Microbiologia Laboratorial: da requisição de exames a análise microbiológica

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1 Microbiologia Laboratorial: da requisição de exames a análise microbiológica (GUIA PRÁTICO) Palestrante Profa. Me. Gilcele de Campos Martin Berber Realização ABRIL

2 PREFÁCIO Esse material foi compilado no intuito de facilitar a consulta aos procedimentos realizados em exames laboratoriais microbiológicos e seus respectivos diagnósticos das principais fontes de coleta de materiais. Esse guia prático destina-se ainda aos participantes do 1º Mini-Curso intitulado Microbiologia Laboratorial: da requisição de exames a análise microbiológica que poderão utilizá-lo durante as práticas laboratoriais. A reprodução parcial ou total deste material está autorizada desde que seja citada a fonte e a autora. Desejo um excelente mini-curso e agradeço a confiança. Profa Me. Gilcele de Campos Martin Berber 2

3 1. Requisição de exames microbiológicos O microbiologista ou responsável pela rotina deverá conferir as requisições ou pedidos de exame de cada material. O profissional responsável pela coleta será também responsável por identificar de forma legível e correta o material a ser encaminhado ao laboratório de microbiologia. Fatores que podem comprometer o exame microbiológico:. Informações mal colhidas, incompletas, ou não devidamente interpretadas.. Requisição inadequada da análise laboratorial.. Coleta, conservação e transporte inadequados.. Falhas técnicas no processamento da análise.. Demora na liberação de resultado.. Má interpretação do resultado Os itens acima servem apenas para destacar informações que podem ser muito úteis e valorizadas em diferentes etapas do processamento do exame. Modelos para requisição de exames microbiológicos: Modelo 1: Nome Sobrenome Iniciais Registro nº (do hospital ou serviço) Data de nascimento / / Data: Hora: Sexo: M ( ) F ( ) (a interpretação de bacteriúria pode ser diferente para mulheres) Clínica ( ) Leito ( ) Ambulatório ( ) Nome ( quem realizou a coleta) Campo para a identificação do exame no laboratório: Modelo 2 Hemocultura: Sangue periférico ( ) Sangue colhido de cateter ( ) Urocultura: Jato médio ( ) Sonda de alívio ( ) Sonda vesical de demora ( ) Punção suprapúbica ( ) Saco coletor Trato respiratório: Orofaringe ( ) Escarro ( ) Aspirado traqueal Lavado bronco-alveolar ( ) Escovado brônquio ( ) Outros ( ) Lesões, secreções, abscessos ( ) Descrever topografia: Nível da coleta: superficial ( ) Profunda ( ) Via de obtenção do material: Punção ( ) Swab ( ) Raspado ( ) Drenagem ( ) Fístula ( ) Outros ( ) Líquidos cavitários: Líquor ( ) Líquido pleural ( ) Pericárdio ( ) Sinovial ( ) Ascítico ( ) Próteses ( ) Pontas de cateter ( ) outros ( ) 3

4 2. Coleta, Transporte e Conservação de amostra. Bactérias: Todo resultado liberado pelo laboratório de microbiologia é consequência da qualidade da amostra recebida. O material coletado deve ser representativo do processo infeccioso investigado, devendo ser eleito o melhor sitio da lesão, evitando contaminação com áreas adjacentes. A coleta e o transporte inadequados podem ocasionar falhas no isolamento do agente etiológico e favorecer o desenvolvimento da microbiota contaminante, induzindo a um tratamento não apropriado. Considerações gerais da coleta microbiológica:. Colher antes da antibioticoterapia, sempre que possível.. Instruir claramente o paciente sobre o procedimento.. Observar a anti-sepsia na coleta de todos os materiais clínicos. Colher do local onde o microrganismo suspeito tenha maior probabilidade de ser isolado.. Considerar o estágio da doença na escolha do material. Patógenos entéricos causadores de diarreia, estão presentes em maior quantidade e são mais facilmente isolados durante a fase aguda ou diarreica do processo infeccioso intestinal.. Quantidade suficiente de material deve ser coletado para permitir uma completa análise microbiológica. Caso a quantidade seja pequena, priorizar os exames. Pedido de exame deve conter as informações descritas no módulo anterior Considerações de segurança. Utilizar as barreiras de proteção necessárias a cada procedimento.. Toda amostra deve ser tratada como potencialmente patogênica.. Usar frascos e meios de transporte apropriados.. Não manusear a amostra em trânsito: paciente e laboratório.. Não contaminar a superfície externa do frasco de coleta. Identificar claramente a amostra coletada. Momento da coleta: Hemocultura é um exame de URGÊNCIA!!! A coleta deve ser realizada logo no início dos sintomas, preferencialmente antes do inicio da antibioticoterapia Pacientes com quadro agudo de sepse ou outra condição (osteomielite, meningite, pneumonia ou pielonefrite). Coletar duas hemoculturas consecutivamente de dois sítios anatômicos diferentes antes de iniciar a antibioticoterapia, Pacientes com endocardite bacteriana subaguda, febre de origem desconhecida (abcessos ocultos, febre tifóide, brucelose) ou fungemia: Coletar três hemoculturas, de sítios anatômicos diferentes, duas simultâneas e uma em intervalo de aproximadamente 1 a 2 horas. Pacientes em antibioticoterapia: coleta deve ser feita na menor concentração do agente, ou seja, minutos antes da próxima dose de antimicroabiano. Volume de sangue recomendado Neonatos a 1 ano (<4 Kg): 0.5 a 1.5ml, sempre que possível coletar pelo menos 1ml; Crianças de 1 a 6 anos: 1ml por ano de idade dividido em duas hemoculturas (punções de sítios diferentes). Por exemplo: 3 anos, coletar 1,5ml por punção em dois sítios diferentes distribuindo cada punção em um frasco, totalizando 3 ml. Se a criança tiver baixo peso, ou coletas de sangue prévias, consultar o médico responsável antes de efetuar as coletas Crianças entre 14 a 37kg: coletar 10 a 20 ml divididos em duas punções de sítios diferentes distribuindo cada punção em um frasco Adultos e crianças maiores que 37kg: coletar 40ml divididos em duas punções de sítios diferentes distribuindo cada punção em dois frascos, 10ml por frasco. 4

