Determinação de carbamato de etila em cachaça e aguardente por cromatografia a gás acoplada a espectrometria de massas
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- Pedro Henrique Pinheiro Martins
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1 1.0 Objetivos e alcance O MET Determinação de carbamato de etila em cachaça e aguardente por cromatografia gasosa acoplada a espectrômetro de massa objetiva descrever os procedimentos analíticos a serem utilizados na determinação de carbamato de etila em bebidas destiladas de cana-de-açúcar por cromatografia gasosa acoplada ao espectrômetro de massa / massa (CG-MS-MS) e no registro de dados relacionados às análises, para que estes sejam corretamente seguidos. 1.1 Abreviações CE - carbamato de etila CED - carbamato de etila deuterado CID dissociação por colisão induzida CG Cromatografia gasosa CG-MS-MS - cromatografia gasosa/espectrômetro de massa/massa LD 50 é a dose necessária de uma dada substância ou tipo de radiação para matar 50% de uma população em teste LQ - limite de quantificação MC material critico MRM monitoramento de reação múltipla PTFE Politetrafluoretileno (teflon) SE Solução estoque SI Solução intermediária 2.0 Fundamentos A determinação de CE na amostra de destilado de cana-de-açúcar é efetuada por injeção direta em um sistema de cromatografia gasosa acoplada a um espectrômetro de massa, que baseia na dissociação induzida por colisão (CID), na segunda célula de colisão (quadrupolo 2), do triplo quadrupolo. Impresso por: Adriana Eustáquia Pereira Marques Cópia não controlada Página 1/23
2 Neste método o padrão de CE é injetado no CG-MS-MS no modo MRM e identificado pelo tempo de retenção de 10,7 minutos, pelo perfil de fragmentação que deverá apresentar as transições para o íon quantificador e qualificador e a intensidade relativa dos íons diagnóstico (% pico quanlificador em relação ao quantificador) do CE de 49% com faixa aceitável de 37 a 61% para o padrão e a amostra. A confirmação é feita pela comparação dos espectros de massa do padrão e da amostra. Na amostra é adicionado um padrão interno. É preparada curva de calibração do analito que será utilizado para quantificar as amostras. A quantificação é feita pela interpolação em curva analítica e corrigida pelo percentual (%) de recuperação do padrão dos analitos. 2.1 Características do método Este método foi desenvolvido, validado e otimizado pelo LACQSA, com base no trabalho desenvolvido por LACHENMEIER et al (2005, 2006) e BRUNO(2006). Na validação foram determinadas as seguintes figuras de mérito: veracidade (em termos de recuperação, R%), obtidas por ensaios com amostras artificialmente contaminadas, linearidade, exatidão e precisão (em termos de desvio padrão relativo, DPr% e DPR%), limite de quantificação do método A validação do método foi orientada pelo POP/LACQSA/BH/011 Validação de métodos analíticos, pelo Manual de Garantia Analitica da CGAL/2011 e pelo plano de estudo 073 Determinação de carbamato de etila em cachaça e aguardente por cromatografia gasosa acoplada a espectrômetro de massa O perfil de fragmentação foi feito pela análise em fullscan de cada analito, seguido do estudo dos íons produtos e a definição das transições dos íons de quantificação e qualificação utilizados na elaboração do método em modo de monitoramento de reação múltipa (MRM) no triplo quadrupolo apresentados na Tabela 1. Tabela 1: Transições dos íons de quantificação, qualificação e tempo de retenção dos analitos. Analitos Quantificador Qualificador Tempo de retenção (min) Carbamato de etila ,7 Carbamato de etila deuterado ,5 A intensidade relativa do íon diagnóstico (% do pico qualificador em relação ao quantificador) foi calculada para Impresso por: Adriana Eustáquia Pereira Marques Cópia não controlada Página 2/23
3 o analito CE que permiti determinar a faixa aceitável para o CE, a qual está dentro dos critérios da CEE 657/2002, que está de acordo com a tolerância máxima permitida para a intensidade relativa dos íons utilizando várias técnicas de análises de espectrometria de massa (Tabela 2). Tabela 2: Características obtidas dos íons quantificadores e qualificadores. Analitos Quantificador Qualificador Intensidade relativa dos íons % Faixa aceitável (%) Carbamato de etila a 51 Carbamato de etila deuterado De acordo com CEE 657/ 2002 a razão sinal/ruído dos íons dos analitos devem ser 3:1 o que pode ser evidenciado quando se analisa o cromatograma de cada analito. No Plano de estudo 073 quando foram analisados os cromatogramas de carbamato de etila e carbamato de etila deuterado em sua menor concentração foi possível verificar que a razão sinal/ruído 3:1 dos picos eram atendidos. Os parâmetros de desempenho do método obtidos no processo de validação encontram-se descritos na Tabela 3 e Tabela 4. Tabela 3: Parâmetros de desempenho do método utilizando padrão interno carbamato de etila deuterado Parâmetros de Desempenho Critério/requisito Valor obtido Aprovação Veracidade na concentração do LQ (20 µg/l) Recuperação média: n= 6 Precisão Repetitividade Valores médios n=6 recuperação 80 a 110% CEE 657/2002 RSDr 10% 92% (18,4 µg/l) Sim Solução CE RSDr % 20 µg/l 50 µg/l 150 µg/l 400 µg/l 5,81 4,08 9,57 2,44 3,23 6,33 7,33 3,92 2,54 2,49 4,90 5,01 1,90 7,90 7,52 8,48 RSDr % Impresso por: Adriana Eustáquia Pereira Marques Cópia não controlada Página 3/23
