos aeróbios (Log UFC/g) 3,05 ± 0,47 2,15 ± 1,00 Fungos filamentosos e leveduras (Log UFC/g) 1,30 ± 0,85 2,87 ± 0,05 Coliformes totais (Log UFC/g) < 1,0 3,50 ± 0,89 E. coli (UFC/g) < 1,0 < 1,0 Salmonella sp. em 25 g Ausência Ausência (-) não determinado. O valor de ph da polpa de juçara encontrado neste trabalho (Tabela 2) foi semelhante ao valor de 4,77 encontrado por Moreira et al. (2017), ao avaliarem polpa de juçara e por Borges et al. (2011), que encontraram valores variando de 4,47 a 5,45 ao analisarem frutos de juçara em cinco regiões de Santa Catarina. As diferenças encontradas nos valores de ph podem ser justificadas pelas características de cultivo, tipo de solo, clima, incidência de luz solar e localização geográfica (SILVA et al., 2013b). O resultado médio encontrado para a acidez titulável, na polpa de juçara (Tabela 2) foi semelhante aos relatados por Ribeiro; Mendes; Pereira (2011) e Moreira et al. (2017). Quanto aos sólidos solúveis ( Brix) da polpa de juçara, o valor médio obtido foi inferior ao encontrado por Moreira et al. (2017), que foi 4,90 Brix. Essa diferença 30

43 pode ser explicada tanto pelo estágio de maturação do fruto quanto pela quantidade de água incorporada no despolpamento da fruta. O valor de L* observado para polpa de juçara, também foi semelhante ao encontrado por Moreira et al. (2017), indicando a tonalidade escura da polpa avaliada. Da mesma forma, o valor de b* encontrado mostrou-se semelhante ao valor relatado pelos autores, enquanto o valor de a* mostrou-se maior que o relatado pelos autores, indicando que a polpa avaliada apresentou maior tonalidade de cor vermelha. A polpa de juçara apresentou elevados teores de compostos fenólicos totais, antocianinas e capacidade antioxidante (Tabela 2). Guergoletto et al. (2016), ao avaliarem polpa de juçara encontraram valor total de cianidina-3-glicosideo de 322 ± 43,7 mg/100g, valor inferior ao encontrado nesse estudo e valores de compostos fenólicos totais de 3474 ± 98,0 mg EAG/100g, semelhante ao verificado nesse estudo. Moreira et al. (2017) encontraram valores de 1203,75 ± 269 mg/100g para cianidina-3-glicosideo e conteúdo de fenólicos totais de 9778,20 ± 1055,90 mg EAG/100g. Segundo Borges et al. (2011), os frutos de juçara podem apresentar quantidades de 192 a 2956 mg/100g de polpa fresca, sendo os valores encontrados compatíveis com estudos realizados anteriormente. Borges et al. (2013), estudaram a influência da maturação dos frutos de juçara sobre o conteúdo de fenólicos totais e encontraram valores entre 802,05 a 5764,03 mg EAG/100g, em frutos de juçara provenientes de palmeiras de diferentes regiões. O conteúdo total de fenólicos nos frutos de juçara descrito na literatura pode variar de 200 a 5670 mg EAG/100g em matéria seca, devido a diferenças entre as regiões de crescimento e estádios de maturação (BORGES et al., 2013), sendo os resultados encontrados neste trabalho também compatíveis com a literatura. Com relação à capacidade antioxidante, Moreira et al. (2017) encontraram o valor de 370,93 ± 79,2 μm eq Trolox/g, valores superiores aos encontrados neste estudo, provavelmente devido à quantidade de água incorporada no despolpamento. Em relação à polpa de manga (Tabela 2), constatou-se que a mesma atendeu ao padrão microbiológico estabelecido pela legislação, mas não atendeu aos padrões físico-químicos (BRASIL, 2000). O valor encontrado para ph foi superior ao limite máximo estabelecido e os valores encontrados para acidez e sólidos solúveis não atingiram o mínimo exigido. A ocorrência de valores de acidez e ph em 31

