Pesquisa de organofosforados numa amostra de terra

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1 INETIIDA Trabalho n.º 3 Pesquisa de organofosforados numa amostra de terra INETIIDA ITÓRIA, QUÍMIA E BILGIA D INETIIDA s insecticidas podem ser agrupados em 4 grupos distintos devido às suas propriedades químicas, físicas e mecanismo da acção. Esses 4 grupos são os seguintes: rganoclorados rganofosforados arbamatos Piretróides RGANLRAD omo o próprio nome indica, estes insecticidas possuem um átomo de cloro na sua estrutura. DDT DDT foi sintetizado pela primeira vez em 1873 por um estudante de nacionalidade alemã que não tinha a menor ideia sobre o valor deste insecticida. Entretanto, o composto caiu no esquecimento e foi redescoberto, em 1939, pelo entomologista uíço, Paul Muller. Este cientista recebeu o Prémio Nobel da Medicina (1948) ao demonstrar a grande eficácia do DDT no controlo de insectos transmissores de doenças. maior benefício do DDT foi, sem dúvida, para a saúde pública, exterminando, entre outros, os vectores da malária, doença do sono, febre amarela e tifo. Este insecticida também tem sido bastante útil na agricultura, no controlo do escaravelho da batateira, traça da maçã e outros insectos que atacam os cereais, algodão e outras plantas cultivadas. baixo preço do DDT e as suas propriedades anteriormente mencionadas tornaram-no o insecticida mais conhecido deste século. A par dos benefícios citados, este composto apresenta alguns aspectos negativos que têm contribuido para a sua substituição por compostos organofosforados e carbamatos. DDT é altamente solúvel nas gorduras, sendo facilmente acumulado através das cadeias alimentares. Quimicamente, DDT pertence à classe dos difenóis alifáticos, sendo constituído por anéis fenil ligados a uma cadeia alifática. 32

2 l l l l l primeiro nome que lhe atribuíram foi dicloro-difenil-tricloroetano e daí a designação de DDT. B exacloro-ciclo-hexano (hexaclorobenzeno) hexaclorobenzeno, descoberto em 1925, foi posteriormente esquecido. ó em 1940 se descobriram as suas propriedades insecticidas. hexaclorobenzeno tem 5 isómeros designados por letras gregas alfa, beta, gama, delta e épsilon. Apenas o isómero gama, designado por lindano, é insecticida. l l l l l l Este insecticida altamente volátil tornou-se bastante popular como fumigante doméstico. Normalmente é vendido em forma de pequenas bolas que se dependuram em lâmpadas ou nos tectos de recintos fechados. ILDIEN ( Aldrina, Dieldrina e outros) Estes insecticidas só começaram a ser divulgados a partir de 1945, sendo portanto, um pouco mais recentes que o DDT (1939) e do que o lindano (1940). Podem mencionar-se, como principais compostos deste subgrupo, a aldrina e a dieldrina, cujas estruturas químicas se representam a seguir: 33

3 l l l l l l l l l l a) l b) l Fig. 3 Aldrina (a); Dieldrina (b) A aldrina tem um vasto espectro insecticida, sendo utilizada no combate de insectos que atacam os alimentos armazenados, frutos e algodão. Utiliza-se também para exterminar as larvas de insectos que se alimentam das raízes imaturas. A dieldrina é usada para combater gafanhotos, térmites e insectos prejudiciais para a saúde pública. A aldrina, ao contrário da dieldrina, é muito pouco persistente no meio. Aliás, a aldrina e o lindano são excepções dentro dos organoclorados, pois desaparecem do meio pouco tempo depois da sua aplicação. mesmo já não acontece com os produtos resultantes da sua degradação. Por exemplo, a aldrina origina a dialdrina que é bastante estável. Também alguns produtos resultantes da degradação do lindano podem ser encontrados no solo vários dias após a sua aplicação. RGANFFRAD A acção insecticida destes compostos foi descoberto na Alemanha, durante a 2ª Guerra Mundial. Estes insecticidas são geralmente muito mais tóxicos para os insectos e vertebrados do que os organoclorados, e são instáveis quimicamente. Esta última propriedade confere aos organofosforados vantagens no seu uso como substitutos dos persistentes organoclorados, especialmente o DDT. Todos os compostos organofosforados são derivados do ácido fosfórico. Aliás, organofosforado é um termo genérico que inclui todos os insecticidas que contêm fósforo. Atribui-se-lhe a seguinte estrutura geral: () R P R' () X Fig. 4 - R e R' - grupo amina, alquil ou alcoxi X - grupo aromático, alifático ou heterocíclico 34