4 1,47 Solução CE RSD R % Precisão (precisão intermediária) Valores médio n=6 RSD R 15% 20 µg/l 8,83 50 µg/l 6, µg/l 5, µg/l 7,52 Sim Parâmetros de Desempenho Critério/requisito Valor obtido Aprovação Horrat Precisão adequada por Horrat <1 Seletividade/especificidade Faixa ótima de trabalho Faixa da curva de calibração Teste t de Student com nível de probabilidade de 95% 20 µg/l 0, µg/l 0, µg/l 0, µg/l 0,004 Não há efeito matriz 20 a 400 µg/l 20, 50, 150, 300, 400, 600 µg/l Parâmetros de Desempenho Critério/requisito Valor obtido Aprovação Aplicabilidade IN/SDA número 13 de (matriz e faixa de concentração) Cachaça e aguardente de cana-de-açúcar Sim Limite de detecção* ( g/l) Cálculo matemático a partir da menor concentração da curva - 12,9 µg/l Sim uma previsão do limite superior Limite de quantificação* ( g/l) 20,0 µg/l Sim Incerteza de medição no LQ* ± 8,0 µg/l (40%) Sim Fonte: * de acordo com análise critica 067/2013 Reportagem de resultado. Para análise sem utilizar padrão interno carbamato de etila deuterado observou-se na validação o desempenho geral do método apresentado na tabela 4. Tabela 4: Parâmetros de desempenho do método sem utilizar padrão interno carbamato de etila deuterado Sim Sim Parâmetros de Desempenho Critério/requisito Valor obtido Aprovação Veracidade na concentração do LQ = 20 µg/l Recuperação média: n= 6 Precisão Repetitividade Valores médios n=6 Recuperação 80 a 110% CEE 657/2002 RSDr 10% 93% (18,5 µg/l) Sim Solução CE RSDr % 5,81 4,08 20 µg/l 9,67 9,94 3,23 6,64 50 µg/l 7,03 4,11 Sim Impresso por: Adriana Eustáquia Pereira Marques Cópia não controlada Página 4/23
5 150 µg/l 400 µg/l 2,54 2,49 4,63 5,01 1,88 7,9 7,52 8,47 1,47 Parâmetros de Desempenho Critério/requisito Valor obtido Aprovação Solução CE RSDR % 20 µg/l 8,73 Precisão (precisão intermediária) Valores médio n=6 Horrat Seletividade/especificidade Faixa ótima de trabalho Faixa da curva de calibração Aplicabilidade (matriz e faixa de concentração) Limite de detecção ( g/l) RSD R 15% Precisão adequada por Horrat <1 Teste t de Student com nível de significância de 95% 50 µg/l 6, µg/l 5, µg/l 7,52 20 µg/l 0, µg/l 0, µg/l 0, µg/l 0,004 Não há efeito matriz 20 a 400 µg/l 20, 50, 150, 300, 400, 600 µg/l IN/SDA número 13 de Cachaça e aguardente de cana-de-açúcar Cálculo matemático a partir da menor concentração da curva uma previsão do limite superior Sim Sim Sim Sim 13,0 µg/l Sim Limite de quantificação( g/l) 20,0 µg/l Sim Incerteza de medição no LQ* ± 8,0 µg/l (40%) Sim Fonte: * de acordo com análise critica 067/2013 Reportagem de resultado. 2.2 Aplicabilidade O método validado é aplicável à determinação do contaminante CE em cachaça e aguardente conforme os resultados obtidos na validação do método. Atende o limite máximo de CE de 150µg / L definido na normativa SDA Nº 13 (BRASIL, 2005) para o CE cachaça e aguardente de cana-de-açúcar. 3.0 Reagentes, padrões, materiais e insumos Impresso por: Adriana Eustáquia Pereira Marques Cópia não controlada Página 5/23
6 A especificação detalhada dos materiais, reagentes e solventes necessários para realização dos procedimentos descritos neste MET em particular os Materiais críticos (MC - cuja qualidade afeta o resultado analítico) encontram-se na planilha PLN/DLAB/PL/007 - V.4 Lista de Materiais de Consumo por Procedimento e a planilha com as peças de reposição do cromatógrafo gasoso Agilent com detector de massas triplo quadrupolo Agilent 7000A. Os reagentes, solventes e materiais necessários à análise deverão ser solicitados pelo preenchimento do formulário FOR/LACQSA/BH/021 Solicitação de material de consumo. As quantidades das soluções necessárias para as análises deverão ser verificadas. Vidrarias e outros materiais de uso na rotina necessário à análise deverão ser solicitados à Unidade de Preparo de Material pelo preenchimento do formulário FOR/LACQSA/BH/025 Solicitação de material ao preparo. Quando for identificada a necessidade da aquisição de materiais indisponíveis em estoque devem-se observar os procedimentos descritos no documento de suporte DS/LACQSA/BH/011 Aquisição de materiais de consumo para solicitação dos mesmos. Nota 1: As vidrarias descritas na PLN/DLAB/PL/007 acima referenciada apresentam especificações completas compatível com a vidraria desejável e em processo de aquisição. Por uma questão de disponibilidade e adequação, enquanto não se adquire o material desejado, as análises serão realizadas com as vidrarias disponíveis. 3.1 Vidrarias em geral - balão volumétrico calibrado nos volumes de 10, 50, 100 e 1000 ml (MC); - becker de 25, 50, 100, 600 e 1000 ml; - frascos reagente de vidro borossilicato, âmbar, capacidade de 250, 500 e 1000 mililitros; - frasco tipo vial de 15 e 100 ml com tampa de rosca e teflon para guardar amostras e padrões; - pipetas Pasteur - proveta de 100, 500 e 1000 ml de preferência calibrada. 3.2 Materiais de suporte Impresso por: Adriana Eustáquia Pereira Marques Cópia não controlada Página 6/23