5 TIPO DE FRASCO DE HEMOCULTURA Verifique e confirme se o paciente está utilizando antimicrobiano. Esta informação irá definir o frasco que deverá ser utilizado: Sem antibioticoterapia: frasco azul (até 10ml) + frasco roxo (até 10ml) Com antibioticoterapia: frasco verde (até 10 ml) + frasco laranja (até 10ml) Pediátrico: Frasco amarelo para todos (até 5 ml) UROCULTURA Obter a primeira urina da manhã sempre que possível ou reter a urina na bexiga por no mínimo 2 horas antes de realizar a coleta. A permanencia da urina na bexiga por pelo menos 4 horas é o ideal pois diminui o número de resultados falso negativos. Não forçar a ingestão de líquido a fim de induzir a micção do paciente, líquidos em excesso irão diluir a urina, diminuindo a contagem de colônias ou gerando resultados falso negativos A amostra de urina deve ser preferencialmente coletada no laboratório O frasco deve ser identificado corretamente, o coletador deve conferir os dados do paciente ao receber a amostra e anotar na etiqueta o horário da coleta, bem como se a coleta foi realizada por saco coletor, sonda de alívio ou punção NUNCA coletar urina de comadre ou papagaio ou do saco coletor de pacientes sondados NÃO enviar ao setor a amostra caso a criança tenha defecado. Após a micção, retirar cuidadosamente o coletor, fechar e enviar ao laboratório Pacientes com cateter urinário Fechar a sonda 30 minutos antes da coleta. Utilizando gaze embebida em álcool 70%, realizar a desinfecção da porção superior da cânula, aspirar a urina utilizando seringa e agulha estéreis. A urina pode ser enviada ao laboratório na própria seringa ou pode ser transferida para o tubo cônico e em seguida enviada ao laboratório. NUNCA colete urina da bolsa coletora do cateter Urina coletada por sonda de alívio A passagem de sonda de alívio é uma decisão do médico e o procedimento é feito pela equipe de enfermagem. É recomendado desprezar o fluxo inicial (aproximadamente 30ml) antes de recolher a amostra para cultura Esta técnica é indicada para coleta infantil quando houver dúvidas na interpretação dos resultado da cultura de urina Punção suprapúbica A amostra coletada por seringa e agulha diretamente da bexiga, o procedimento é realizado pelo médico do paciente e é indicado para cultura de anaeróbios e coleta infantil quando houver dúvidas na interpretação dos resultado da cultura de urina 5

6 Urina de Primeiro Jato Higienizar a área genital conforme descrito para urina jato médio, coletar os primeiros 10ml de urina. COPROCULTURA Coletar a amostra durante a fase aguda da diarréia, preferencialmente antes da antibioticoterapia; O frasco deve ser identificado corretamente, o coletador deve conferir os dados do paciente ao receber a amostra e anotar na etiqueta o horário da coleta; Não utilizar papel higiênico para coletar as fezes, pois ele pode ser impregnado com sais de bário, que são inibidores de patógenos fecais Em caso de crianças, admite-se a coleta sobre fralda descartável nova, do lado contrário, recolhendo-se as fezes logo após a evacuação, pois as fraldas podem ser impregnadas com sais de bário, que são inibidores de patógenos fecais Evite a contaminação da amostra fecal com urina ou água do vaso sanitário PROCEDIMENTO DE COLETA: Fezes coletadas pelo paciente Meio de transporte Carry Blair Coletar as fezes em um recipiente limpo e seco, fornecido pelo laboratório. Retirar o swab da embalagem, passar o lado que contém o algodão nas fezes (de preferência nas partes da amostra contendo muco, sangue ou pus, quando presentes). Abrir o tubo contendo meio de transporte; Colocar a parte de algodão impregnada de fezes dentro do meio de transporte (parte gelatinosa do tubo) Identificar o tubo, de forma legível, com nome do paciente, dia e a hora da coleta; Transferir para o frasco com tampa fornecido pelo laboratório uma porção da amostra de aproximadamente 5 ml de fezes diarreicas, ou 5g de fezes formadas (porção do tamanho de uma nóz), fechar bem o frasco. Identificar, de forma legível, com nome do paciente, dia e a hora da coleta; Encaminhar o tubo com o swab e o frasco imediatamente ao laboratório ou refrigerar por no máximo 24hs Swab Retal Passar a ponta de um swab estéril aproximadamente 1 cm além do esfíncter anal. Cuidadosamente rodar o swab para coletar amostra das criptas anais, retirar o swab. Certifique-se de que existe coloração fecal no algodão. Colocar o swab no meio de transporte (Cary-Blair) e enviar ao laboratório. Para facilitar a coleta o swab pode ser umedecido em salina ou água destilada estéril. Conteúdo de colostomia, ileostomia ou duodenal Colocar em um recipiente bem fechado, a prova de vazamento ou no vial do meio de transporte e enviar imediatamente ao laboratório 6

7 FLUIDOS CORPORAIS Líquidos sinovial, pleural (empiema ou toracentesis), peritoneal (abdominal, ascite ou paracentesis), pericardico, culdocentesis (bolsa entre parede anterior do reto e posterior do utero), aminiótico (amniocentesis). CULTURA OCULAR A maioria das amostras oculares deve ser coletada pelo oftalmologista, estas amostras devem ser inoculadas diretamente nos meios de cultura fornecidos pelo laboratório, no próprio consultório médico ou na clínica. Infecções Oculares meios de cultura que devem ser solcitados ao laboratório: Condição Meio de cultura Patógeno primário Comentário Clínica Indicado Conjuntivite Agar Sangue Agar Chocolate MacConkey (se paciente hospitalizado) H. influenzae, S. aureus, S. pneumoniae, S. pyogenes. Moraxela spp., N. gonorrhoeae Ceratite Endoftalmite Celulite periorbital Celulite Orbital Agar Sangue Agar Chocolate MacConkey Cultura para fungo Cultura para micobacteria Agar Sangue Agar Chocolate MacConkey Cultura para fungo Cultura para micobacteria Cultura para anaeróbio Agar Sangue Agar Chocolate MacConkey Cultura para anaeróbio Agar Sangue Agar Chocolate MacConkey Cultura para fungo Cultura para anaeróbio Trauma ou ulcera de córnea: P. aeruginosa, S. aureus, S. pneumoniae, S. grupo viridans, Moraxella spp, micobacterias de crescimento rápido, Nocardia spp. Lentes de contato: BGN, incluindo P. aeruginosa, Serratia spp, Bacillus spp e Acanthamoeba spp. Traumática ou pós cirurgica: S. aureus, Staphylococcus coagulase negativa, Streptococcus do grupo viridans, Bacillus spp, P. acnes, Anaeróbios incluindo Clostridium spp S. aureus S. pyogenes H. influenzae S aureus S. pneumoniae BGN incluindo P. aeruginosa H influenzae S. pyogenes Anaerobios 7 Enterobacterias e P. aeruginosa podem ser importantes em pacientes hospitalizados. Pesquisa de Chlamydia deve ser feita em neonatos Infecções mistas aerobios e anaeróbios podem ser secundarias a sinusites ou traumas. Culturas de sangue devem ser coletadas. Aspergillus e Mucor são importantes em diabéticos e imunocomprometidos Inoculação nos meios de cultura: Inocular na seguinte ordem 1º Agar Chocolate, 2 Agar Sangue e quando necessario 3º MacConkey, rolando o swab na superficie do agar formando um Z. Para cultura de anaeróbios a amostra deve ser inoculada diretamente em caldo de thioglicolato Confecionar dois esfregaços em lâmina de vidro para coloração. Lâminas especiais devem ser utilizadas para pesquisa de Chlamydia (lamina azul com circulo transparente no qual deve ser confeccionado o esfregaço).