4 As designações dadas aos insecticidas organofosforados dependem de várias combinações do oxigénio, carbono, enxofre e azoto com o átomo de fósforo. P P Fosfatos {P()} Fosforotiolatos {P()} P P Fosforotioatos {P()} Fosforoditiotatos {P()} PARATIÃ paratião foi descoberto em Este composto e o seu homólogo, metil-paratião, têm sido os insecticidas organofosforados mais utilizados. Deve, porém salientar-se que sua toxicidade para os mamíferos é tão elevada que alguns países têm proibido o seu uso. Este aspecto é, aliás, um factor limitante na sua aplicação. (R) 2 P N 2 Fig. 5 Paratião (ou etil-paratião) R= 2 5 Metil-paratião R= 3 AZINF U AZINF-METIL Este composto e o seu homólogo, azinfos-metilo, são bastante efectivos contra as pragas que se alimentam das folhas das plantas cultivadas. Ambos os compostos são bastantes tóxicos para os mamíferos. (R) 2 P 2 N Fig. 6 Azinfos (metilo ou etilo consoante o R) N N 35

5 MALATIÃ Devido à sua baixa toxicidade para os mamíferos e à sua alta actividade insecticida, o malatião é talvez, o organofosforado mais usado. Tem sido utilizado em larga escala pela rganização Mundial de aúde no combate dos mosquitos transmissores da malária. É ainda um insecticida doméstico muito divulgado para o combate de pulgas, moscas e mosquitos. ( 3 ) 2 P Fig. 7 Malatião ARBAMAT Este grupo de compostos foi introduzido no mercado nos anos cinquenta. Não são compostos tão persistentes como os organoclorados e os seus efeitos tóxicos assemelham-se aos dos insecticidas organofosforados. Estes insecticidas são derivados do ácido carbâmico e daí a sua designação genérica. grupo dos carbamatos pode dividir-se em 2 subgrupos: N-metilcarbamatos e N,Ndimetilcarbamatos, cujas estruturas gerais se indicam a seguir: R N 3 R N 3 3 N-metilcarbamatos N,N-dimetilcarbamatos N 3 N Fig. 8 arbaril Baigon 36

6 PIRETRÓIDE Desde 1800 que se conhecem compostos naturais (extraídos das flores de hryssanthemum cinersrisefolium) com propriedades insecticidas, que foram designados por piretrinas. Estes compostos não têm sido utilizados na agricultura devido ao seu alto custo e ainda por serem muito instáveis à luz. Posteriormente a 1949, foram sintetizados compostos semelhantes às piretrinas, os piretróides, que se revelaram insecticidas úteis. s piretróides são bastante estáveis à luz, muito mais baratos que as piretrinas e muito efectivos contra certas pragas. Têm a vantagem de serem pouco tóxicos para os mamíferos devido à sua rápida transformação em compostos inofensivos. s piretróides encontram-se geralmente, no mercado, sob a forma de spray sendo muito efectivos no combate dos insectos domésticos. A aletrina é um piretróide muito utilizado Fig. 9 - Aletrina PRPRIEDADE D INETIIDA s insecticidas são geralmente líquidos muito lipossóluveis, o que facilita uma penetração rápida por todas as vias digestivas, cutâneas e respiratórias. s seus metabolitos são excretados quase exclusivamente, numa forma degrada pela urina decorrendo um certo tempo entre a absorção e a excreção, variável consoante a afinidade química do produto ou dos seus metabolitos, para os tecidos. omo já foi referido em vários parágrafos anteriores, os insecticidas são compostos orgânicos muito complexos sintetizados em laboratório desde a 2ª Guerra Mundial. Estes compostos têm contribuido para a defesa da saúde pública e da economia, pela exterminação dos insectos transmissores de doenças e dos que devastam as culturas e os alimentos. No entanto, como também já foi citado anteriormente, existem compostos naturais, com propriedades insecticidas (piretrinas). Apesar do sucesso dos insecticidas, têm surgido bastantes contrariedades em relação ao seu uso ao longo do tempo. Por exemplo, verificou-se que algumas categorias de insectos são resistentes aos insecticidas e, portanto, estes deixam de exercer os seus efeitos tóxicos. Por outro lado, alguns insecticidas não têm efeitos específicos e acabam por ser tóxicos para insectos úteis, para outros animais também úteis até para o próprio omem. utro factor a ter em conta é a persistência no meio, por algumas dezenas de anos, de alguns compostos, assim como de produtos de degradação. 37