44 desacordo com a legislação é comumente observado nas indústrias de processamento de polpa e suco de manga, sendo necessária a adição de acidulantes para adequar a polpa de manga aos parâmetros exigidos. Moreira et al. (2017), ao caracterizar polpa de manga Ubá, encontraram valores de L* igual a 33,34 ± 1,24 e de b* igual a 36,27 ± 5,46, que foram semelhantes ao encontrado nesse estudo. O elevado valor de b* encontrado indica a tonalidade amarela, compatível com a coloração característica do fruto. No entanto, para a coordenada a* encontrou-se valor de 14,88 ± 1,22, superior ao valor encontrado nesse estudo. A polpa de manga apresentou elevada capacidade antioxidante, devido, principalmente, ao teor de flavonoides, carotenoides e vitamina C. Moreira et al. (2017) encontraram 75,52 ± 20,2, valor inferior ao encontrado nesse estudo, justificado pela cultivar diferente do fruto utilizado. A qualidade microbiológica da polpa de manga se mostrou adequada em relação ao padrão estabelecido para polpa (BRASIL, 2000) Influência do estresse ácido subletal na sobrevivência de L. rhamnosus GG em suco misto de juçara e manga A análise de variância foi significativa (p<0,05) para os tratamentos e tempos da análise, mas não foi significativa para a interação entre estes fatores (Figura 5). Não houve diferença na sobrevivência das células de L. rhamnosus GG entre os sucos dos diferentes tratamentos até 28 dias de armazenamento. Entretanto, aos 45 dias de armazenamento, o suco misto com ph 3,0 e células de L. rhamnosus GG não submetidas ao estresse subletal prévio em ph 4,0 apresentou 70% da viabilidade inicial, diferindo dos demais tratamentos (Figura 5). Aos 90 dias de armazenamento também não houve diferença entre os tratamentos, uma vez que houve redução nas médias das contagens de L. rhamnosus GG em todos os tratamentos (Figura 5). 32

45 Legenda: Suco com ph 3,0 adicionado de L. rhamnosus GG não submetido ao estresse ácido subletal. Suco com ph 3,0 adicionado de L. rhamnosus GG submetido ao estresse ácido subletal Suco com ph 3,5 adicionado de L. rhamnosus GG não submetido ao estresse ácido subletal. Suco com ph 3,5 adicionado de L. rhamnosus GG submetido ao estresse ácido subletal Figura 5. Sobrevivência de L. rhamnosus GG submetido ou não ao estresse ácido subletal em ph 4,0. Barras verticais indicam o intervalo de confiança ao nível de 95%. Perricone et al. (2015) relataram que a baixa viabilidade das culturas probióticas em sucos de frutas pode ser superada por meio da adição de prebióticos, adaptação e indução de resistência através da exposição dos probióticos a um estresse subletal, que poderia induzir um tipo de resistência e uma resposta ao estresse subsequente. Entretanto, não foi possível verificar neste trabalho o aumento da sobrevivência de L. rhamnosus GG previamente submetido ao estresse ácido subletal, quando comparado ao mesmo microrganismo inoculado no suco misto controle, em que as células não foram mantidas em ph 4,0 por 1 hora, antes da adição nos sucos com ph 3,0 ou 3,5. Por outro lado, os resultados obtidos demonstram a grande capacidade desta bactéria em sobreviver por até 90 dias em condições ácidas no suco misto de juçara e manga (Figura 5). 33