7 - barrilhete de polipropileno, capacidade de 5 L; - bastão em vidro borossilicato; - bulbo de amostragem de borracha natural; - cuba para recolher materiais limpos e utilizados; - espátula em aço inoxidável; - gás Hélio Analítico (MC); - gás nitrogênio (MC); - papel alumínio; - papel toalha; - pissetas de 500 ml; - ponteiras descartáveis para pipetas automáticas com volumes de 20 a 100 µl, 200 a 1000 µl e 1 a 10 ml. 3.3 Materiais específicos para quantificação por CG-MS-MS - coluna capilar HP-INNOWAX (60 m x 0,25 mm x 0,25 um) (MC); - septo azul, PTFE/ silicone/ptfe vermelho silicone, com tampa de rosca; - frasco tipo vial de 2 ml. 3.4 Padrões Para assegurar que as medições feitas sejam rastreáveis ao Sistema Internacional de Unidades (SI), o laboratório deve utilizar material de referência certificado acompanhado de uma documentação emitida por um organismo com autoridade, a qual fornece um ou mais valores de propriedades especificadas com as incertezas e rastreabilidade associada, utilizando procedimentos válidos. Caso este produto não esteja disponível no mercado, o laboratório utilizará o de melhor qualidade disponível (padrão de trabalho, segundo o POP/DLAB/PL/001). - Carbamato de etila Padrão Analítico de Uretane, pureza: 99,0%(CG) - Carbamato de etila deuterado - Padrão Analítico de Uretane-D5, pureza: 99% (CP) Impresso por: Adriana Eustáquia Pereira Marques Cópia não controlada Página 7/23
8 3.5 Reagentes e solventes Os reagentes utilizados neste procedimento seguirão a IS/LACQSA/BH/002 Preparo e controle de lotes de insumos (reagentes, solventes e soluções) que descreve os procedimentos a serem adotados no preparo e controle de lotes de insumos e deverá ser preenchido o formulário FOR/LACQSA/BH/137 Controle de reagentes, solventes e soluções para análises de bebidas. - Água tipo 1 conforme a ISO 3696: Etanol pa., pureza mínina de 99,9 % 4.0 Equipamentos Utilizar os equipamentos observando: os procedimentos descritos em suas respectivas instruções de trabalho, o Plano de Equipamentos e o POP/LAQCSA/BH/002 Controle de Equipamentos considerando a adequação dos instrumentos aos requisitos e especificações necessárias a adequada execução deste procedimento. Verificar o desempenho e/ou calibração externa dos equipamentos, antes do início da análise. Para micropipetas e balanças proceder à verificação diária e registrar nos devidos formulários e planilhas. Utilizar, preferencialmente, equipamentos e materiais listados nesse MET, sendo que outros podem ser utilizados desde que sua aplicabilidade tenha sido comprovada e o seu uso devidamente registrado nas fichas de análise ou formulário. Utilizar, preferencialmente, vidrarias volumétricas, balanças e micropipetas calibradas. O desempenho do cromatógrafo gasoso acoplado ao espectrômetro de massa deve ser verificado utilizando o formulário FOR/LACQSA/BH/053 Verificação de desempenho do cromatógrafo gasosos acoplado ao detector de massas triplo quadrupolo (CG-QQQ) antes da análise ou uma vez por semana ou se o equipamento foi desligado. Também se deve verificar o número de injeções realizadas com o liner e o septo do auto - injetor que devem ser trocados após ± 250 injeções e se necessário a limpeza ou troca da seringa do auto injetor consultando a FOR/LACQSA/BH/118 Controle de injeções do cromatógrafo gasoso acoplado ao detector de massas Agilent (CG-QQQ). 4.1 Equipamentos críticos - balança analítica de precisão com ± 4 casas decimais calibrada e tolerância ± 0,00005; - cromatógrafo gasoso Agilent com detector de massas triplo quadrupolo Agilent 7000A qualificado; Impresso por: Adriana Eustáquia Pereira Marques Cópia não controlada Página 8/23
9 - geladeira temperaturas de 2 a 8 C; - micropipetas automática calibrada com capacidade de medição de 100 a 1000µL ou 200 a 1000µL, com menor divisão de escala de 2 µl; - micropipeta automática calibrada com capacidade de medição de 20 a 100µL ou 10 a 100µL com menor divisão de escala de 0,2 µl; - micropipetas automática calibrada com capacidade de medição de 1 a 10mL com menor divisão de escala de 20 µl Equipamentos de suporte - capela de exaustão; - purificador de água purelab option Q. marca Elga. 5.0 Precauções analíticas O CE é classificado pela Internation Agency for Research on Câncer (IARC) como possivelmente carcinogênico para o homem, da classe 2B. Sua toxicidade aguda é relativamente baixa, sendo a LD 50 na ordem 2,5 g/kg de peso corporal. O CE não é diretamente carcinogênico nem mutagênico, mas sua atuação pelo citocromo P-450, origina metabólitos tóxicos considerados como genotóxicos, mutagênicos e clastogênicos, especialmente na presença de ativação metabólica (IARC ). Para os procedimentos relacionados às condições ambientais e segurança consultar o POP/LACQSA/BH/003 Ambiente e segurança. Todo o procedimento analítico deve ser realizado em local apropriado, com precauções particulares como utilização de equipamentos de proteção individual (luvas, guarda-pó e sapatos fechados), evitando qualquer contato de solventes e reagentes com a pele e/ou os olhos. Utilizar vidraria limpa, livres de detergente e resíduos. Ao final da análise, o material utilizado deverá ser lavado conforme o IP/LACQSA/BH/OO1 Descontaminação e preparo de material. Impresso por: Adriana Eustáquia Pereira Marques Cópia não controlada Página 9/23