7 INETIIDA E RGANIM A maneira precisa como os insecticidas actuam sobre o organismo não é muito conhecida, mas os investigadores tentam, sobretudo nos últimos tempos, conhecer os mecanismos fisiológicos e bioquímicos de acção destes compostos. abe-se que muitos deles interferem com a transmissão do impulso nervoso, não só ao nível do axónio, mas também a nível da sinapse. s estudos clássicos sobre Toxicologia dos insecticidas permitem considerar dois grupos : - Venenos dos axónios - Anticolinesterases Genericamente, os compostos mais representativos do primeiro grupo são os compostos rganoclorados e do segundo grupo, são os compostos rganofosforados e arbamatos. Inibição da Acetilcolinesterase s insecticidas rganofosforados e arbamatos são letais para os insectos e vertebrados porque inibem a enzima acetilcolinesterase. Esta enzima está localizada na membrana pós-sináptica, junto aos receptores sinápticos, como indica o seguinte esquema : Diagrama da excitação química dum neurónio por um neurónio colinérgico. impulso (1) quando atinge o terminal do axónio vai provocar a libertação de acetilcolina (2) que está contida nas vesículas sinápticas. A acetilcolina combina-se com o receptor (3) e origina-se a excitação do segundo neurónio (4). A colinesterase (5) termina o processo destruindo a acetilcolina. 38

8 Após a reacção da acetilcolina com os receptores, esta fica inactiva. A enzima acetilcolinesterase é a responsável pela inactívação da acetilcolina, convertendo-a em ácido acético e produtos inertes de colina. Nos insectos envenenados com os inibidores de acetilcolinesterase, há acumulação da acetilcolina na fenda sináptica. resultado da inibição é a estimulação constante da célula pós-sináptica até ao bloqueio fisiológico desta região. Acontece o mesmo nas junções neuromusculares dos vertebrados em que o mediador é também a acetilcolina. As junções neuromusculares funcionalmente afectadas produzem inicialmente elevada excitação muscular e finalmente paralisia muscular, simultânea com o bloqueio da junção. A afecção da funcionalidade muscular estende-se aos músculos respiratórios, sobrevindo a morte devido ao colapso da actividade respiratória. colapso respiratório observado nos animais envenenados pode também ser resultado da inibição dos centros respiratórios do cérebro. conhecimento do mecanismo molecular de catálise, operando no local activo da enzima, é fundamental para a compreensão da inibição causada pelos agentes anticolinesterásicos. A reacção de hidrólise da acetilcolina no local activo da enzima acetilcolinesterase compreende 3 fases fundamentais: I) A molécula de substracto liga-se ao local activo da enzima. Esta ligação é de natureza iónica envolvendo um resíduo aniónico da enzima e o amónio quaternário do substracto. Ligação da acetilcolina ao local activo da enzima Esta região tem polaridade e dimensões consentâneas com a introdução de um grupo amónio quaternário, pois os substractos e inibidores competitivos da enzima têm invariavelmente um grupo idêntico. 39