46 5.3. Características físico-químicas dos sucos mistos de juçara e manga Não houve diferença significativa (p>0,05) entre a cor dos sucos para o parâmetro L*. Como esperado, esse parâmetro apresentou como um valor intermediário entre os valores encontrados nas polpas de juçara (15,96) e manga (35,97). Também não houve interferência (p>0,05) do tempo de armazenamento neste parâmetro (Tabela 3). Não houve diferença significativa para coordenada a* (p>0,05), em todos os tratamentos após 14 e 28 dias de armazenamento dos sucos a 6,0 C em relação aos resultados obtidos após o processamento. Durante o armazenamento, houve aumento dos valores encontrados para a coordenada b* em relação ao tempo zero (Tabela 3), indicando intensificação da tonalidade amarela nos sucos mistos, provavelmente, devido à separação de gordura no produto. Moreira et al. (2017) ao avaliarem a cor de suco misto de juçara e manga Ubá pasteurizado probiótico, encontraram valores de L*, a* e b* de 17,10, 2,97 e 1,20, respectivamente, no dia do processamento e valores médios dessas coordenadas de 16,02, 5,55 e 1,82, respectivamente, após 30 dias de processamento. As diferenças encontradas estão relacionadas às características das polpas utilizadas no preparo dos sucos, que podem apresentar diferenças devido ao estágio de maturação do fruto, condições de cultivo e/ou quantidade de água utilizada no processamento. Para a análise de ph, houve diferença entre os tratamentos e tempo (p<0,05) e os valores médios encontrados para os sucos com ph 3,0 estiveram entre 3,26 e 3,37 e os sucos com ph 3,5 apresentaram médias entre 3,49 e 3,68. Constatou-se ainda, ao analisar o efeito do tempo, que houve redução (p<0,05) do ph, indicando que mesmo em condição de estresse no ambiente ácido e temperatura baixa, L. rhamnosus GG apresentou atividade fermentativa com produção de ácido. De forma semelhante, os valores obtidos para acidez titulável, apresentaram diferença significativa (p<0,05) para o efeito do tratamento e tempo. Os sucos com ph 3,0 apresentaram acidez superior (p<0,05) aos sucos com ph 3,5 e houve aumento da acidez durante o armazenamento por 28 dias (Tabela 3). 34

47 Tabela 3. Valores médios ± desvio padrão de *L, *a, *b, ph, acidez titulável e sólidos solúveis dos sucos Tempo Acidez Titulável Sólidos solúveis Sucos *L *a *b ph (dias) (g/100 g) ( Brix) 0 23,82 ± 0,88 3,15 ± 0,64 abcde 0,27 ± 1,11 bc 3,35 ± 0,09 cde 1,13±0,07 abc 16,67 ± 1,27 Controle 14 26,37 ± 0,72 3,87 ± 0,58 ab 0,63 ± 0,12 abc 3,27 ± 0,13 de 1,18±0,39 abc 13,77 ± 2,23 ph 3, ,37 ± 1,70 2,1 3± 0,80 cde 1,70 ± 0,36 a 3,16 ± 0,09 e 1,40±0,31 ab 12,43 ± 2,98 Estresse ph 3,0 Controle ph 3,5 Estresse ph 3,5 0 24,27 ± 0,71 2,57 ± 0,47 bcde 0,37 ± 0,50 bc 3,37 ± 0,12 bcde 0,79±0,21 bc 16,60 ± 2, ,97 ± 0,98 3,42 ± 0,23 abcd 1,03 ± 0,12 abc 3,24 ± 0,15 de 0,76±0,20 c 12,77 ± 2, ,87 ± 0,95 2,16 ± 0,84 cde 1,97 ± 0,81 a 3,26 ± 0,09 de 1,14±0,15 abc 12,87 ± 3, ,87 ± 0,60 3,23 ± 0,55 abc 0,17 ± 0,75 c 3,68 ± 0,13 a 0,73±0,12 c 12,23 ± 2, ,50 ± 0,53 3,73 ± 0,45 abc 0,60 ± 0,20 ab 3,67 ± 0,17 ab 0,88±0,13 bc 10,80 ± 2, ,77 ± 0,49 1,96 ± 0,31 de 2,23 ± 0,50 a 3,50 ± 0,04 abcd 1,15±0,14 abc 14,70 ± 2, ,37 ± 1,16 2,00 ± 0,56 de 0,20 ± 0,38 c 3,62 ± 0,05 abc 1,20±0,09 abc 13,37 ± 1, ,37 ± 0,75 4,26 ± 0,32 a 1,20 ± 0,36 abc 3,68 ± 0,07 a 1,31±0,10 abc 11,53 ± 3, ,63 ± 1,26 1,73 ± 0,64 e 1,70 ± 0,38 a 3,49 ± 0,03 abcd 1,70±0,19 a 10,87 ± 1,50 Médias seguidas de mesma letra nas colunas não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade. 35