10 A manipulação de solventes e/ou reagentes utilizados nas análises deve ser realizada com cuidado, considerando a natureza de cada um e as informações contidas na FISPQ - ficha de segurança de produtos químicos. Consultar o POP/LACQSA/BH/004 Gerenciamento de resíduos e documentação associada. 6.0 Procedimentos O analista deve selecionar as amostras que serão analisadas, inclusive aquelas para fins de controle intralaboratorial em acordo com o responsável. Os procedimentos referentes ao controle intralaboratorial estabelecidos no POP/LACQSA/BH/009 Garantia da qualidade analítica devem ser realizados com amostras controles (AC) em ensaios cegos e não cegos. As amostras devem ser solicitadas à URPA pelo preenchimento da ficha FOR/LACQSA/BH 024 Comunicado e solicitação de amostras. Estas serão entregues acompanhadas das respectivas fichas de acompanhamento de amostras FOR/LACQSA/BH/061 Registro de amostra para análise físico-química de bebidas e FOR/LACQSA/BH/062 Reportagem de resultados analíticos de físico-química de bebidas. O formulário FOR/LACQSA/BH/039 Acompanhamento de análise de bebidas (Carbamato de etila e congêneres) deverá ser preenchido com os dados pertinentes. Caso sejam anexados registros da técnica de detecção ou folhas adicionais, estas deverão ser rubricadas e numeradas ao final da análise de forma que cada folha seja identificada com o número total de folhas e número da folha. Organizar as soluções e materiais utilizados na análise. Ao final da análise: Os resíduos de analise (sólidos e líquidos) devem ser coletados em recipientes adequados, devidamente identificados para coleta de resíduos e devem ser manipulados conforme POP/LACQSA/BH/004 - Gerenciamento de Resíduos. Coletar o material utilizado, separando os que serão lavados pelo próprio analista (materiais pequenos e ou frágeis) e encaminhar o restante para a Unidade de Preparo de Material (UPM). Organizar as soluções e materiais utilizados na análise. Impresso por: Adriana Eustáquia Pereira Marques Cópia não controlada Página 10/23
11 Manter a área de análise sempre limpa e organizada conforme determina o POP/LACQSA/BH Ambiente e Segurança. 6.1 Preparo de soluções Os reagentes e soluções utilizadas neste procedimento seguiram a IS/LACQSA/BH/002 Preparo e controle de lotes de insumos (reagentes, solventes e soluções) que descreve os procedimentos a serem adotados no preparo e controle de lotes de insumos e deverá ser preenchido o formulário FOR/LACQSA/BH/137 Controle de reagentes, solventes e soluções para análises de bebidas. Rotular as soluções preparadas utilizando etiqueta própria, preenchendo adequadamente o lote de origem dos insumos registrados no FOR/LACQSA/BH/006 Controle de lotes e insumos para análise, descrição da solução, lote e insumos utilizados, data de preparo, data de validade, responsável/preparo, utilização, temperatura de armazenamento. O preparo e as quantidades das soluções necessárias para a análise devem ser preparadas seguindo os procedimentos descritos neste MET, sendo que as soluções padrões de carbamato de etila devem ser feitas no dia da análise. Os volumes e massas propostos para preparo das soluções reagentes podem ser ajustados para atender as necessidades das análises respeitando as devidas proporções Preparo da solução de etanol a 40% (v/v) Medir em uma proveta 400 ml de etanol e em outra proveta 600 ml de água tipo 1. Transferir para um para um frasco com tampa de 1000 ml e homogeneizar a solução. Rotular a solução e armazenar em temperatura ambiente. Preencher o formulário FOR/LACQSA/BH/137 Controle de reagentes, solventes e soluções para análises de bebidas Preparo das soluções estoque (SE) de carbamato de etila (2000 mg/l) Impresso por: Adriana Eustáquia Pereira Marques Cópia não controlada Página 11/23
12 Em um balão volumétrico de 10 ml calibrado colocar ± 1 ml de solução de etanol a 40 %. Pesar 20 mg ± 0,05 mg do padrão CE. Completar o volume com solução de etanol a 40 %. Homogeneizar e transferir para um frasco, rotular a solução e armazenar em geladeira na temperatura de 2 a 8 C. Preencher o formulário FOR/LACQSA/BH/137 Controle de reagentes, solventes e soluções para análises de bebidas Preparo das soluções estoque de Carbamato de etila deuterado(1000 mg/l) Em um balão volumétrico calibrado de 100 ml colocar ± 10 ml de solução de etanol a 40%. Pesar 100 mg ± 0,05mg do padrão CED. Completar o volume com solução de etanol a 40%. Homogeneizar e transferir para um frasco âmbar, rotular a solução e armazenar em geladeira na temperatura de 2 a 8 C. Preencher o formulário FOR/LACQSA/BH/137 Controle de reagentes, solventes e soluções para análises de bebidas Preparo das soluções intermediária (SI) de carbamato de etila (10 mg/l) Em um balão volumétrico de 10 ml calibrado