8 Tubo com agar Sabouraund deve ser inoculado quando houver solicitação de cultura para fungos. FERIDAS/ ABSCESSOS E TECIDOS MOLES Considerações Coletar amostras somente de feridas que tenham sinas clínicos de infecção ou que não cicatrizam por longo período. Coletar a amostra antes do inicio da antibioticoterapia Evidencias do processo infeccioso podem ser documentadas pela presença de leucócitos (PMN) no esfregaço corado pelo Gram. Assim, a qualidade da amostra deve ser avaliada pelo Gram, que será utilizado como guia para interpretação e seguimento da cultura. A presença de células epiteliais indica contaminação da amostra com microbiota da pele e mucosa e pode comprometer o significado da cultura. Evitar coleta com swab se amostras apiradas ou biopsias podem ser obtidas. Culturas de lesões secas e crostas NÃO devem ser coletas. Swabs de feridas Feridas superficiais, nas quais não há fluido/exsudato suficiente para ser aspirado, podem ser coletadas com swabs Coletar swabs somente de feridas clinicamente infectadas ou daquelas feridas crônicas que não cicatrizam; Culturas para aeróbios e anaeróbios são indicadas para todas as feridas profundas e mordeduras que tenham sinais clínicos de infecção Após desbridamento da ferida, rolar gentilmente o swab sobre a superficie aproximadamente 5 vezes, focando nas áreas onde houver evidência de infecção (pus e tecido inflamado). Após a coleta o swab deve ser colocado imediatamente em meio de transporte (Amies) e enviado ao laboratório. Se houver indicação de cultura para anaeróbios, dois swabs devem ser coletados. Confeccionar um esfregaço em lâmina de vidro para bacterioscopia utilizando um swab seco Fluidos de drenagem São aceitos para culturas fluidos de drenagem biliar, toraxica e abdominal. Os tubos de drenagem não devem ser enviados para cultura pois são altamente contaminados por microbiota da pele. A amostra não deve ser coletada das bolsas coletoras. Culturas de drenagem cirurgica de procedimentos cirurgicos limpos não são indicadas se não houver sinais de infecção. Os fluidos devem ser coletados por aspiração direta do fluido fresco da área que está sendo drenada ou por aspiração do fluido fresco no tubo de drenagem após descontaminação da superficie do tubo. Colocar o fluido aspirado em um tubo estéril e enviar imediatamente ao laboratório. 8

9 TRATO RESPIRATÓRIO INFERIOR Escarro expectorado TRATO RESPIRATÓRIO Para esta amostra o paciente irá participar ativamente da coleta, no entanto a supervisão direta do pessoal da enfermagem ou fisioterapia garante um melhor resultado. Coletar a amostra sempre que possível antes da antibioticoterapia. Na suspeita de infecção por micobactérias coletar 3 amostras em dias consecutivos ou alternados, somente uma amostra por dia. Orientações ao paciente O primeiro escarro da manhã, antes da ingestão de alimentos é considerado a melhor amostra; O paciente deve escovar os dentes sem creme dental (pasta de dentes) e enxaguar a boca várias vezes com a água, inclusive com gargarejos; Quando for o caso, retirar a protese dentária (dentadura) antes da coleta; Respirar fundo várias vezes, e tossir profundamente, a amostra deve vir do `peito` e não da `garganta` Recolher o escarro expectorado dentro de um frasco de boca larga com tampa rosca fornecido pelo laboratório, encostando a borda do frasco abaixo do labio anterior, certificando-se que não contaminou a parte externa do frasco. Fechar bem o frasco O escarro obtido deve ser PURULENTO, amostras constituidas por saliva são impróprias para análise bacteriológica pois não representam o trato respiratório inferior. CRITÉRIOS DE REJEIÇÃO: Rejeitar amostras em duplicata recebidas no mesmo dia, a menos que o laboratório tenha solicitado nova coleta devido a qualidade ruim da primeira amostra Não aceitar culturas repetidas em menos que 48 horas Rejeitar amostras constituidas exclusivamente por saliva Rejeitar cultura para anaeróbio de amostras de escarro, aspirado traqueal ou lavado broncoalveolar. A amostra adequada para este exame é o escovado bronquico protegido. PROCEDIMENTO DE COLETA Ouvido/Orelha externa SWAB OUVIDO/ORELHA A amostra do ouvido externo não reflete a causa da otite média, exceto quando houver ruptura recente da membrana do tímpano; Remover secreção superficial com swab umedecido em salina estéril; Inserir um swab dentro do canal do ouvido até encontrar 9

10 resistência; Girar o swab e coletar o fluido no swab; Colocar o swab no meio de AMIES e enviar ao laboratório AMOSTRA VAGINAL AMOSTRAS GENITAIS Exames: Bacterisocopia e a fresco, para pesquisa de vaginose bacteriana (Gardnerella vaginalis, e outros microrganismo facultativos e anaeróbios, principalmente Mobiluncus spp. Prevotella spp e Peptostreptococcus spp), vaginite por Candida albicans e /ou Trichomonas vaginalis e vaginite descamativa. PROCEDIMENTO DE COLETA: Após introdução do espéculo: Coletar a secreção do fundo de saco ou da parede vaginal utilizando swab de Dacron estéril. Confeccionar um esfregaço em lâmina para bacterioscopia (Gram) girando o swab delicadamente sobre a superfície da lâmina, não esfregue o swab sobre a lâmina, pois este procedimento destrói as estruturas celulares. Lave/homogeinize o mesmo swab em 1ml de solução fisiológica estéril fornecida pelo laboratório para o exame a fresco NOTA: esta coleta pode ser realizada sem espéculo: limpe a secreção externa com auxílio de uma gaze, introduza o swab no introito vaginal e faça movimento de rotação para coletar o material. AMOSTRA ENDOCERVICAL Exames: Pesquisa de Neisseria gonorrhoeae, Pequisa de Chlamydia trachomatis, Pesquisa de Mycoplasma e Ureaplasma PROCEDIMENTO DE COLETA: Introduzir o espéculo para visualizar o colo do útero. Se necessário, utilizar água morna para facilitar a introdução do espéculo, não utilizar lubrificantes, pois estes podem ter ação antibacteriana; Limpar o colo do útero com gaze estéril ou swab, removendo secreções vaginais e muco endocervical; Introduzir o swab estéril 1-2 cm no canal endocervical, girar delicadamente 180 várias vezes e retirar cuidando para não tocar nas paredes vaginais; O primeiro swab (alginatado) deve ser utilizado para pesquisa de Neisseria gonorrhoeae, o swab deve ser inoculado imediatamente em meio de transporte de Amies com carvão; O segundo swab deve ser utilizado para pesquisa de Chlamydia trachomatis. Fazer um esfregaço fino e homogeneo na área demarcada da lâmina para IFD e/ou colocar o swab em meio de transporte específico para técnica molecular (PCR); O terceiro swab de Dacron, poliester ou alginato deve ser utilizado para pesquisa de Mycoplasma e Ureaplasma, colocar o swab imediatamente no meio de transporte específico para realização da cultura; os micoplasmas têm grande afinidade pelas células de mucosas, é importante efetuar uma boa raspagem da mucosa para garantir a coleta de uma amostra adequada. O frasco com meio de transporte deve estar a temperatura ambientecoletar separadamente o material endocevical e vaginal, utilizando swabs diferentes. AMOSTRA INTROITO VAGINAL E RETAL Pesquisa de Streptococcus agalactiae (beta hemolítico do grupo B) Coletar amostra entre a 35 e 37 semanas de gestação. Informar ao laboratório se paciente alérgica a penicilina para que seja testado perfil de suscetibilidade a eritromicina e clindamicina 10