48 Daneshi et al. (2013) também observaram redução significativa de ph ao prepararem bebida fermentada de suco de cenoura com leite inoculada com L. rhamnosus e Oliveira et al. (2014), avaliando melão minimamente processado com L. rhamnosus HN001, também constataram redução do ph e aumento da acidez no produto durante o armazenamento por 5 dias a 6,0 C. Conforme esperado, não houve diferença significativa (p>0,05) no valor de sólidos solúveis entre os tratamentos e tempos avaliados (Tabela 3) Compostos fenólicos, antocianinas totais e capacidade antioxidante dos sucos Para as análises de compostos bioativos (antocianinas totais, capacidade antioxidante e compostos fenólicos) não houve diferença significativa (p>0,05) entre tratamento e tempo, demonstrando que o estresse ácido previamente aplicado à L. rhamnosus GG não alterou as características bioativas dos sucos durante 28 dias de armazenamento (Tabela 4). Tabela 4. Valores médios ± desvio padrão de antocianinas totais, capacidade antioxidante e compostos fenólicos dos sucos mistos de juçara e manga Capacidade Compostos Tempo Antocianinas Sucos antioxidante fenólicos (dias) (mg/100g) (µm trolox/g) (mg EAG/100g) 0 472,50 ± 61,13 176,51 ± 45, ,65 ± 279,00 Controle ph 3,0 Estresse ph 3,0 Controle ph 3,5 Estresse ph 3, ± 32,78 192,92 ± 42, ,72 ± 202, ,06 ± 38,49 167,74 ± 40, ,97 ± 193, ,22 ± 133,06 152,59 ± 66, ,57 ± 221, ,20 ± 24,89 172,54 ± 98, ,68 ± 53, ,03 ± 44,30 146,34 ± 25, ,00 ± 431, ,30 ± 65,40 202,03 ± 54, ,15 ± 542, ,77 ± 47,94 254,09 ± 57, ,95 ± 229, ,39 ± 14,15 185,08 ± 40, ,67 ± 140, ,80 ± 24,13 224,02 ± 61, ,40 ± 272, ,23 ± 45,11 180,80 ± 90, ,78 ± 494, ,23 ± 45,11 167,10 ± 25, ,62 ± 62,35 Apesar de normalmente ocorrer a degradação durante o armazenamento (TORRES et al., 2011), a estabilidade das antocianinas se justifica pelo baixo valor de ph dos sucos, uma vez que são estáveis em valores de ph entre 1,0 e 4,0, sendo 36

49 degradadas em valores de ph superiores a 7,0 (CASTAÑEDA-OVANDO et al., 2009) Características microbiológicas dos sucos mistos de juçara e manga Como todo alimento, os sucos devem ser seguros ao consumidor e por isso é necessária a adoção de boas práticas de fabricação durante todo o processamento, da seleção das matérias-primas até o momento do consumo. Com o objetivo de reduzir a contagem microbiana inicial e garantir a inocuidade do produto durante o armazenamento é necessária a utilização de técnicas de conservação, e uma alternativa muito usada pela indústria de sucos é a pasteurização. Os produtos obtidos apresentaram baixas contagens de microrganismos aeróbios mesófilos, fungos filamentosos e leveduras e coliformes a 30 C e não houve diferença (p>0,05) entre as amostras e entre os tempos avaliados. Todos os produtos atenderam aos requisitos legais (BRASIL, 2001) para comercialização e consumo, pois apresentaram contagem de E. coli < 1,0 x 10 1 UFC/mL e ausência de Salmonella sp. em 25 ml (Tabela 5). Portanto, os resultados obtidos demonstram a adoção de boas práticas durante o processamento e a eficiência do tratamento térmico adotado na redução das contagens microbianas dos produtos a níveis seguros para o consumo humano. Tabela 5. Médias ± desvio padrão das contagens de microrganismos mesófilos aeróbios, fungos filamentosos e leveduras, coliformes a 30 C, E. coli e Salmonella sp. nos sucos mistos de juçara e manga Suco Controle ph 3,0 Estresse ph 3,0 Controle ph 3,5 Estresse ph 3,5 Tempo (dias) Aeróbios mesófilos (Log UFC/mL) Fungos filamentosos e leveduras (Log UFC/mL) Coliformes a 30 C (Log UFC/mL) E. coli (Log UFC/mL) Salmonella sp. 0 1,23 ± 2,13 0,57 ± 0,98 < 1,0 < 1,0 Ausência 28 1,19 ± 2,07 0,52 ± 0,54 0,87 ± 1,50 < 1,0 Ausência 0 1,02 ± 1,76 0,43 ± 0,75 < 1,0 < 1,0 Ausência 28 < 1,0 0,55 ± 0,59 0,83 ± 1,43 < 1,0 Ausência 0 < 1,0 0,43 ± 0,75 < 1,0 < 1,0 Ausência 28 2,12 ± 1,84 0,85 ± 0,22 < 1,0 < 1,0 Ausência 0 < 1,0 0,40 ± 0,75 < 1,0 < 1,0 Ausência 28 1,16 ± 2,01 0,77 ± 0,40 1,06 ± 0,92 < 1,0 Ausência 37