9 3 3 N Acetilcolina (substrato) N ( 2 ) 2 3 Butirilcolina (substrato) N Muscarina (inibidor competitivo) II) substracto reage com uma parte da enzima designada por local esteárico. É quase certo que este local é um resíduo de serina. Este resíduo proporciona um mecanismo de reacção tipo ácido-base. Devido à proximidade da ligação éster da acetilcolina e ao carácter nucleofílico do oxigénio da serina, o protão do hidróxilo é rapidamente transferido para a ligação éster que se desfaz ficando o acetato com deficiência de electrões. Gera-se colina que se separa e acetato que, na condição de electrofílico (tem falta de electrões), reage rapidamente com o oxigénio nucleofílico da serina (tem abundância de electrões) formando-se uma ligação covalente por acetilação da serina, como se pode observar no esquema seguinte: Acetilação da enzima e libertação do grupo colina 40

10 III) corre o ataque da acetil-serina pela água. Uma vez removida a colina do local activo, fica espaço para a entrada de água, devido à polaridade da ligação éster da acetil-serina. A parcial hidrofobicidade do local activo incrementa a reactividade electrónica da água. Devido à proximidade da água e ao seu carácter núcleo-electrofílico, segue-se o ataque ácido-base da ligação éster, ficando um protão da água confinado ao oxigénio da serina e o hidróxilo confinado ao grupo acil, como ilustra o esquema seguinte: Desacetilação da enzima importante no processo da catálise é a colocação táctica da ligação susceptível (éster) em frente do hidróxilo da serina. Assim, é importante que o substracto possua colina, mas não interessa muito o comprimento da cadeia para além da ligação éster, porque substractos como propionilcolina e butirilcolina são perfeitamente adequados, resultando a formação dos respectivos produtos. Moléculas muito parecidas, mas sem resíduo colina são impróprias como substractos, sendo, no entanto, inibidores competitivos. s insecticidas rganofosforados e arbamatos inibem a enzima acetilcolinesterase de modo diferente dos inibidores competitivos mencionados. s insecticidas não são posicionados no local activo como o substracto e os inibidores competitivos. seu posicionamento no local activo é motivado por interacções não iónicas, uma vez que os insecticidas não têm grupos carregados. Todos os venenos insecticidas anticolinesterases têm em comum um grupo em que há assimetria de distribuição electrónica. s rganofosforados têm um grupo fosfato em que P é electrofílico porque há deslocamento de electrões na direcção do oxigénio, P=. É facto estabelecido que os compostos organofosforados têm efeitos inibidores apenas na forma oxão (P=) e não na forma de fosforotioato (P=). A diferença fundamental é que o P das formas oxão é muito mais electrofílico do que o das formas P= que não são reactivas. As propriedades cinéticas das reacções dos inibidores com a enzima são tais que é possível predizer que essas reacções não são directas, mas que há reacções intermédias, que sugerem o estabelecimento prévio de ligações de hidrogénio. Uma 41

11 das ligações é provavelmente estabelecida entre o P electrofílico do inibidor e o nucleofílico da serina (ligação 1 da figura seguinte), sendo o protão da serina estabilizado por outro resíduo nucleofílico do local activo, por exemplo, um imidazol de uma histina (ligação 3). utra ligação, hidrogénio (ligação 2) poder-se-ía estabelecer entre o oxigénio do inibidor organofosforado (grupo nucleofílico) e um protão de um resíduo protonado do local activo. Posicionamento de um insecticida organofosforado no local activo da enzima acetilcolinesterase (notar as ligações de hidrogénio 1, 2 e 3) posicionamento no local activo é provavelmente favorecido também por ligações hidrofóbicas, uma vez que os compostos mais eficazes têm grupos hidrofóbicos, ou aromáticos (paratião, azinfos, carbaril, baigon) ou alifáticos (malatião). posicionamento é ainda facilitado pela existência de grupos R (vidé figura anterior) carregados positivamente ou por compostos inibidores estruturalmente semelhantes ao substracto. Essencialmente, a interacção dos insecticidas anticolinesterase com o local activo da enzima faz-se segundo mecanismos ácido-base, em que grupos nucleofílicos e electrofílicos do substracto da enzima estão implicados. Localizado o inibidor no local activo, a ligação éster do inibidor sofre o ataque nucleofílico da serina do local activo, segundo o seguinte esquema elaborado para um composto organofosforado: 42