11 PROCEDIMENTO DE COLETA Coletar um único swab da vagina distal (introito vaginal sem espéculo) seguido pela coleta retal (inserir o swab através do esfíncter anal) amostra swab vaginal/retal, ou coletar dois swabs separados uma para cada sítio Inserir o swab em meio de transporte de Amies AMOSTRA URETRAL Avisar ao paciente que a coleta da amostra pode ser dolorosa, que a micção seguinte pode ser dolorosa, e que o aumento da ingestão de líquidos pode ajudar a diminuir a concentração da urina e, portanto, o desconforto. PROCEDIMENTO DE COLETA O paciente não deve ter urinado por pelo menos 2 horas, a micção pode diminuir a capacidade de detectar organismos. Utilizar swab fino com haste flexível, específico para coleta uretrogenital. Umedecer o algodão com salina antes da inserção pode ajudar a reduzir o desconforto. Introduzir o swab lentamente (3-4 cm em homens; 1-2 cm em mulheres), girar lentamente, mantendo 1 a 2 segundos e retirar delicadamente. Bacterioscopia: Preparar um esfregaço rolando o swab na superfície de uma lâmina de vidro para bacterioscopia (Gram), o mesmo swab deve ser colocado em solução fisiológica estéril para pesquisa de Trichomonas e/ou leveduras Pesquisa de N. gonorrhoeae: repetir o procedimento descrito acima, e colocar o swab no meio de transporte de Amies com carvão. Pesquisa de Chlamydia: repetir o procedimento descrito acima, Fazer um esfregaço fino e homogeneo na área demarcada da lâmina para IFD e/ou colocar o swab em meio de transporte especifico para técnica molecular (PCR) Pesquisa de Micoplasma e Ureaplasma: repetir o procedimento descrito acima utilizando swab de Dacron, poliester ou alginato, colocar o swab imediatamente no meio de transporte específico para realização da cultura; O frasco com meio de transporte deve estar a temperatura ambiente. AMOSTRA: LESÕES GENITAIS (vesículas e úlceras) Pesquisa de Haemophylus ducreyi (pápula que evolui para pústula e úlcera, com fundo raso, borda amolecida e bem definida, lesão única ou múltiplas, apresenta-se sensível e dolorosa cancro mole); Pesquisa de Treponema pallidum (lesão ulcerada de fundo limpo com borda endurecida, geralmente indolor cancro duro), Pesquisa de Chlamydia trachomatis (úlcera ou vesicula pequena lifogranulona venério); Pequisa de Klebsiella granulomatis(nódulo único ou multiplo, com curso crônico, aumenta causando erosão cutânea, evoluindo para úlcera profunda e indolor); Herpes simplex tipos 2 e 1 (múltiplas lesões: pápulas, vesículas bolhas, pústula ou úlceras, normalmente dolorosas e sensíveis e geralmente recidivantes); Papiloma vírus humano (verruga genital verruga única ou multiplas, de coloração escura com formações espiculadas) PROCEDIMENTO DE COLETA: Limpar a superficie da lesão com solução salina (0.85% NaCl). Se houver somente eritema ou edema, coletar swab do exsudado ou do eritema para realizar cultura de leveduras. Se houver úlcera realizar pesquisa de H. ducreyi e T. Pallidum. Se houver crosta na lesão, removê-la gentilmente umedecer o swab com salina estéril e coletar friccionando vigorosamente a base da lesão para cultura de H. Ducreyi. Alternativamente, raspar delicadamente a lesão com uma lâmina de bisturi estéril até emergir um fluido seroso (tente evitar o sangramento).. Irrigar com salina. Cultura para H ducreyi: esfregar vigorosamente a base com swab estéril ou aspirar o fluido 11

12 com seringa e agulha. Colocar a amostra diretamente em meio de cultura (Ágar chocolate), ou meio de transporte (meio de AMIES) e confeccionar um esfregaço para coloração de Gram Pesquisa de T pallidum: limpar o fluido, sangue ou debris celulares com gase estéril, aplicar uma leve pressão na base da lesão, ocorrerá exsudação de fluidos do tecido, enxugar as primeiras gotas até o surgimento de um fluido claro e seroso. Recolher o fluido diretamente em uma lâmina e cubrir com lamínula para microscopia de campo escuro. Se nenhum exsudato estiver presente, adicionar uma gota de salina, raspar a base da lesão e aspirar novamente a gota de salina colocar o material em uma lâmina e cobrir com lamínula Fazer um esfregaço em outra lâmina para coloração de Fontana. AMOSTRA RETAL Pesquisa de N. gonorrhoeae PROCEDIMENTO DE COLETA: Para realizar cultura de N. gonorrhoeae introduzir o swab 2 a 3 cm dentro do canal anal, fazer movimentos circulares por 10 a 30 segundos junto a parede retal, pressionando lateralmente para obter células epiteliais colunares. Se houver contaminação fecal visível, descartar o swab e obter uma outra amostra. TRANSPORTE E ARMAZENAMENTO - Após a coleta, anotar na etiqueta o horário da coleta. - Enviar ao laboratório imediatamente as amostras para: 1) Assegurar a sobrevivência e isolamento do microrganismo, pois o laboratório de microbiologia trabalha basicamente en função da viabilidade dos microrganismos. 2) Evitar o contato prolongado dos microrganismos com anestésicos utilizados durante a coleta, pois eles poderão exercer atividade bactericida. 3) Evitar erros de interpretação nas culturas quantitativas, principalmente urina e lavado broncoalveolar. 4) Consultar o laboratório para verificar a disponibilidade dos meios de transporte. Tempo crítico para entrega da amostra ao laboratório e meios de transporte Amostra Tempo crítico Frascos e meios de transporte Liquor Imediato sem refrigerar Tubo seco estéril Líquido pleural Imediato sem refrigerar Tubo seco estéril Swab Imediato sem refrigerar Tubo seco estéril ou meio semi-solido (Stuart, Amies) Suspeita de anaeróbios 30 min Meio de transporte apropriado, não transportar em seringa com agulha Hemocultura 30 min (não refrigerar) Frascos com meios de cultura para rotina manual ou automatizada Trato respiratório 30 min Tubo seco estéril Trato gastrointestinal 1 hora Tubo seco estéril Urina 1 h ou refrigerada até 24 h Pote seco estéril Fezes 12 h se meio de transporte Cary Blair meio modificado para transporte de fezes, com ph 8,4. Boa recuperação também para Vibrio sp e Campylobacter sp 12