50 Constatou-se que a contagem de L. rhamnosus GG nos sucos mistos foi superior a 7,91 Log UFC/mL ao longo dos 28 dias de armazenamento a 6,0 C (Tabela 6). Os tratamentos utilizados, bem como o tempo de armazenamento, não influenciaram (p>0,05) a viabilidade de L. rhamnosus GG (Tabela 6). Portanto, o estresse ácido subletal aplicado não se mostrou eficaz no aumento da sobrevivência da bactéria até os 28 dias de armazenamento, uma vez que a mesma apresentou boa sobrevivência no suco em ph ácido, mesmo quando não submetida ao estresse prévio em ph 4,0 por 1 hora a 37 C. A legislação brasileira (BRASIL, 2008) determina que um alimento pode ser considerado probiótico quando apresenta no mínimo 10 8 UFC na porção. Considerando uma porção de 100 ml, os sucos obtidos apresentariam em média UFC/mL de L. rhamnosus GG, podendo ser considerados veículos promissores dessa bactéria (Tabela 6). A viabilidade dos lactobacilos pode ser influenciada por alguns fatores, como gênero, espécie e estirpe da bactéria, matriz alimentícia, acidez, conteúdo de carboidratos, oxigênio, fontes de nitrogênio, disponibilidade de minerais e atividade de água; condições de processamento e armazenamento (tempo, temperatura) e possíveis interações dos probióticos com outros microrganismos (ESPÍRITO SANTO et al., 2011). Assim, os produtos obtidos e as condições de armazenamento foram eficientes para garantir a manutenção de L. rhamnosus GG por até 28 dias após o processamento. Tabela 6. Médias ± desvio padrão das contagens de L. rhamnosus GG dos tratamentos controle e submetido ao estresse subletal em ph 4,0 e posteriormente adicionados em suco misto de juçara e manga com ph 3,0 e 3,5 Tempo (dias) Tratamentos/viabilidade em Log UFC/mL Controle ph 3,0 Estresse ph 3,0 Controle ph 3,5 Estresse ph 3,5 0 8,63 ± 0,25 8,19 ± 0,27 8,57 ± 0,06 8,49 ± 0, ,31 ± 0,36 8,37 ± 0,23 8,35 ± 0,33 8,43 ± 0, ,31 ± 0,39 7,91 ± 0,35 8,30 ± 0,23 8,40 ± 0, Resistência de L. rhamnosus GG submetido ao estresse ácido subletal às condições gastrointestinais simuladas in vitro Os fatores tratamento, fases e tempo foram significativos (p<0,05), assim 38