colocar ± 1 ml de solução de etanol a 40 % e adicionar 50 µl da solução estoque de carbamato de etila. Completar o volume com solução de etanol a 40 %. Homogeneizar e transferir para um frasco, rotular a solução e armazenar em geladeira na temperatura de 2 a 8 C. Preencher o formulário FOR/LACQSA/BH/137 Controle de reagentes, solventes e soluções para análises de bebidas Preparo da solução intermediária de carbamato de etila deuterado (10 mg/l) Em um balão volumétrico de 50 ml colocar ± 5 ml de solução de etanol a 40 % e adicionar 500 µl da solução estoque de carbamato de etila deuterado. Completar o volume com solução de etanol a 40 %. Homogeneizar e transferir para um vial de 50 ml, rotular a solução e armazenar em geladeira na temperatura de 2 a 8 C. Preencher o FOR/LACQSA/BH/137 Controle de reagentes, solventes e soluções para análises de bebidas e o FOR/LACQSA/BH/039 Acompanhamento de análises de bebidas (carbamato de etila e congêneres) Preparo da curva de calibração Impresso por: Adriana Eustáquia Pereira Marques Cópia não controlada Página 12/23
13 Os procedimentos utilizados no preparo das soluções para a curva de calibração de CE devem ser registrados no formulário o formulário FOR/LACQSA/BH/137 Controle de reagentes, solventes e soluções para análises de bebidas e no FOR/LACQSA/BH/039 Acompanhamento de análises de bebidas (carbamato de etila e congêneres), que deverá ser arquivada juntamente com as planilhas de resultado na pasta de acompanhamento de análise. A curva de calibração é preparada em 6 níveis de concentração de CE, sendo cada uma preparada em um balão volumétrico de 10 ml calibrado, numerado de 1 a 6 e registrada no FOR/LACQSA/BH/039 Acompanhamento de análises de bebidas (carbamato de etila e congêneres). Em cada balão volumétrico de 10 ml calibrado adicionar ± 1 ml da solução de etanol a 40 %. Colocar 50 µl da solução intermediária do padrão interno do carbamato de etila deuterado (10 mg/l) em cada balão volumétricos de 10 ml com auxílio de uma micropipeta calibrada, que corresponderá a concentração de 50 µg/l do padrão interno. Adicionar a solução intermediária do padrão de carbamato de etila (10 mg/l) em cada balão seguindo a Tabela 5, com auxílio de uma micropipeta calibrada. Tabela 5: Preparo da curva de calibração de carbamato de etila. Carbamato de etila Níveis da Curva de Calibração Concentração (µg/l) Volume SI (µl) Completar o volume de cada balão volumétrico com solução de etanol 40 %. Homogeneizar as soluções dos balões volumétricos e colocar cada solução da curva de calibração em 3 vials de 2 ml identificados. Os Impresso por: Adriana Eustáquia Pereira Marques Cópia não controlada Página 13/23
14 restantes das soluções da curva de calibração serão descartados no final da análise, seguindo o POP/LACQSA/BH/003 Ambiente e Segurança em recipientes adequados, devidamente identificados para coleta posterior. 6.2 Preparo dos controles analíticos Em cada batelada de análise será injetado 1 branco reagente, 1 branco de amostra e 3 brancos de amostra fortificadas em três níveis de concentração do analito carbamato de etila que serão utilizados para avaliar o processo de análise. - Preparar o branco reagente em um balão volumétrico calibrado de 10 ml identificado, adicionar ± 1 ml da solução de etanol a 40 % e com auxílio de uma micropipeta calibrada colocar 50 µl da solução intermediária do padrão interno do carbamato de etila deuterado (10 mg/l), que corresponderá a concentração de 50 µg/l. Completar o volume do balão volumétrico de 10 ml com solução de etanol 40% e homogeneizar. Em um vial identificado colocar ± 500 µl desta solução e fechá-lo com uma tampa com septo novo (não devem ser reutilizados os septos). - Preparar a amostra branco em um balão volumétrico calibrado de 10 ml identificado, adicionar ± 1 ml da amostra branco e com auxílio de uma micropipeta calibrada colocar 50 µl da solução intermediária do padrão interno do carbamato de etila deuterado (10 mg/l), que corresponderá a concentração de 50 µg/l. Completar o volume do balão volumétrico de 10 ml com a amostra branco e homogeneizar. Em um vial identificado colocar ± 500 µl desta solução e fechá-lo com uma tampa com septo novo (não devem ser reutilizados os septos). - Preparo das amostras fortificadas será realizado em 3 balões volumétrico de 10 ml calibrado identificados R1, R2 e R3. Colocar ± 1 ml da amostra branco e com auxílio de uma micropipeta calibradas adicionar 50 µl da solução intermediária de carbamato de etila deuterado (10 mg/l), que corresponderá a concentração de 50 µg/l do padrão interno, e as quantidades da solução intermediária de carbamato de etila (10 mg/l) em cada balão seguindo a Tabela 6. Tabela 6 - Concentração do padrão de carbamato de etila utilizados para preparo das amostras fortificadas. Amostras fortificadas Concentração (µg / L) Carbamato de etila Volume SI (µl) Impresso por: Adriana Eustáquia Pereira Marques Cópia não controlada Página 14/23