13 Criterios de rejeição para amostras clínicas O microbiologistas ou responsável pela rotina deverá verificar se a amostra está apropriadamente identificada, se a quantidade de material é sufuciente e observar o aspecto da amostra purulento, limpido, hemorrágico, etc. Fungos: Coleta direta Limpar a superfície da pele com álcool a 70%; não utilizar iodo. Recomenda-se não lavar a lesão com sabões antissépticos no dia da coleta, não utilizar cremes hidratantes ou talco. Usando um bisturi, com lâmina estéril, raspar as bordas ativas da lesão. A coleta de material da área central pode ser causa de resultados falso-negativos. Amostra do couro cabeludo inclui cabelo, que é seletivamente coletado para exame (aqueles que apresentem características de tonsura, quebradiços) sendo arrancado pela raiz. Amostra de unha - obter raspado e/ou material abaixo da unha, utilizando se bisturi com lâmina estéril. Deve-se retirar o esmalte pelo menos um dia antes da coleta remanescentes de esmalte ou acetona podem interferir no crescimento fúngico em casos de solicitação de cultura para fungos. Os materiais obtidos podem ser colocados em placa de Petri estéril e identificados separadamente para cada sítio a ser investigado (por exemplo, unha da mão direita, raspado do pé esquerdo, raspado da região plantar, etc.). Transportar as amostras ao laboratório em temperatura ambiente. Não se recomenda a conservação sob refrigeração. 3. Microscopia e coloração Direto sem coloração Salina Material Indicação Técnica Salina (soro fisiológico) Lâmina e Lamímula Observação da morfologia bacteriana e avaliação da motilidade Pesquisa a fresco de Trichomonas em sereções e fungos em diferentes materiais Gotejar a salina no centro de uma lâmima de miscroscopia e nela suspender uma colônia ou uma alçada do material a ser investigado Cobrir com uma lamínula e examinar ao microscópio, com objetiva de 40 X ou 100 X (óleo de imersão) Hidróxido de Potássio Material Indicações Técnica Hidróxido de Pesquisa de fungos (leveduras e potássio em solução filamentosos) em materiais aquosa a 10% ou 20%, Lâmina. biológicos (muco, restos celulares, pelos, unhas, etc) Lamínula Dissolver a queratina e o muco, destacando as estruturas fúngicas, quando presentes Inserir a amostra no centro da lâmina; Suspender o material com uma a duas gotas de KOH; Cobrir com lamínula e aguardar 30 min ou aquecer ligeiramente a lâmina para acelerar o clareamento; Examinar em 10X ou 40X, fechando o diafragma; As lâminas podem ser colocadas em câmara úmida e, após 24 h, realizar nova leitura. 13

14 Exame em campo escuro Material Indicação Técnica Microscópio com condensador de Observar a motilidade de bactérias não observadas em microscopia Para o Treponema pallidum: Atritar as bordas da lesão suspeita com um campo escuro e, direta com salina (ex. Treponema swab ou alça bacteriológica; Colher o quando possível, em 100X com íris. pallidum e da Leptospira sp.) exsudato com a própria alça ou fazer um imprint com a lâmina; Cobrir com a lamínula Lâmina. Lamínula Observar a motilidade do (utilizar uma gota de salina); Realizar a Salina. Óleo de Campylobacter sp. e outras pesquisa rapidamente. imersão bactérias. Para a Leptospira sp.: Utilizar a urina recém-emitida, centrifugada e examinar o sedimento; Em campo escuro, colocar óleo de imersão entre o condensador e a parte inferior da lâmina (encostar o condensador na lâmina); Observar em objetiva de 40X; Avaliação do material seguindo a bacterioscopia por imersão, com objetiva de 100X. Tinta da China Material Indicação Técnica Tinta da China (nanquim) Lâmina. Lamínula Pesquisar criptococos em líquor ou outros materiais, permitindo destacar a cápsula desse fungo contra um fundo negro COLORAÇÕES Suspender o sedimento do líquor ou uma colônia do meio de cultura em uma gota de tinta da China, fazendo-se um filme fino entre a lâmina e a lamínula; Observar em objetivas de 10X e 40X. Se espesso, adicionar uma gota de salina esterilizada para facilitar a observação. É comum confundir linfócitos com criptococos. A diferenciação é feita pelo núcleo refringente e gemulação do fungo Coloração de Gram A coloração de Gram é utilizada para classificar bactérias com base no tamanho, morfologia celular e comportamento diante dos corantes. No laboratório de microbiologia clínica é um teste adicional rápido para o diagnóstico de agentes infecciosos, sendo também utilizado para avaliar a qualidade da amostra clínica analisada. As interpretações dos esfregaços corados pelo Gram envolvem considerações relacionadas com as características da coloração, tamanho, forma e agrupamento das células. Essas características podem ser influenciadas por vários fatores, incluindo idade da cultura, o meio de cultivo utilizado, a atmosfera de incubação e a presença de substâncias inibidoras. Não se pode deixar de destacar que a coloração de Gram somente será um recurso rápido e útil quando for corretamente realizada (do ponto de vista técnico) e interpretada por profissionais experientes. Utilização Para bacterioscopia da maioria dos materiais biológicos ou culturas de microrganismos em meios sólidos ou líquidos. As amostras de culturas jovens (< 24h) de meio de cultura sem inibidores e amostras clínicas recém-coletadas são as que fornecem melhores resultados. Na verificação da morfologia bacteriana a partir de esfregaços de cultura em caldo. Materiais necessários Lâminas de vidro, alça bacteriológica, bico de Bunsen, meio de cultura, óleo de imersão, Luvas, cronômetro, Salina estéril 0,85%, microscópio. 14