51 como as interações entre dois fatores (tratamento x fases, tratamento x tempo, fases x tempo). No entanto, a interação entre os três fatores (tratamento x tempo x fases) não foi significativa (p>0,05) (Figura 6). Logo após o processamento dos sucos (tempo 0), L. rhamnosus GG apresentou viabilidade na fase gástrica superior a 8,0 Log UFC/mL, exceto no suco em que essa bactéria foi submetida ao estresse subletal em ph 4,0 e inoculado no suco com ph 3,5, que apresentou menor viabilidade da bactéria (p<0,05) que os demais sucos (7,05 Log UFC/mL). Na fase entérica I, o suco controle ph 3,0 apresentou menor viabilidade de L. rhamnosus GG que os demais sucos e não houve diferença significativa entre eles na viabilidade dessa bactéria probiótica na fase entérica II (Figura 6). Aos 14 dias de armazenamento, não houve diferença significativa (p>0,05) entre os sucos na fase gástrica. No suco controle com ph 3,5 (C3,5), L. rhamnosus GG apresentou menor viabilidade na fase entérica I, mas não houve diferença na viabilidade dessa bactéria em relação ao suco controle com ph 3,0 (C3,0) (Figura 6). Com 28 dias de armazenamento, L. rhamnosus GG submetido ao estresse subletal prévio em ph 4,0 e inoculado em suco misto com ph 3,5 (E3,5) apresentou menor viabilidade na fase gástrica, mas não houve diferença em relação ao suco controle com o mesmo ph, que não diferiu dos sucos ajustados para ph 3,0. Na fase entérica I, os sucos ajustados para ph 3,5 apresentaram menor viabilidade de L. rhamnosus GG, mas não houve diferença em relação ao suco controle com ph ajustado para 3,0. Já na fase entérica II, os sucos com ph 3,5 também apresentaram menores médias de contagem de L. rhamnosus GG que os demais, no entanto o suco controle com ph 3,5 não apresentou diferença significativa em relação ao suco em que L. rhamnosus GG foi submetido ao estresse subletal prévio em ph 4,0 e adicionado em suco misto com ph 3,0 (Figura 6). 39

52 Legenda: Suco com ph 3,0 adicionado de L. rhamnosus GG não submetido ao estresse ácido subletal. Suco com ph 3,0 adicionado de L. rhamnosus GG submetido ao estresse ácido subletal Suco com ph 3,5 adicionado de L. rhamnosus GG não submetido ao estresse ácido subletal. Suco com ph 3,5 adicionado de L. rhamnosus GG submetido ao estresse ácido subletal Figura 6. Resistência gastrointestinal simulada in vitro de L. rhamnosus GG submetido a estresse ácido subletal. Barras verticais indicam o intervalo de confiança ao nível de 95%. Após a passagem ao trato gastrointestinal, os sucos dos tratamentos C3, E3, C3,5 e E3,5 apresentaram médias de 4,48; 4,14; 3,92 e 3,89 Log UFC/mL, respectivamente, e não diferiram entre si, de acordo com o teste de Tukey (Figura 7). De acordo com este ensaio, quando 100 ml dos mesmos forem ingeridos em média 10 6 UFC da bactéria estarão viáveis no intestino. No entanto, não foi possível estabelecer uma relação entre o estresse subletal ácido previamente aplicado às células de L. rhamnosus GG e o aumento da resistência dessa bactéria ao trato gastrointestinal simulado in vitro. 40

53 Figura 7. Resistência gastrointestinal de L. rhamnosus GG em cada fase da simulação in vitro. (FG): Fase gástrica. (FEI): Fase entérica I. (FEII): Fase entérica II. Barras verticais indicam o intervalo de confiança ao nível de 95%. Diversas estirpes de lactobacilos inoculadas em suco de frutas misto foram estudadas quanto à resistência às condições gastrointestinais simuladas in vitro e a maioria delas apresentaram viabilidade superior a 6 Log UFC/mL após 80 dias de armazenamento, com exceção de L. acidophilus LB2 e LB3, que apresentaram contagem inferior a 2 Log UFC/mL, sugerindo que a viabilidade é dependente da estirpe e que L. rhamnosus são mais resistentes do que L. acidophilus (CHAMPAGNE; GARDNER, 2008). Oliveira et al. (2017), ao avaliarem resistência gastrointestinal in vitro de L. rhamnosus GG em suco de jabuticaba, verificaram que a contagem da bactéria foi < 1,0 Log UFC/mL estimado ao final da simulação, sugerindo a baixa resistência da estirpe à matriz, valor este inferior ao encontrado neste estudo, indicando que suco misto de juçara e manga é uma matriz carreadora de L. rhamnosus GG melhor que suco de jabuticaba Influência do estresse bárico subletal na sobrevivência de L. rhamnosus GG em suco misto de juçara e manga Após a realização da aplicação de alta pressão e contagem das células de L. rhamnosus GG previamente à inoculação no suco, foram obtidas contagens 41