15 R R R Completar o volume de cada balão volumétrico com amostra branco. Homogeneizar os balões volumétricos e colocar cada amostra fortificada em vials de 2 ml identificados com uma tampa com septo novo (não devem ser reutilizados os septos). Nota 02: caso não tenha amostra branco para realizar a análise, o controle (amostra branco) será uma solução de etanol 40 % adicionada de 50 µl da solução intermediária de carbamato de etila deuterado (10 mg/l), que corresponderá a amostra fortificada. Nota 03: podem ser usadas outras concentrações para o preparo das amostras fortificadas, desde que estejam contemplados na faixa de trabalho. 6.3 Preparo das amostras As amostras são injetadas sem nenhum processo de extração, somente será adicionado o padrão interno carbamato de etila deuterado (10 mg/l). Em um balão volumétrico calibrado de 10 ml identificado, adicionar ± 1 ml da amostra e com auxílio de uma micropipeta calibrada colocar 50 µl da solução intermediária do padrão interno do carbamato de etila deuterado (10 mg/l), que corresponderá a concentração de 50 µg/l. Completar o volume do balão volumétrico de 10 ml com a amostra e homogeneizar. Em um vial identificado colocar ± 500 µl desta solução e fechá-lo com uma tampa com septo novo (não devem ser reutilizados os septos). 6.4 Injeção das amostras Antes de injetar a curva padrão de CE deve-se injetar o padrão CE de maior concentração da curva de calibração (600µg/L) por duas vezes. Avaliar o tempo de retenção, as características dos íons quantificador e qualificador de acordo com a Tabela 1 e a intensidade relativa do íon diagnóstico (% do pico qualificador em Impresso por: Adriana Eustáquia Pereira Marques Cópia não controlada Página 15/23
16 relação ao quantificador) se atende a faixa de aceitável de acordo com os critérios da CEE 657/2002 apresentado na Tabela 2 e registrar no formulário FOR/LACQSA/BH/044 Controle de injeção do padrão carbamato de etila. Injetar os padrões da curva de calibração, o branco reagente, o branco da amostra, as amostras fortificadas e as amostras no cromatógrafo gasoso acoplado ao espectrômetro de massa utilizando o método CE1.M com as seguintes condições: Injetor: Capacidade da seringa: 10 µl Volume de injeção: 2 µl Modo: split Razão:5:1 Temperatura do injetor: 230 o C Tabela 7: Lavagem e ambiente da seringa de injeção do auto injetor do CG-MS-MS Lavagem Pré injeção Pós injeção Volume (µl) Solvente (Etanol 40%) 6 8 Máximo Amostra 6-2 Ambiente da amostra Forno: Tempo de equilíbrio: 0,5 minutos Coluna: HP-INNOWAX (60 m x 250 µm x 0,25 µm) Gás de arraste: hélio 1,5 ml/min Tabela 8: Programação do forno do CG-MS-MS Taxa 0 o C / min Valor o C Tempo de espera min Tempo de corrida min Inicial ,00 Célula de colisão: Gás da célula de colisão: Nitrogênio 1,5 ml/min Hélio 2,25mL/min Impresso por: Adriana Eustáquia Pereira Marques Cópia não controlada Página 16/23
17 Linha de transferência (Transfer Line): Temperatura: 230 o C - Montar a sequência de injeção no CG de modo aleatório colocando os padrões da curva de calibração, o branco reagente, a amostra branca, as amostras fortificadas e as amostras a serem analisadas. 7.0 Resultados 7.1 Cálculos Calcular a concentração do CE nas amostras pela interpolação em curva analítica que será realizado utilizando a planilha PLN/LACQSA/BH/057 Resultado da determinação de carbamato de etila em bebidas destiladas de cana-de-açúcar, que permite a obtenção do resultado final corrigido pela recuperação e expressa o valor da incerteza expandida (U) (K=2) para esta medida, expressos em µg/l representada pela equação abaixo. C CE ( APCA a) b µg / L FCR CRI Equação 1 ACPA = área cromatográfica do pico da amostra a = intercepto da curva de calibração (µg/l); b = inclinação da curva de calibração (µg/l); FC R = fator de correção devido ao erro sistemático da recuperação FC R =1 e C RI = correção devido à reprodutibilidade interna do laboratório C RI =0; Utilizar a planilha PLN/LACQSA/BH/057 Resultado da determinação de carbamato de etila em bebidas destiladas de cana-de-açúcar para obter o resultado final de cada amostra e das amostras branco contaminadas. 7.2 Reportagem do resultado - Declarar se o resultado é corrigido ou não pela recuperação do controle. Impresso por: Adriana Eustáquia Pereira Marques Cópia não controlada Página 17/23
18 - Declarar os valores em porcentagem da recuperação obtida pelos controles. - Declarar a Incerteza expandida estimada com probabilidade de abrangência 95%. - Reportar o fator de abrangência K. A expressão do resultado e da incerteza de medição deve ser (y±u: Resultado ± Incerteza). Quando expressa em tabela ou Quadro a incerteza deve ser reportada sem o sinal ±. Sendo: y = resultado= mensurando e U= incerteza expandida com 95% de probabilidade de abrangência. Importante: y= corrigido pela recuperação quando aplicável y= corrigido pelo erro sistemático a princípio somente para procedimentos analíticos quando o erro sistemático impactar significativamente os resultados. A incerteza expandida de medição declarada é baseada em uma incerteza padrão multiplicada pelo fator de abrangência K, com uma probabilidade de abrangência de aproximadamente 95%. Podendo reportar também o K calculado pelas planilhas que sempre é calculado