15 Técnicas para preparar o esfregaço A coloração de Gram pode ser feita de forma direta (coleta com swab da infecção) ou indireta transferindo o material do meio líquido ou meio sólido, Utilizar uma gota de salina estéril em uma lâmina limpa. Transferir uma pequena porção da colônia com alça bacteriológica. Misturar suavemente para obter um esfregaço levemente turvo e homogêneo. A Fixação do Esfregaço pode ser feita pelo Calor ou Metanol. Através do calor: todo o esfregaço, antes de ser submetido à coloração, deverá estar seco (exposto ao ar), sendo fixado com calor brando (50ºC), a fixação excessiva e o superaquecimento irão distorcer a morfologia celular e a fixação insuficiente permitirá a saída do material durante o processo de coloração. Deixar a lâmina esfriar antes de iniciar a coloração. Através do Metanol ou Etano: a fixação pelo metanol ou etanol também pode ser utilizada. Além de prevenir a lise das hemácias, evita que os esfregaços, principalmente os de urina, desprendam-se no momento da coloração. Deixar o esfregaço secar numa superfície plana; após, colocar uma a duas gotas de álcool (1 minuto), drenando o excesso, sem lavar. Não aquecer a lâmina antes da coloração. Coloração: Cobrir a área com a solução de cristal-violeta por cerca de um minuto. Decantar o cristal-violeta e lavar suavemente com a própria solução de iodo ou água da torneira. (Obs.: lavagem excessiva nessa etapa pode causar a retirada do cristal violeta das células Gram-positivas). Cobrir a área do esfregaço com a solução de lugol durante cerca de um minuto. Descorar a lâmina com a mistura álcool-acetona (1:1), até que o solvente escorra incolor. Alternar com água corrente (jato fraco). O tempo usualmente utilizado nessa etapa é de cerca de 10 segundos. (Obs.: lavagem excessiva nessa etapa pode causar a retirada do cristal violeta das células Gram-positivas, assim como, a pouca descoloração pode resultar em pouca retirada do cristal violeta, ocasionando uma tonalidade azulada nas bactérias Gram- -negativas). Cobrir o esfregaço com a solução de safranina (ou Fucsina básica 0.1% a 0.2%), por cerca de 30 segundos. Lavar com água corrente. Deixar secar Como reportar os resultados As bactérias Gram-positivas retêm o cristal-violeta e se apresentam com coloração violeta enquanto as Gram-negativas são descoradas pelo álcool-acetona, sendo, portanto, coradas com o corante de fundo (fucsina ou safranina) e se apresentam avermelhadas. Coloração de Albert Laybourn (Corinebactérias) Solução A: Azul-de-toluidina = 0,15g; Verde-malaquita = 0,20g; Ácido acético glacial = 1ml; Álcool 95% = 2ml; Água destilada = 100ml Solução B: Iodo = 2g Iodeto de potássio = 3g; Água destilada = 300ml Execução: Corar 3 min com solução A; Escorrer e lavar com água corrente, cobrir com solução B; Após 2 min lavar com água corrente; Enxugar com papel filtro e secar sem passar na chama; Observar o corpo bacteriano corado em verde e os grânulos metacromáticos (castanho- escuro). Coloração de Ziehl-Neelsen Solução de carbolfucsina: Fucsina básica = 0,3 g ; Álcool etílico a 95% = 10 ml ; Cristais de fenol derretidos = 5 ml; Água destilada = 95 ml OBS: Dissolver a fucsina básica no álcool e o fenol na água; Misturar as duas soluções; Deixar repousar por vários dias antes de usar. 15

16 Ácido-álcool Álcool etílico = 97 ml; Ácido clorídrico concentrado = 3 ml Coloração de fundo (azul de metileno) Azul de metileno = 0,3 ml; Água destilada = 100 ml Execução: Cobrir a superfície da lâmina com a solução de carbolfucsina, aquecer a lâmina coberta com o corante, lentamente com auxílio de um bico de Bunsen, até a emissão de vapores, tomando o cuidado para não deixar ferver. Aquecer com calor baixo ou intermitente por um período de três a cinco minutos. Deixar a lâmina esfriar. Lavar a lâmina com água corrente. Cobrir a lâmina com solução de álcool - ácido a 3% e descorar o esfregaço até que o corante não drene mais da lâmina. Lavar a lâmina com água corrente e esgotando todo resíduo da mesma. Cobrir a lâmina com o corante de contraste (azul de metileno), por 20 a 30 segundos. Lavar a lâmina com água corrente e deixar secar naturalmente sem forçar com papel de filtro. Examinar o esfregaço com objetiva de imersão no aumento de 100x. Meios de cultura: O crescimento dos microrganismos nos diferentes meios de cultura utilizados fornece as primeiras informações para a sua identificação. É importante conhecer o potencial de crescimento de cada meio de cultura e adequar ao perfil bacteriano esperado para cada material. Ágar sangue (AS) meio rico e não seletivo, diferencial para a hemólise, nele crescem a maioria dos Gram negativo e Gram positivo, além de fungos filamentosos (bolores) e leveduras, exceto algumas espécies de hemófilos e outros fastidiosos. Ágar chocolate (AC) meio rico e não seletivo, permite o crescimento da grande maioria das bactérias aeróbias e facultativas. Quando incubado em CO2 dá suporte também ao crescimento dos microaerófilos. Pode-se observar halos esverdeados com colônias alfahemolíticas. Ágar MacConkey (MC) meio seletivo para Gram negativo e diferencial para a utilização de lactose. Deve inibir o crescimento de microrganismos Gram positivo. Lactose positiva coloração avermelhada Lactose negativa coloração inalterada Como exceção, eventualmente, podem crescer Enterococcus, Candida e Bacillus. Ágar Salmonela-Shigella (SS) meio seletivo para Salmonela e Shigella e diferencial para a utilização de lactose (coloração rósea) e produção de H2S (coloração negra). Ágar Hecktoen Enteric (HE) - meio seletivo para Salmonela e Shigella e diferencial para a utilização de lactose (coloração alaranjada) e produção de H2S (coloração negra). Ágar Thayer Martin Modificado (TMM) meio seletivo pela adição de colistina, vancomicina e nistatina inibe crescimento de enterobactérias, Gram positivos, fungos e algumas espécies de Neisserias saprófitas. Enriquecido com a adição de complementos para a recuperação de N. meningitidis e N. gonorrhoeae Vide módulo de meios de cultura para características de outros meios. 16

17 Material clínico e os respectivos meios de cultura Meios de cultura para semeadura dos principais materiais clínicos e indicação de exames microscópicos, que podem ser alterados conforme suspeita clínica. Meios de cultura Material AC AS MC TIO OUTRO Lj SAB MYC Lâmina Abscesso profundo x x x 1 Ferida cutânea/cirúrgica x x x x x 1 Abscesso cerebral x x x x x x x 2 Abscesso pulmonar x x x x 2 Biópsia x x x 2 Coprocultura (fezes) x SS Nào Líquido de Diálise x x x 1 Endométrio/ Amniótico x x x 1 Escarro piogênico x x 2 Escarro para Tuberculose x 1 Esperma/ Prostático x x 1 Fístula/ Dreno x x Não Gânglio x x x x x x 2 Lavado Brônquico (BAL) x x x x x 1 Líquor (LCR) x x x x x 2 Nasal/ Orofaringe x x Não Osso (Biópsia / Aspirado) x x x 1 Ocular x x x 2 Orofaringe x x 1 Ouvido x x x 1 Peritonial/Ascítico x x x x 1 Pleural x x x x 2 Ponta de cateter x Não Sangue/Hemocultura x x 1 Uretral x x TM 1 Urina CLED 1 Vaginal/Endocervical x x x TM 1 Nota: Quando solicitada a bacterioscopia observar desvios de flora e presença de leucócitos. 1 AC = ágar chocolate; AS = ágar sangue; MC = ágar Mac Conkey; TIO = caldo tioglicolato; LJ = ágar Lowenstein Jensen; SAB = ágar Sabouraud; MYC = Mycosel; SS = ágar Salmonella-Shigella; TM = ágar Thayer Martin (opcional); CLED = ágar CLED Para fungos ou micobactérias Para fungos: Sabouraud e Mycosel, ver orientação específica para semeadura. Agência Nacional de Vigilância Sanitária/MS 59 Módulo 4: Procedimentos Laboratoriais: da requisição do exame à análise microbiológica e laudo final Para micobactérias: Lowenstein Jensen, materiais contaminados com flora devem ser previamente descontaminados (escarro, urina, aspirado gástrico, lavado bronquio-alveolar, fezes). Procedimentos para semeadura em meios de cultura Semeadura qualitativa Organizar as placas, pré-aquecidas em estufa (ideal para fastidiosos), ou à temperatura ambiente, sobre a bancada conforme o material a ser semeado. Identificá-las com o número da amostra e iniciais do paciente. Separar as lâminas correspondentes a cada exame, a serem preparadas e identificálas. Homogeneizar o material, quando líquido (urina, LCR, sangue, pleural, etc.). Escolher a porção mais purulenta no caso de secreções, ou no caso de fezes, a parte com sangue, muco ou pus. Os swabs deverão ser rolados sobre os meios de cultura, seguindo a sequência dos mais ricos para os mais seletivos (Ágar Chocolate, Ágar Sangue, 17