54 superiores a 9,0 Log UFC/mL para as pressões de 0,1 e 100 MPa e contagens entre 8,5 e 9,0 Log UFC/mL para as pressões de 200, 300 e 400 MPa. Para a pressão de 500 MPa, a contagem da bactéria foi de 3,0 Log UFC/mL. Após a inoculação nos sucos com ph ajustado para 3,0 e 3,5, constatou-se que o efeito do ph ácido somado à aplicação da pressão de 500 MPa foi letal para as células de L. rhamnosus GG, pois não houve crescimento dessa bactéria em nenhuma das amostras e, portanto, o tratamento foi descartado. A análise de variância foi significativa para as variáveis analisadas de forma independente, bem como para todas as interações (p<0,05). Avaliando a interação entre os níveis de pressão aplicados, o ph do suco e o tempo de armazenamento, a pressão de 200 MPa mostrou-se o melhor tratamento de estresse bárico induzido, pois no suco com ph ajustado para 3,0, após 90 dias de armazenamento, L. rhamnosus GG manteve a sobrevivência de 86,9% quando previamente submetido à pressão de 200 MPa e não diferiu (p>0,05) da sua sobrevivência no tempo zero (100%). No entanto, as pressões de 0,1 MPa e 100 MPa aplicadas nessa bactéria probiótica reduziram sua sobrevivência (p<0,05) para, aproximadamente, 78% e as pressões de 300 MPa e 400 MPa levaram à morte da bactéria quando inoculadas em suco com ph ajustado para 3,0 (Figura 8A). Constatou-se que não houve diferença na sobrevivência de L. rhamnosus GG após aplicação de pressão de 200 MPa e adição no suco com ph ajustado para 3,5 durante 90 dias de avaliação, enquanto a bactéria que não foi submetida ao estresse (0,1 MPa) teve sua sobrevivência reduzida em 26,84% durante o mesmo período no mesmo suco, mas não diferiu (p<0,05) da pressão de 100 MPa, que apresentou 87,9% de sobrevivência (Figura 8B). Para a pressão de 400 MPa, a bactéria não sobreviveu após 28 dias de armazenamento nos sucos com ph ajustado para 3,0 e 3,5. Observou-se que, aos 90 dias de armazenamento, a pressão de 300 MPa permitiu 92,41% da sobrevivência da bactéria no suco com ph 3,5, não diferindo (p<0,05) da sobrevivência inicial. No entanto, para a mesma pressão, a bactéria não sobreviveu no suco com ph 3,0 (p<0,05), demonstrando que o baixo ph do suco é um fator mais letal para as células do que a pressão aplicada (Figura 8A e 8B). Scheyhing et al. (2004) avaliaram a proteção cruzada de diversos fatores de estresse e observaram que o estresse induzido pela pressão de 80 MPa afetou 42

55 apenas a sensibilidade ao calor e não teve efeito na resistência de Lactobacillus sanfransiscensis em ph variando entre 3,0 e 6,0, confirmando que baixos valores de pressão não tem efeito para proteção cruzada em ph baixo, conforme encontrado neste estudo. Os autores constataram ainda que a alta pressão não ativou nenhuma resposta geral ao estresse, tendo efeito apenas na temorresistência e na barorresistência. A B Legenda: Tratamento: S3 - Suco misto de juçara e manga com ph 3,0 inoculado com L. rhamnosus GG submetido a diferentes níveis de pressão. Tratamento: S3,5 - Suco misto de juçara e manga com ph 3,5 inoculado com L. rhamnosus GG submetido a diferentes níveis de pressão. Figura 8. Sobrevivência de L. rhamnosus GG submetidos a estresse bárico em sucos com ph ajustado para 3,0 (A) e 3,5 (B). Barras verticais indicam o intervalo de confiança ao nível de 95%. Ao compararmos o estresse subletal à pressão de 200 MPa/25 C/5 min e o estresse subletal ácido com ph 4,0, constatou-se que houve diferença significativa (p<0,05) entre tratamento, tempo e interação entre estes fatores (Figura 9). Aos 14 dias de armazenamento dos sucos não houve diferença na sobrevivência de L. rhamnosus GG. No entanto, aos 21 dias de avaliação, a bactéria mostrou maior sobrevivência no tratamento em que foi submetida à pressão de 200 MPa e as células adicionadas a suco misto com ph ajustado para 3,5 em relação a mesma 43