com uma probabilidade de abrangência de aproximadamente 95%. A incerteza é estimada pontualmente por amostra, respeitando a faixa de trabalho de cada método. Quando a concentração do analito exceder a faixa de trabalho a amostra deve ser diluída de forma que sua concentração fique dentro da faixa de trabalho validada pelo laboratório para cada um dos seus métodos. A incerteza é reportada na mesma unidade do mensurando (do analito) de acordo com a unidade da legislação vigente ou limite crítico estabelecido pelo Laboratório. A incerteza será reportada com dois (2) algarismos significativos, conforme o proposto pelo GUM, O número de algarismos significativos da incerteza poderá ser maior que dois para atender o valor e a unidade da legislação quando justificável. Impresso por: Adriana Eustáquia Pereira Marques Cópia não controlada Página 18/23
19 A unidade da reportagem de resultado poderá ser modificada, quando necessário ou quando o cliente assim exigir. Logo a unidade poderá ser modificada para continuar atendendo a premissa de a incerteza ser representada por dois (2) algarismos significativos. Os cálculos dos resultados analíticos e da incerteza de medição analítica, realizados na planilha PLN/LACQSA/BH/057 Resultado da determinação de carbamato de etila em bebidas destiladas de cana-deaçúcar serão efetuados considerando todos os algarismos significativos e não serão arredondados até a emissão do resultado final. Ao final, quando o resultado for reportado, será utilizada a mesma regra de arredondamento realizado pelo EXCEL. Os limites de detecção e quantificação serão representados nas mesmas condições descritas acima. Considerar como NQ (não quantificado) resultados inferiores ao limite de quantificação do método, conforme apresentado na Tabela 1 Parâmetros de desempenho do método. Os limites de quantificação e de detecção do método são respectivamente 20,0 g/kg e 13,0 g/kg. A amostra que apresentar resultado maior que o limite da legislação deve ser reanalisada para confirmação. Caso os resultados dêem diferentes (considerando a incerteza) repetir a análise. Nota 04: os resultados da recuperação servirão para alimentar a planilha PLN/LACQSA/BH/038 Carta controle para monitoramentoi físico-quimica de bebidas. Nota 05: também serão monitorados em carta controle os resultados das áreas do padrão interno carbamato de etila deuterado utilizados nas análises de rotina na planilha PLN/LACQSA/BH/038 Carta controle para monitoramentoi físico-quimica de bebidas. Reportar o resultado da análise caso os resultados obtidos dos controles analíticos estiverem dentro dos critérios de aceitabilidade do método estabelecidos durante a validação e da CEE 657/2002 Tabelas 3, 4, como as transições dos íons de quantificação e qualificação determinados, o tempo de retenção (Tabela 1) e a intensidade relativa do íon diagnóstico (% do pico qualificador em relação ao quantificador) Tabela 2. Impresso por: Adriana Eustáquia Pereira Marques Cópia não controlada Página 19/23
20 Se os resultados estiverem dentro dos critérios de aceitabilidade do método os resultados deverão ser registrados no FOR/LACQSA/BH/062 Reportagem de resultado analítico de físico-química de bebidas que deverá ter todos os campos não utilizados fechados e após verificação deverão ser encaminhados à URPA. 7.3 Eventualidades Desvios dos procedimentos estabelecidos neste MET somente devem ocorrer se esses desvios estiverem documentados, tecnicamente justificados e autorizados pelo Responsável e aceitos pelo cliente (conforme descrito na norma ABNT NBR ISO/IEC 17025: 2005, página 13, item 5.4.2). Em caso de trabalho de ensaio não conforme, registrar no FOR/LACQSA/BH/071 Controle de trabalho de ensaio não conforme (TNC), arquivar cópia em pasta específica na GTA e junto aos registros da análise em questão. Referenciar o registro do TNC no campo de observações do formulário de acompanhamento de análise FOR/LACQSA/BH 039 Acompanhamento de análises de bebidas (carbamato de etila e congêneres). 8.0 Responsabilidades As atribuições e responsabilidades estão definidas na DS/LACQSA/BH/001 Atribuições e Responsabilidades e na DS/LACQSA/BH/005 Descrição de Função. 9.0 Referências BRASIL. Instrução Normativa n o 31, de 29 de junho de Diário Oficial da União. Brasília, 30 de junho de BRUNO, S. N. F. Adequação dos processos de destilação e de troca iônica na redução dos teores de carbamato de etila em cachaças produzidas no estado do Rio de Janeiro. Tese de doutorado UFRJ CEE 657/2002 (CCα e CCβ). Decisão da Comissão de 12 de agosto de Jornal Oficial da União Européia, L221, pp 8-36, Etanol: Acesso outubro IARC ( Feb2007.pd Consumption- LACHENMEIER, D.W.; FRANK, W.; KUBALLA, T. Application of tandem mass spectrometry combined with gas chromatography to the routine analysis of ethyl carbamate in stone-fruit spirits. Rapid Communicantions in Mass Spectrometry.19, , LACHENMEIER, D.W.; NERLICH, U.; KUBALLA, T. Automated determination of ethyl carbamate in stone-fruit spirits using headspace solid-phase microextraction and gas chromatography-tandem mass spectrometry. J. Crhomatography A. 1108, , Impresso por: Adriana Eustáquia Pereira Marques Cópia não controlada Página 20/23