18 Mac Conkey). Com material muito líquido (LCR, pleural não purulento) concentrar o material por centrifugação a rpm (1500 g) por minutos e semear o sedimento. Na semeadura de rotina pode-se utilizar placas com divisões de dois e três compartimentos para racionalização de gastos, mas seu uso exige maior habilidade na semeadura a fim de se obter colônias isoladas. Ex.: hemocultura em placa tríplice: Ágar sangue, Ágar chocolate e Ágar Mac Conkey. Secreções em placa dupla: Ágar sangue e Ágar Mac Conkey, proceder a uma semeadura que permita o crescimento de colônias isoladas. Técnica de Semeadura Qualitativa A semeadura para cultivo qualitativo pode ser feita com o próprio swab (do meio de transporte), ou amostra do material removida com alça (estéril) flambada e semeada de forma a obter um gradiente decrescente de concentração do inóculo, que permita o isolamento de todas as colônias diferentes. Recomenda-se que a semeadura e a leitura das placas sejam realizadas pelo mesmo profissional para aprimorar a técnica de semeadura e isolamento de colônias. Semeadura quantitativa Materiais indicados ou recomendados Urina LBA (lavado bronco alveolar) Aspirado traqueal Biópsia de tecido Hemocultura periférica x cateter para diagnóstico de infecção relacionada ao cateter Líquido de diálise Secreção prostática Cateter (técnica de Maki e outras) Técnica de Semeadura Quantitativa O cultivo quantitativo baseia-se na semeadura de um volume conhecido de material e a contagem do número de UFC (unidades formadoras de colônia) obtidas após incubação. Utilizam-se dois artifícios para o efeito de diluição do material. Uso de pequenos volumes: normalmente de 1, 10 ou 100 µl. O número de UFC obtido deverá ser multiplicado pelo fator de correção para 1 ml, relativo ao volume inoculado: 1.000, 100 ou 10, respectivamente. Pode ser realizada utilizando-se volume de material definido pela capacidade da alça calibrada ou volume da pipeta com ponteira estéril. Técnicas dilucionais: costuma-se utilizar a diluição seriada do material em escala decimal, isto é, 1:10, 1:100, 1:1.000 O número de UFC obtido deverá ser multiplicado pelo fator de correção para 1 ml, relativo à diluição utilizada; 10, 100, , respectivamente. Descarregar o material num canto da placa Flambar a alça Esfriar a alça em um canto do ágar Semear partindo da ponta da primeira semeadura A cada mudança de direção flambar a alça e esfriá-la. Incubação A incubação deve seguir alguns parâmetros determinados. Atmosfera: Para bactérias não exigentes em secreções, urina, fezes, etc. incubar em estufa em atmosfera ambiente. Para bactérias exigentes tais como: pneumococos, hemófilos e Neisserias ou fastidiosos incubar em microaerofilia (Jarra com vela acesa de modo a obter 3-5% de CO2). Para Campylobacter é necessário tensão de 5 a 10% de CO2 e restrição de 18

19 O2 sendo conveniente o uso de geradores específicos. Para bactérias anaeróbias, incubar em sistema de anaerobiose estrita. Temperatura: 36 º C +/- 1o C é a temperatura para a grande maioria das bactérias da rotina, incluindo os anaeróbios e micobactérias. Fungos podem ser cultivados a 30º C ou 25 e 35º C. Temperatura a 42º C pode ser necessária para isolar espécies de Campylobacter. Umidade: Bactérias fastidiosas e exigentes (neisserias patogênicas e hemófilos) crescem melhor se forem incubadas num recipiente com tensão de 5% de CO2 com um chumaço de algodão embebido em água estéril. Tempo: Em geral, a primeira leitura é realizada com 18 a 24 horas de incubação ou em casos de urgência para iniciar a identificação e antibiograma, a partir de 6 horas é possível visualizar crescimento de algumas enterobactérias. Para anaeróbios é recomendável a primeira leitura com 48 a 72 horas de incubação. Para bactérias exigentes ou de crescimento lento o período de incubação pode ser bastante prolongado: Micobactérias de 3 a 45 dias; Nocardia, 4 a 7 dias; Brucella 3 a 7 dias (hemoculturas até 45 dias). Para complexo B. cepacia 48-72h. Características macroscópicas das colônias O tamanho das colônias deverá ser considerado na placa como um todo, uma mesma cepa pode formar colônias de tamanhos variados em diferentes pontos da placa. Pequena (até 2 mm de diâmetro) Shigella e Yersinia costumam crescer em ágar MaC Conkey e ágar Salmonella-Shigella como colônias pequenas e lactose negativas. Stenotrophomonas maltophilia, Acinetobacter spp, Enterococcus spp, pneumococos, Streptococcus spp. Cândida spp e alguns esfafilococos coagulase negativo também costumam formar colônias pequenas. Média (até 3 mm de diâmetro) Enterobactérias e estafilococos. Grandes (mais de 4 mm de diâmetro) Bacillus spp, algumas enterobactérias como Klebsiella e Enterobacter, ou Pseudomonas aeruginosa. Vale lembrar a formação de véu, característico do gênero Proteus, Comamonas e algumas cepas de Pseudomonas. Cor A coloração dependerá do meio de cultura utilizado. Meios não diferenciais pode-se identificar a coloração característica de alguns microrganismos: S. aureus amarelo Micrococcus amarelo Serratia marcescens ou rubidae avermelhado Roseomonas - róseo Pseudomonas diferentes tons de verde e castanho Enterococcus casseliflavus amarelo. Meios diferenciais a coloração da colônia sofre interferência das reações que ocorrem com substratos dos meios de cultura: Utilização da lactose no MacConkey vermelho Utilização da lactose no CLED amarelo Utilização do manitol em Ágar manitol salgado amarelo Produção de H2S no TSI, Hecktoen Enteric e Salmonella-Shigella negro. Forma da colônia Redonda: E. coli, Klebsiella, Serratia, Stenotrophomonas, Acinetobacter, Estafilococos, Estreptococos Irregular: Pseudomonas, Proteus, Providencia, Morganella, Bacillus Produção de véu: Proteus, Comamonas, Pseudomonas Filamentosas: fungos filamentosos Formando pontas ou estrelas: Candida albicans Com depressão no centro: Pneumococo Cerebriforme: Pseudomonas stutzeri Elevada: Klebsiella, Bacillus Chata: Enterobacter, Pseudomonas 19