12 Fosforilação do local esteárico da acetilcolinesterase por um insecticida organofosforado. Após o correcto posicionamento conforme se indica na figura precedente, a ligação éster do inibidor é atacada nucleofilicamente pelo oxigénio da serina, com transferência simultânea do protão do hidroxilo para um resíduo histidina (B). Por sua vez, um resíduo protonado (A) cede um protão à ligação éster do inibidor. Resulta a serina fosforilada e simultaneamente separa-se o grupo nitrofenol do insecticida. mecanismo de interacção do local activo da enzima com os compostos organofosforados e carbamatos é formalmente semelhante à interacção verificada para os substractos, com a formação de um complexo acetil-enzima. A grande diferença diz respeito ao processo de desacetilação. A acetil-enzima formada durante a reacção com o substracto decompõe-se muito rapidamente, ocorrendo a decomposição em fracções de segundo. ontudo, a desacetilação é lenta para os inibidores, levando dias para os organofosforados (desfosforilação) ou horas para os carbamatos (descarbamilação) A reactividade da enzima pelo ataque da água é uma reacção lenta, especialmente para os complexos com compostos organofosforados. A velocidade de reacção não depende obviamente da natureza do grupo que deixa a enzima (ex.: nitrofenol da figura anterior), mas sim dos substituintes do átomo de fósforo. Quanto mais hidrofóbicos forem estes grupos mais difícil é a reactivação, porque mais electrofilicidade é proporcionada ao átomo de P (ou no caso dos carbamatos), tornando-se mais difícil a quebra de ligação com o oxigénio (nucleofílico) da serina. METDLGIA despiste de uma intoxicação por organofosforados pode ser executada nos meios biológicos, por intermédio de diversas técnicas analíticas, desde a mais simples até às mais elaboradas. Isto é, desde reacções cromáticas em cromatografia em camada fina, cromatografia de fase gasosa, cromatografia líquida de alta pressão, espectroscopia de absorção de ultravioleta e de infravermelhos, espectrometria de massa etc. Pode ainda ser executada em materiais tão diversos como alimentos, água e solos. 43

13 Um dos obstáculos iniciais de qualquer análise toxicológica, reside no método de extracção a adoptar.. Quase sempre as substâncias a analisar encontram-se envolvidas numa matriz que pode comprometer a sua detecção, pelo que se deve escolher criteriosamente a metodologia de extracção mais eficiente. A análise de substâncias em teores residuais obriga igualmente a uma selecção de métodos contínuos de extracção, como a técnica de refluxo de XLET( método a seguir nas aulas práticas). DETERMINAÇÃ DA ATIVIDADE DA LINETERAE A determinação quantitativa da actividade colinesterásica é um dos trabalhos que fazem parte das nossas aulas práticas, em virtude de ser um meio de diagnóstico clínico da intoxicação por organo-fosforados. Dois tipos básicos de actividade colinesterásica são encontrados nos tecidos de todos os animais : I) A colinesterase «verdadeira» ou eritrocitária, detectada nos eritrócitos e tecido nervoso e tem preferência de substracto para a acetilcolina. II) A pseudocolinesterase encontrada principalmente no plasma, hidrolisa a butirilcolina e também a acetilcolina, esta última a uma velocidade menor. De um modo geral, todos os insecticidas organofosforados e carbamatos, são potenciais inibidores da colinesterase, inibindo a maior parte deles, ambos os tipos de enzima. A actividade da pseudocolinesterase é normalmente, mas não invariavelmente, inibida mais rapidamente do que a colinesterase eritrocitária. Dada a grande amplitude de valores considerados «normais» em actividade colinesterásica, é desejável que quando se pretende controlar indivíduos expostos a inibidores desta enzima, se determinem previamente os seus teores normais individuais. Em regra, deve-se considerar significativo e indicador de uma exposição tóxica, quando a actividade descer para valores abaixo de 80%, relativos ao valor médio normal (inibição > 20 %). ontudo, pode existir uma acentuada inibição destas duas enzimas, sem a sintomatologia de intoxicação. 44