21 NIT-DICLA-030. Rastreabilidade metrológica ao sistema internacional de unidades na acreditação \de laboratórios e no reconhecimanto da conformidade aos princípios das BPL. revisão 04; página 1-5, jul Relatório do plano de estudo 073- Análise e carbamato de etila em cachaça. MAPA- LACQSA. 06/07/ Documentos referenciados IP/LACQSA/BH/001-Descontaminação e preparo de material IS/LACQSA/BH/002-Preparo e controle de lotes de insumos (reagentes, solventes e soluções) POP/DLAB/PL/001-Inventário e Especificação de Materiais de Consumo POP/LACQSA/BH/004-Gerenciamento de resíduos no laboratório POP/LACQSA/BH/009-Garantia da qualidade analítica POP/LACQSA/BH/011-Validação de métodos analíticos 11.0 Anexos referenciados DS/LACQSA/BH/001-Atribuições e responsabilidades DS/LACQSA/BH/005-Descrição de Função DS/LACQSA/BH/011-Aquisição de materiais de consumo FOR/LACQSA/BH/006-Controle de lotes de insumos para análise FOR/LACQSA/BH/021-Solicitação de material de consumo FOR/LACQSA/BH/024-Comunicado de recebimento e solicitação de amostras FOR/LACQSA/BH/025-Soliciação de material ao preparo FOR/LACQSA/BH/039-Acompanhamento de análises de bebidas (carbamato de etila e congêneres) FOR/LACQSA/BH/044-Controle de injeção do padrão carbamato de etila FOR/LACQSA/BH/053-Verificação de desempenho do cromatógrafo gasosos acoplado ao detector de massas triplo quadrupolo (CG-QQQ) FOR/LACQSA/BH/061-Registro de amostras para análises fisico-químicas de bebidas FOR/LACQSA/BH/062-Reportagem de resultados analíticos de físico-química de bebidas FOR/LACQSA/BH/071-Controle de trabalho de ensaio não conforme (TNC) FOR/LACQSA/BH/118-Controle de injeções do cromatógrafo gasoso acoplado ao detector de massas Agilent (CG-QQQ) FOR/LACQSA/BH/137-Controle de reagentes, solventes e soluções para análises físico-químicas de bebidas PLN/DLAB/PL/007-Lista de Materiais de Consumo por Procedimento PLN/LACQSA/BH/038-Carta controle para monitoramento físico-químico de bebidas PLN/LACQSA/BH/057-Resultado da determinação de carbamato de etila em bebidas destiladas de cana-de-açucar 12.0 Informações de registro Controle de injeções do cromatógrafo gasoso acoplado ao detector de massas Agilent (CG-QQQ) - FOR/LACQSA/BH/118 Acompanhamento de análises de bebidas (carbamatode etila + congêneres) - FOR/LACQSA/BH/039 Impresso por: Adriana Eustáquia Pereira Marques Cópia não controlada Página 21/23
22 Carta controle para monitoramento físico-química de bebidas - PLN/LACQSA/BH/038 Comunicado de recebimento e solicitação de amostras (FOR/LACQSA/BH/024) Controle de injeção do padrão de carbamato de etila - FOR/LACQSA/BH/044 Controle de lotes de insumos para análise (FOR/LACQSA/BH/006) Controle de reagentes, solventes e soluções para análises de bebidas - FOR/LACQSA/BH/137 Controle de trabalho de ensaio não conforme (TNC) (FOR/LACQSA/BH/071) Lista de Materiais de Consumo por Método de Ensaio/Procedimento Operacional Padrão/Instrução de Serviço/Instrução de Preparo/Instrumento de Medição/Plano de Estudo (PLN/DLAB/PL/007) Registro de amostra para análises físico-químicas de bebidas (FOR/LACQSA/BH/061) Reportagem de resultado analíticos de físico-química de bebidas - FOR/LACQSA/BH/062 Resultado da determinação de Carbamato de Etila em bebidas destiladas de cana-de-açúcar _ PLN/LACQSA/BH/057 Solicitação de material ao preparo (FOR/LACQSA/BH/025) Solicitação de material de consumo (FOR/LACQSA/BH/021) Verificação de desempenho do cromatógrafo gasosos acoplado ao detector de massas triplo quadrupolo (CG-QQQ)-FOR/LACQSA/BH/ Arquivos anexados 14.0 Controle de alterações Este MET foi elaborado a partir do POP 110, conforme o sistema de gestão da qualidade do LACQSA/BH vigente na época, com o seguinte histórico de revisão: Revisão Data Responsável Descrição Anelise L. D. Eugênia A. V Anelise L. D. Eugênia A. V. Elaboração do POP. - Alteração dos títulos dos itens 1, 2.1 e 2.2; - O item 3.1 Equipamentos foi dividido em Equipamentos críticos e Equipamentos de suporte; - O item 3.1 foi colocado a definição de material critico e atualizados equipamentos - O item 3.2 Materiais foi dividido em Vidrarias em geral, Materiais de suporte e Materiais específicos para quantificação por CG-MS-MS; - No item 3.2 foi colocado a definição de material critico e atualizados os matérias dos sub-itens Vidrarias em geral, Materiais de suporte e Materiais específicos para quantificação por CG-MS-MS; - No item alteração na redação do preparo da solução de etanol 40 %; - O item 4.4 Reagentes foi alterado o titulo para Reagentes e solventes; - Alteração do item 3.10 Reportagem de resultado incluindo decisões tomadas na análise critica 067/2013. Impresso por: Adriana Eustáquia Pereira Marques Cópia não controlada Página 22/23
23 Controle de alterações do MET/LACQSA/BH/012 Versão Data Responsável Descrição 00 13/02/2014 Anelise L. Drummond - Inserido no software Docnix módulo MaxDoc. Impresso por: Adriana Eustáquia Pereira Marques Cópia não controlada Página 23/23
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