20 Consistência Friável ou quebradiça: Moraxella Mucóide: Klebsiella, Pseudomonas, Bacillus Seca: E. coli, Citrobacter Butirosa (manteiga): Candida Cheiro Cheiro de cloro: Eikenella corrodens Perfume ordinário: Pseudomonas aeruginosa Cheiro fétido: Anaeróbios Caramelo: Streptococcus viridans Fermento: Candida spp Queijo: S. aureus Terra: Nocardia e Streptomyces Peixe: Acinetobacter em ágar sangue Densidade Opaca: E. coli, Candida, S. aureus Brilhante: Stenotrophomonas, Pneumococos Translúcida: Streptococcus beta hemolítico Avaliação do crescimento e contagem Cultura Quantitativa: Avaliar a homogeneidade de crescimento pela placa. Contar separadamente todas as colônias diferentes entre 30 e 300 UFC. Para a contagem deve-se marcar com uma caneta o verso de cada unidade contada, para evitar que se conte duas vezes a mesma colônia. Contagens maiores devem ser determinadas por estimativa: Dividir a placa em 4 ou 8 parte Observar a homogeneidade do crescimento e contar as partes que sejam mais representativas do crescimento total. Contar o número de UFC da parte escolhida e multiplicar pelo total de partes. Converter o número de UFC contadas em UFC/ml ou UFC/g, conforme o material analisado. Utilizar o fator de correção: do volume: 1 µl multiplicar por µL multiplicar por µL multiplicar por 10 e/ou diluição: diluição 1:10 multiplicar por 10 diluição 1:100 multiplicar por 100 diluição 1:1000 multiplicar por 1000 Cultura Semiquantitativa e Qualitativa Para a maioria das culturas não se padroniza o volume do inóculo e semeia-se o swab e/ou o material mais representativo com a alça, com a finalidade apenas de obter colônias isoladas para posterior identificação (secreções cutâneo, mucosas, fezes, etc.). Para esses materiais o objetivo pode ser encontrar um patógeno específico entre bactérias da microbiota considerada normal na área de onde foi obtida a amostra clínica (S. pyogenes em orofaringe, Salmonella e Shigella em fezes, N. gonorrhoeae em secreção uretral, etc). Outras vezes, devem-se relatar as bactérias potencialmente patogênicas e descrever a relação entre as colônias isoladas (predomínio de..., presença de... ou raras colônias de...) Ex: Cultura de ferida cirúrgica = predomínio de S. aureus, presença de P. aeruginosa e raras colônias de E. coli, e ignorar raras colônias de Staphylococcus coagulase negativo, ou de estreptococos alfa hemolíticos, corineformes, quando bactérias potencialmente patogênicas forem isoladas. 20

21 Identificação Meios de cultura O crescimento dos microrganismos nos diferentes meios de cultura utilizados fornece as primeiras informações para a sua identificação. É importante conhecer o potencial de crescimento de cada meio de cultura e adequar ao perfil bacteriano esperado para cada material. Ágar sangue (AS) meio rico e não seletivo, diferencial para a hemólise, nele crescem a maioria dos Gram negativo e Gram positivo, além de fungos filamentosos (bolores) e leveduras, exceto algumas espécies de hemófilos e outros fastidiosos. Ágar chocolate (AC) meio rico e não seletivo, permite o crescimento da grande maioria das bactérias aeróbias e facultativas. Quando incubado em CO2 dá suporte também ao crescimento dos microaerófilos. Pode-se observar halos esverdeados com colônias alfahemolíticas Ágar MacConkey (MC) meio seletivo para Gram negativo e diferencial para a utilização de lactose. Deve inibir o crescimento de microrganismos Gram positivo. Lactose positiva coloração avermelhada Lactose negativa coloração inalterada Como exceção, eventualmente, podem crescer Enterococcus, Candida e Bacillus. Ágar Salmonela-Shigella (SS) meio seletivo para Salmonela e Shigella e diferencial para a utilização de lactose (coloração rósea) e produção de H2S (coloração negra). Ágar Hecktoen Enteric (HE) - meio seletivo para Salmonela e Shigella e diferencial para a utilização de lactose (coloração alaranjada) e produção de H2S (coloração negra). Ágar Thayer Martin Modificado (TMM) meio seletivo pela adição de colistina, vancomicina e nistatina inibe crescimento de enterobactérias, Gram positivos, fungos e algumas espécies de Neisserias saprófitas. Enriquecido com a adição de complementos para a recuperação de N. meningitidis e N. gonorrhoeae. Esquema geral de identificação bacteriana Crescimento bacteriano Observar as características das diferentes colônias crescidas em cada meio de cultura utilizado. Lembrar que o tamanho das colônias de um mesmo agente pode ser variável, conforme a proximidade com outras colônias. Por exemplo, semeadura em Ágar sangue (AS) e Mac Conkey (MC): Observar quantos tipos de colônias cresceram em cada ágar. As colônias que cresceram somente em AS devem ser de microrganismo Gram positivo ou mais exigente. Todas as colônias presentes no MC, microrganismos Gram negativo, devem apresentar correspondente no AS. A escolha dos meios utilizados para cada material deve estar relacionada aos agentes esperados. Crescimento dos microrganismos nos principais meios de cultura utilizados na rotina Mais provável Ágar Chocolate Ágar Sangue CLED Mac Conkey Salm- Shigella Caldo TIO Gram negativo, leveduras e enterococo /+ -/+ + Gram positivo Gram negativos exigentes Haemophilus Anaeróbios * + Meio dá suporte ao crescimento - Meio não dá suporte ao crescimento * Principalmente em coluna alta Optar entre o crescimento a ser valorizado e o que deverá ser ignorado. Muitas vezes é impossível definir o significado clínico de um isolado sem conhecer previamente sua identificação. Todo crescimento deve ser avaliado e classificado como: patógeno em potencial ou provável contaminante. Para tanto, deve-se reunir evidências microbiológicas, clínicas e epidemiológicas: conhecer os principais patógenos esperados para cada material biológico, bem como a respectiva microbiota (flora normal); 21